一種達肝素鈉精品的生產方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種達肝素鈉的生產方法，本發(fā)明使用肝素鈉粗品為原料，通過降解、還原、乙醇沉淀得到低分子肝素鈉粗品，相對于需要使用肝素鈉精品為原料，方法適用范圍更廣，更可以從源頭控制達肝素鈉精品的質量。創(chuàng)新性的通過HPLC對層析前的低分子肝素鈉粗品的p測試其分子量及分布-根據公式計算出層析過程中濾液的收集，準確定量到符合要求的低分子肝素鈉精品液，避免了昂貴的分子量截流過濾膜的使用。再通過氧化、除菌過濾、沉淀脫水實現(xiàn)了“一鍋煮”的工藝，在操作上實現(xiàn)了簡化，節(jié)省了時間和人力成本，該工藝在現(xiàn)有的技術基礎上開發(fā)出了一條新的制備達肝素鈉原料的方法，且在本公司實現(xiàn)了達肝素鈉的工業(yè)化生產。
【專利說明】
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領域，特別是一種精品達肝素鈉的制備和純化工藝。 一種達肝素鈉精品的生產方法

【背景技術】
[0002] 肝素鈉 Ofeparin Sodium)是粘多糖硫酸酯類抗凝血藥。肝素鈉是由豬或牛的腸 粘膜中提取的硫酸氨基葡聚糖的鈉鹽，屬粘多糖類物質。在體內外均具有抗凝血作用，是目 前主流的抗凝血藥品。但是普通肝素鈉的生物利用度低，副作用大，后來人們發(fā)現(xiàn)肝素鈉裂 解獲取的硫酸氨基葡聚糖片段的鈉鹽，平均分子量為4000?6000道爾頓，稱為低分子肝素 鈉。低分子肝素鈉注射液和肝素鈉注射液一樣屬于抗凝血酶III (AT III)依賴性凝血酶抑制 齊U。但與肝素鈉注射液相比，具有半衰期較長、抗血栓效果好、出血傾向較弱、給藥方便，但 價格比較貴。而達肝素為其中一種。達肝素鈉注射液主要用于急性深靜脈血栓的治療，急 性腎功能衰竭或慢性腎功能不全者進行血液透析和血液過濾期間防止體外循環(huán)系統(tǒng)中發(fā) 生凝血，不穩(wěn)定型冠心病，如不穩(wěn)定型心絞痛和非Q-波型心肌梗塞，預防與手術有關的血 栓形成。是目前主流的抗血栓類藥物。
[0003] 目前已有3篇專利報道了達肝素鈉制備工藝，其中有2篇已授權。專利 CN101942038A通過將肝素鈉原料溶解在純化水和含有甲基的有機溶劑中，在一定溫度和 pH值條件下，加入亞硝酸鈉進行降解，后再在一定pH值條件下用氫氧化鈉進行還原，再用 乙醇沉淀，濾膜過濾，紫外線滅菌，過氧化氫氧化濾膜過濾，再用乙醇沉淀，將沉淀物冷凍干 燥或脫水真空干燥即得達肝素鈉成品。其中專利CN102558393A采用最傳統(tǒng)的達肝素鈉的 制備工藝，即先將肝素鈉溶于純化水中得到肝素鈉水溶液，鹽酸調節(jié)水溶液的pH值，后用 亞硝酸鈉降解肝素鈉，再用氫氧化鈉調節(jié)體系pH值，硼氫化鈉還原，后用乙醇沉淀得到還 原沉淀物，再對其用雙氧水氧化得到粗品達肝素鈉，再用超濾膜進行超濾后凍干得到精品 達肝素鈉成品。
[0004] 上述已授權的2篇專利基本思路是一致的，但均具有一定的缺點，專利 CN101942038A在制備過程中以精品肝素鈉為原料，難以從源頭控制肝素鈉的質量，并且增 加了制備達肝素鈉的成本。在制備過程中，加入了含有甲基的有機溶劑，致使在最終達肝 素鈉原料標準中需要控制有機溶劑殘留，增加檢測工作量和降低了產品的質量，和缺乏對 降解條件系統(tǒng)的、精密的控制，從而導致制備出來的低分子肝素純度不夠，分子量分布不集 中，雜質殘留過多的缺點，這些都是目前工藝所不能解決的。供給注射劑藥物的制備存在一 定缺點。專利CN102558393A在上述那專利CN101942038A的基礎上進行了一定的簡化，首 先取消了含有甲基的有機溶劑的使用，減少了純化水的用量，減少了過濾和紫外除菌的操 作步驟和過氧化氫氧化后得過濾，直接用分子量截流濾膜過濾，得到達肝素鈉精品。此專利 同樣以精品肝素鈉為原料，這樣在生產上原料的獲取受到一定的限制，且增加了成本，同時 難以從源頭控制整個達肝素鈉的生產工藝和產品質量。同時使用了昂貴的分子量截流過濾 膜，分子量截流過濾膜使用頻繁，增加了工藝化生產的成本。


【發(fā)明內容】

[0005] 針對上述現(xiàn)有技術中存在的不足，本發(fā)明提供了一種達肝素鈉精品的生產方法， 該方法使用肝素鈉粗品為原料即可得到質量較好的達肝素鈉精品并取得較高的收率，實現(xiàn) 了達肝素鈉低成本、高效率的工業(yè)化生產。
[0006] 本發(fā)明提供的一種制備達肝素鈉原料的工藝，其包括如下步驟：
[0007] (1)低分子肝素鈉粗品的制備
[0008] 取肝素鈉粗品加入純化水溶解。調節(jié)溶液pH至2. 6-2. 8,加入亞硝酸鈉，保持溫 度在15-25°C攪拌20min，再調節(jié)溶液pH至9. 5-10. 0,加入硼氫化鈉攪拌彡15h，鹽酸調 節(jié)溶液pH至3. 4-3. 6攪拌20min。氫氧化鈉調節(jié)溶液pH7. 0-7. 5, 254nm紫外燈光照射降 解液20-25min，加入乙醇沉淀，靜置8h以上，沉淀后的固體再脫水后放入真空干燥箱中， 60-65°C干燥40-48h，得到低分子肝素鈉粗品。
[0009] (2)低分子肝素鈉精品制備（凝膠柱層析）
[0010] 將上述低分子肝素鈉粗品用2%氯化鈉溶液溶解后加入層析柱內，以2%氯化鈉 溶液勻速洗拓，接收溶液，測定每一杯的紫外0D200光吸收值，根據數值繪出圖譜。借助 HPLC測試的分子量及分布數據，確定需通過凝膠層析除去的大、小分子百分比數，通過公式 計算出相對應的需除去的大、小分子面積及相對應體積。收集需要的溶液部分并調節(jié)pH至 7. 0-7. 5,乙醇沉淀靜置彡8h，脫水后的濕固體60-65°C真空干燥18-24h。
[0011] ⑶混合溶解
[0012] 將分批層析出的低分子肝素鈉精品合并，測試其分子量及分布，如果小分子部分 有偏差，可調節(jié)溶液PH7. 0-7. 5,加入乙醇沉淀對小分子片段進行調節(jié)，使其達到符合要求。 將分子量及分布合格的低分子肝素鈉精品加入13#氧化罐內，加入純化水和氯化鈉，攪拌 溶解。
[0013] (4)雙氧水氧化
[0014] 調節(jié)上述13#氧化罐內溶液ρΗ10· 5-11.0,加入30%過氧化氫氧化彡4-5h。結束 后調節(jié)pH7. 9-8. 1，加入無水亞硫酸鈉攪拌30min后過濾，得到達肝素鈉粗品溶液。
[0015] (5)除菌過濾
[0016] 調節(jié)達肝素鈉粗品溶液ρΗ5· 6-5. 8,將(λ 45 μ m和(λ 2 μ m濾膜串連，(λ 45 μ m端口 和13#氧化罐出口相連，打開反應罐出口閥門，使罐內液體依次通過0. 45 μ m和0. 2 μ m過 濾膜，除菌過濾后的達肝素鈉溶液收集在潔凈沉淀罐中。
[0017] (6)達肝素鈉精品的制備
[0018] 過濾后的達肝素鈉溶液加入乙醇沉淀靜置> 8h以上。后過濾并用乙醇脫水、離心 機脫水真空干燥得到精品達肝素鈉。
[0019] 在步驟⑴中肝素鈉粗品和純化水投料比（W/V)為1. 0 :8. 5-10,優(yōu)選為1. 0 : 9. 2-9. 5。肝素鈉粗品和亞硝酸鈉的投料比（W/W)為100 :1. 5-2. 5,優(yōu)選為100 :1. 5-2. 0。 亞硝酸鈉和硼氫化鈉的投料比（W/W)為1. 0 :0. 3-0. 5,優(yōu)選為1. 0 :0. 35-0. 42。亞硝酸鈉反 應時體系溫度維持在15-30°C，4mol/L鹽酸調節(jié)pH2. 6-2. 8,通過用淀粉-碘化鉀試紙測試 溶液確定反應結束，5mol/L氫氧化鈉調節(jié)溶液pH至9. 0-10. 5。254nm紫外燈置于降解后的 溶液中進行滅菌，加入溶液體積和乙醇體積（V/V)為1. 0 :0. 65-0. 75,優(yōu)選0. 65-0. 70來沉 淀。沉淀出的低分子肝素鈉粗品在生產上需要再用乙醇脫水三次，第一次用的乙醇和投料 的肝素鈉粗品的比（V/W)為3. 0-5. 0 :1. 0,優(yōu)選為3. 5-4. 0 :1. 0,第二次和第三次用的乙醇 為前一次用量的50%，每次脫水間隔2h以上，并對得到的低分子肝素鈉樣品進行分子量及 分布測試。
[0020] 在步驟（2)中需要用2%氯化鈉溶液平衡層析柱l_2h，流速約為一個柱床體積/2 小時。用2%的氯化鈉溶液溶解步驟（1)得到的低分子肝素鈉粗品，使最終溶液體積和低分 子肝素鈉粗品重量（V/W)為7. 0-8. 5 :1. 0,優(yōu)選為7. 5-8. 0 :1. 0。上述溶液通過恒流泵加入 層析柱內，在加樣過程中保證凝膠界面的平整。加完樣品后，用2%氯化鈉溶液勻速洗拓凝 膠柱，通過前面粗品的HPLC分子量及分布測試結果并通過下面公式計算出相對應的需除 去的大、小分子面積及相對應體積。
[0021] A.設除去的大分子部分面積的百分比為X%

【權利要求】
1. 一種達肝素鈉精品的生產方法，其特征在于包括如下步驟： (1) 肝素鈉粗品用純化水溶解，調節(jié)溶液pH至2. 6-2. 8,加入亞硝酸鈉攪拌20min后調 節(jié)溶液pH至9. 5-10. 0,得到降解液，向降解液中加入硼氫化鈉攪拌> 15h，調節(jié)溶液pH至 3. 4-3. 6攪拌20min，紫外燈照射降解液，調節(jié)溶液pH至7. 0-7. 5后用乙醇沉淀脫水，真空 干燥得到低分子肝素鈉粗品；所述肝素鈉粗品和純化水投料比（W/V)為1. 0 :8. 5-10 ;所述 肝素鈉粗品和亞硝酸鈉的投料比（W/W)為100 :1. 5-2. 5 ;所述亞硝酸鈉和硼氫化鈉的投料 比（W/W)為 1. 0 :〇· 3-0. 5 ; (2) 將上述低分子肝素鈉粗品用2%氯化鈉溶液溶解后加入層析柱內，以2%氯化鈉溶 液勻速洗拓，HPLC檢測分子量及分布，通過公式計算除去的大、小分子百分比數及相對應體 積，收集符合要求的洗拓液并調節(jié)pH至7. 0-7. 5,乙醇沉淀脫水，真空干燥得到低分子肝素 納精品； (3) 將分次層析出的低分子肝素鈉精品合并，測試其分子量及分布，如果小分子部分 有偏差，可調節(jié)溶液pH至7. 0-7. 5,加入乙醇沉淀對小分子片段進行調節(jié)，使其達到符合要 求，把合格的低分子肝素鈉精品加到13#氧化罐內中，加入純化水和氯化鈉，攪拌溶解； (4) 調節(jié)低分子肝素鈉精品溶液pH至10. 5-11. 0,加入30%過氧化氫氧化彡4-5h，后 調節(jié)pH至7. 9-8. 1，加入無水亞硫酸鈉，攪拌30min過濾得到達肝素鈉粗品溶液； (5) 調節(jié)達肝素鈉粗品溶液pH5. 6-5. 8,使其通過0. 45 μ m和0. 2 μ m濾膜除菌，除菌過 濾后的達肝素鈉溶液收集在潔凈沉淀罐中； (6) 除菌后的達肝素鈉溶液用乙醇沉淀、脫水、真空干燥得到精品達肝素鈉。
2. 根據權利要求1所述的達肝素鈉精品的生產方法，其特征在于，步驟（1)中肝素鈉粗 品和純化水投料比（W/V)為1. 0 :9. 2-9. 5 ;肝素鈉粗品和亞硝酸鈉的投料比（W/W)為100 : 1. 5-2. 0 ;亞硝酸鈉和硼氫化鈉的投料比（W/W)為1. 0 :0. 35-0. 42 ;亞硝酸鈉反應時體系溫 度維持在 15-30°C，ρΗ2· 6-2. 8。
3. 根據權利要求1所述的達肝素鈉精品的生產方法，其特征在于，步驟（1)中通過 用淀粉-碘化鉀試紙測試溶液來確定反應是否結束，調節(jié)體系pH的溶液為：4mol/L鹽 酸，5mol/L氫氧化鈉；紫外燈照射波長為254nm，加入溶液體積和乙醇體積之比（V/V)為 1. 0:0. 65-0. 75,沉淀出的低分子肝素粗品在生產上需要再用乙醇脫水三次，第一次用的乙 醇和投料的肝素鈉粗品的比（V/W)為3. 0-5. 0 :1. 0,第二次和第三次用的乙醇為前一次用 量的50%，每次脫水間隔2h以上。
4. 根據權利要求1所述的達肝素鈉精品的生產方法，其特征在于，步驟（2)用2%的 氯化鈉溶液溶解步驟（1)得到的低分子肝素鈉粗品，使最終溶液體積和低分子肝素鈉粗品 重量（V/W)為7. 0-8. 5 :1. 0,再用2 %氯化鈉溶液洗拓洗拓層析柱，流速約為一個柱床體積 /2小時，對層析后的洗拓液通過HPLC測試其分子量及分布，再根據公式計算出相對應的 需除去的大、小分子面積及相對應的體積，收集的中間洗拓液用其2倍體積的乙醇來沉淀， 沉淀物再用乙醇來脫水三次，第一次用的乙醇和投料的低分子肝素鈉粗品的比（V/W)為 3. 0-5. 0 :1. 0,第二次和第三次用的乙醇為前一次用量的50%,每次脫水間隔2h以上。
5. 根據權利要求1所述的達肝素鈉精品的生產方法，其特征在于步驟（3)中如果合并 后的低分子肝素鈉精品HPLC檢測分子量及分布顯示小分子部分（〈3000)不滿足< 13.0% 的要求，可將合并的低分子肝素鈉精品再純化一遍，將其溶解在純化水中，低分子肝素鈉精 品和純化水投料比（W/V)為1. 0 :8. 5-10,調節(jié)pH7. 0-7. 5,再用2倍體積的乙醇來沉淀， 沉淀物再用乙醇來脫水三次，第一次用的乙醇和投料的低分子肝素鈉精品的比（V/W)為 3. 0-5.0 :1. 0,第二次和第三次用的乙醇為前一次用量的50%，每次脫水間隔2h以上，把 合格的低分子肝素鈉精品加到13#氧化罐內中，低分子肝素鈉精品和純化水之比（W/V)為 1. 0 :8· 5-10,氯化鈉和純化水之比（W/V)為0· 8-1. 5 :100。
6. 根據權利要求1所述的達肝素鈉精品的生產方法，其特征在于步驟（4)中將上述 步驟（3)中的溶液用氫氧化鈉調節(jié)pH至10. 5-11. 0,30%過氧化氫和溶液之比（V/V)為 0· 25-0. 45 :100,無水亞硫酸鈉和過氧化氫（W/V)為0· 20-0. 30 :1· 0。
7. 根據權利要求1所述的達肝素鈉精品的生產方法，其特征在于步驟（5)中需要做 0. 2 μ m和0. 45 μ m濾膜完整性試驗，以確保生產中使用的濾膜能夠滿足除菌過濾要求。
8. 根據權利要求1所述的達肝素鈉精品的生產方法，其特征在于步驟￠)中過濾后的 達肝素鈉溶液用2. 0倍體積的乙醇沉淀，沉淀出的達肝素精品用乙醇脫水三次，第一次用 的乙醇和投料的低分子肝素鈉精品的比（V/W)為3. 0-5. 0:1.0,第二次和第三次用的乙醇 為前一次用量的50%，每次脫水間隔2h以上。
【文檔編號】C08B37/10GK104098716SQ201410339467
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2014年7月16日 優(yōu)先權日:2014年7月16日
【發(fā)明者】唐詠群, 黃錫偉, 段艷冰, 婁媛媛, 劉玉輝 申請人:南京健友生化制藥股份有限公司