恰瑪古多糖提取物及制備方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及恰瑪古提取【技術(shù)領(lǐng)域】，是一種恰瑪古多糖提取物及制備方法；該恰瑪古多糖提取物，按下述制備方法得到：第一步，取適量原料恰瑪古切成恰瑪古薄片，恰瑪古薄片經(jīng)真空干燥后得到恰瑪古干片，然后將恰瑪古干片粉碎成恰瑪古干粉。本發(fā)明恰瑪古多糖提取物中多糖的平均質(zhì)量百分含量較現(xiàn)有恰瑪古多糖提取物中多糖的平均質(zhì)量百分含量有很大提高，且本發(fā)明中使用加熱純凈水回流提取，說(shuō)明本發(fā)明恰瑪古多糖提取物中多糖的得率高，能耗低，從而降低了生產(chǎn)成本，提高了提取效率，更能滿(mǎn)足現(xiàn)有工業(yè)化生產(chǎn)的要求。
【專(zhuān)利說(shuō)明】恰瑪古多糖提取物及制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及恰瑪古提取【技術(shù)領(lǐng)域】，是一種恰瑪古多糖提取物及制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]從植物中提取的多糖類(lèi)化合物，具有多種生物學(xué)活性，來(lái)源廣泛，且毒副作用小、質(zhì)量容易控制等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)廣泛被作為人體免疫調(diào)節(jié)劑，如蟲(chóng)草多糖、枸杞多糖、螺旋藻多糖、女貞子多糖等的作用已得到臨床廣泛驗(yàn)證，植物多糖已成為當(dāng)今藥物和功能性食品功效成分研究發(fā)展的新方向。
[0003]新疆地處歐亞大陸腹地，其特殊的地理環(huán)境和氣候條件孕育了許多獨(dú)特的植物資源，其中許多珍稀的藥用植物資源在國(guó)內(nèi)僅分布于新疆，許多地方藥材品種在成分和功效上也與內(nèi)地品種不同。恰瑪古，學(xué)名為蕪菁(Ara1S1Sica L.),為十字花科蕓薹屬植物，維吾爾語(yǔ)稱(chēng)為“恰瑪古”，在全疆各地均有栽培，以肉質(zhì)根為食用和藥用的主要部分，是一種“藥食兩用”植物。
[0004]《中國(guó)中草藥大全》、《本草綱目》、《維吾爾藥志》、《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)-維吾爾藥分冊(cè)》等藥典對(duì)恰瑪古的植物來(lái)源、藥材性狀(包括塊根、葉、花和子)、化學(xué)成分、藥理作用、功能主治、配方加工等都有詳細(xì)記載。其中《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)-維吾爾藥分冊(cè)》中稱(chēng):“恰瑪古子，益腎助陽(yáng)，健胃消食，散氣利尿，用于性欲減退，咳喘氣短，腰酸肢軟，小便不利，面色無(wú)華”。明代醫(yī)藥學(xué)家李時(shí)珍在《本草綱目》中記載:“恰瑪古，苦、溫、無(wú)毒，主治 腫毒、乳癰寒熱、急性黃疸，腹結(jié)不通等癥”?，F(xiàn)代的《中國(guó)醫(yī)學(xué)大辭典》稱(chēng):“恰瑪古，無(wú)毒、治癆虛、通中、益氣、利五臟、治熱毒風(fēng)腫、解酒毒”。由此可見(jiàn)，恰瑪古具有多種的治療和保健功能。
[0005]現(xiàn)有常用恰瑪古的多糖類(lèi)化合物提取分離方法見(jiàn)(拜年等.新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2010,33 (11)，1310-1311，)《苯酚-硫酸法測(cè)定恰麻古兒中多糖的含量》中使用石油醚脫月旨、乙醇及沸水回流提取恰瑪古中的多糖類(lèi)化合物，但這種方法存在能耗高、得率低，不能滿(mǎn)足現(xiàn)有工業(yè)化生產(chǎn)的要求。
[0006]
【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明提供了一種恰瑪古多糖提取物及制備方法，克服了上述現(xiàn)有技術(shù)之不足，其能有效解決現(xiàn)有從恰瑪古中提取多糖類(lèi)化合物能耗高、得率低，不能滿(mǎn)足現(xiàn)有工業(yè)化生產(chǎn)要求的問(wèn)題。
[0008]本發(fā)明的技術(shù)方案之一是通過(guò)以下措施來(lái)實(shí)現(xiàn)的:一種恰瑪古多糖提取物，按下述方法得到:第一步，取適量原料恰瑪古切成恰瑪古薄片，恰瑪古薄片經(jīng)真空干燥后得到恰瑪古干片，然后將恰瑪古干片粉碎成恰瑪古干粉；第二步，按I克恰瑪古干粉中加入10毫升至30毫升的純凈水計(jì)，向恰瑪古干粉中加入純凈水回流提取2次至5次，每次回流提取的溫度為80°C至100°C、每次回流提取的時(shí)間為0.5h至2.5h，每次回流提取后過(guò)濾得到濾液，合并濾液得到混合濾液，將混合濾液在水浴中濃縮至濃度為0.lg/ml至0.4g/ml的濃縮液；第三步，在濃縮液中加入1.5倍至18倍濃縮液體積的乙醇水溶液并混合均勻，乙醇水溶液的體積百分比濃度為60%至90%，在溫度為1°C至8°C下醇沉4h至20h，然后在離心機(jī)中離心10分鐘至15分鐘得到沉淀，沉淀經(jīng)真空干燥后得到干燥粉末；第四步，在干燥粉末中加入純凈水配置成濃度為0.lmg/ml至5mg/ml的多糖儲(chǔ)備液，在多糖儲(chǔ)備液中加入1/4倍至I倍多糖儲(chǔ)備液體積的sevag試劑，在搖床中振搖I次至4次，每次振搖2分鐘至8分鐘，振搖后靜置10分鐘至20分鐘取上清液，上清液經(jīng)水浴干燥0.5h至4h后，再真空干燥至質(zhì)量百分含水量小于12.0%，得到恰瑪古多糖提取物。
[0009]下面是對(duì)上述發(fā)明技術(shù)方案之一的進(jìn)一步優(yōu)化或/和改進(jìn):
上述恰瑪古干片中的質(zhì)量百分含水量小于等于12.0% ;或/和，干燥粉末中的質(zhì)量百分含水量小于等于12.0%。
[0010]上述第二步和第四步中的水浴溫度為60°C至100°C ;或/和，第一步、第三步和第四步中的真空干燥溫度為40°C至60°C，真空干燥的壓力為-0.09Mpa至-0.06Mpa。
[0011]上述sevag試劑為三氯甲烷和正丁醇按體積比為1:1至4:1混勻后得到；或/和，離心機(jī)的轉(zhuǎn)速為3000r/min至5000r/min ;或/和，恰瑪古干粉的粒徑為100目至10目；或/和，搖床的振搖頻率是IOOrpm至400rpm。
[0012]上述原料恰瑪古為完整無(wú)病蟲(chóng)害的恰瑪古，在原料恰瑪古切片前先進(jìn)行清洗；恰瑪古薄片的厚度為0.3厘米至0.8厘米。
[0013]本發(fā)明的技術(shù)方案之二是通過(guò)以下措施來(lái)實(shí)現(xiàn)的:一種恰瑪古多糖提取物的制備方法，第一步，取適量原料恰瑪古切成恰瑪古薄片，恰瑪古薄片經(jīng)真空干燥后得到恰瑪古干片，然后將恰瑪古干片粉碎成恰瑪古干粉；第二步，按I克恰瑪古干粉中加入10毫升至30毫升的純凈水計(jì)，向恰瑪古干粉中加入純凈水回流提取2次至5次，每次回流提取的溫度為80°C至100°C、每次回流提取的時(shí)間為0.5h至2.5h，每次回流提取后過(guò)濾得到濾液，合并濾液得到混合濾液，將混合濾液在水浴中濃縮至濃度為0.lg/ml至0.4g/ml的濃縮液；第三步，在濃縮液中加入1.5倍至18倍濃縮液體積的乙醇水溶液并混合均勻，乙醇水溶液的體積百分比濃度為60%至90%，在溫度為1°C至8°C下醇沉4h至20h，然后在離心機(jī)中離心10分鐘至15分鐘得到沉淀，沉淀經(jīng)真空干燥后得到干燥粉末；第四步，在干燥粉末中加入純凈水配置成濃度為0.lmg/ml至5mg/ml的多糖儲(chǔ)備液，在多糖儲(chǔ)備液中加入1/4倍至I倍多糖儲(chǔ)備液體積的sevag試劑,在搖床中振搖I次至4次,每次振搖2分鐘至8分鐘,振搖后靜置10分鐘至20分鐘取上清液，上清液經(jīng)水浴干燥0.5h至4h后，再真空干燥至質(zhì)量百分含水量小于12.0%，得到恰瑪古多糖提取物。
[0014]下面是對(duì)上述發(fā)明技術(shù)方案之二的進(jìn)一步優(yōu)化或/和改進(jìn):
上述恰瑪古干片中的質(zhì)量百分含水量小于等于12.0% ;或/和，干燥粉末中的質(zhì)量百分含水量小于等于12.0%。
[0015]上述第二步和第四步中的水浴溫度為60°C至100°C ;或/和，第一步、第三步和第四步中的真空干燥溫度為40°C至60°C，真空干燥的壓力為-0.09Mpa至-0.06Mpa。
[0016]上述sevag試劑為三氯甲烷和正丁醇按體積比為1:1至4:1混勻后得到；或/和，離心機(jī)的轉(zhuǎn)速為3000r/min至5000r/min ;或/和，恰瑪古干粉的粒徑為100目至10目；或/和，搖床的振搖頻率是IOOrpm至400rpm。[0017]上述原料恰瑪古為完整無(wú)病蟲(chóng)害的恰瑪古，在原料恰瑪古切片前先進(jìn)行清洗；恰瑪古薄片的厚度為0.3厘米至0.8厘米。
[0018]本發(fā)明恰瑪古多糖提取物中多糖的平均質(zhì)量百分含量較現(xiàn)有恰瑪古多糖提取物中多糖的平均質(zhì)量百分含量有很大提高，且本發(fā)明中使用加熱純凈水回流提取，說(shuō)明本發(fā)明恰瑪古多糖提取物中多糖的得率高，能耗低，從而降低了生產(chǎn)成本，提高了提取效率，更能滿(mǎn)足現(xiàn)有工業(yè)化生產(chǎn)的要求。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0019]附圖1為本發(fā)明中液料比對(duì)多糖含量的影響曲線圖。
[0020]附圖2為本發(fā)明中提取時(shí)間對(duì)多糖含量的影響曲線圖。
[0021]附圖3為本發(fā)明中提取次數(shù)對(duì)多糖含量的影響曲線圖。
[0022]附圖4為本發(fā)明中醇沉中乙醇水溶液的濃度對(duì)綜合評(píng)分的影響曲線圖。
[0023]附圖5為本發(fā)明中醇沉?xí)r間對(duì)綜合評(píng)分的的影響曲線圖。
[0024]附圖6為本發(fā)明中濃縮液濃度對(duì)綜合評(píng)分的影響曲線圖。
[0025]附圖7為本發(fā)明中多糖儲(chǔ)備液與試劑體積比對(duì)除蛋白影響曲線圖。
[0026]附圖8為本發(fā)明中三氯甲烷與正丁醇體積比對(duì)除蛋白影響曲線圖。 [0027]附圖9為本發(fā)明中振搖時(shí)間對(duì)除蛋白影響曲線圖。
[0028]附圖10為本發(fā)明中除蛋白次數(shù)對(duì)除蛋白影響曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0029]本發(fā)明不受下述實(shí)施例的限制，可根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案與實(shí)際情況來(lái)確定具體的實(shí)施方式。下面提到的乙醇水溶液的濃度都為體積百分比濃度；純凈水用量按I克恰瑪古干粉中加入的純凈水量，純凈水量的單位為毫升。
[0030]實(shí)施例1，該恰瑪古多糖提取物，按下述制備方法得到:第一步，取適量原料恰瑪古切成恰瑪古薄片，恰瑪古薄片經(jīng)真空干燥后得到恰瑪古干片，然后將恰瑪古干片粉碎成恰瑪古干粉；第二步，按I克恰瑪古干粉中加入10毫升至30毫升的純凈水計(jì)，向恰瑪古干粉中加入純凈水回流提取2次至5次，每次回流提取的溫度為80°C至100°C、每次回流提取的時(shí)間為0.5h至2.5h，每次回流提取后過(guò)濾得到濾液，合并濾液得到混合濾液，將混合濾液在水浴中濃縮至濃度為0.lg/ml至0.4g/ml的濃縮液；第三步，在濃縮液中加入1.5倍至18倍濃縮液體積的乙醇水溶液并混合均勻，乙醇水溶液的體積百分比濃度為60%至90%，在溫度為1°C至8°C下醇沉4h至20h，然后在離心機(jī)中離心10分鐘至15分鐘得到沉淀，沉淀經(jīng)真空干燥后得到干燥粉末；第四步，在干燥粉末中加入純凈水配置成濃度為0.lmg/ml至5mg/ml的多糖儲(chǔ)備液,在多糖儲(chǔ)備液中加入1/4倍至I倍多糖儲(chǔ)備液體積的sevag試劑，在搖床中振搖I次至4次，每次振搖2分鐘至8分鐘，振搖后靜置10分鐘至20分鐘取上清液，上清液經(jīng)水浴干燥0.5h至4h后，再真空干燥至質(zhì)量百分含水量小于12.0%，得到恰瑪古多糖提取物。
[0031]實(shí)施例2，該恰瑪古多糖提取物，按下述制備方法得到:第一步，取適量原料恰瑪古切成恰瑪古薄片，恰瑪古薄片經(jīng)真空干燥后得到恰瑪古干片，然后將恰瑪古干片粉碎成恰瑪古干粉；第二步，按I克恰瑪古干粉中加入10毫升或30毫升的純凈水計(jì)，向恰瑪古干粉中加入純凈水回流提取2次或5次，每次回流提取的溫度為80°C或100°C、每次回流提取的時(shí)間為0.5h或2.5h，每次回流提取后過(guò)濾得到濾液，合并濾液得到混合濾液，將混合濾液在水浴中濃縮至濃度為0.lg/ml或0.4g/ml的濃縮液；第三步，在濃縮液中加入1.5倍或18倍濃縮液體積的乙醇水溶液并混合均勻，乙醇水溶液的體積百分比濃度為60%或90%，在溫度為1°C或8°C下醇沉4h或20h，然后在離心機(jī)中離心10分鐘或15分鐘得到沉淀，沉淀經(jīng)真空干燥后得到干燥粉末；第四步，在干燥粉末中加入純凈水配置成濃度為0.lmg/ml或5mg/ml的多糖儲(chǔ)備液,在多糖儲(chǔ)備液中加入1/4倍或I倍多糖儲(chǔ)備液體積的sevag試劑，在搖床中振搖I次或4次，每次振搖2分鐘或8分鐘，振搖后靜置10分鐘或20分鐘取上清液，上清液經(jīng)水浴干燥0.5h或4h后，再真空干燥至質(zhì)量百分含水量小于12.0%，得到恰瑪古多糖提取物。在第二步中，每次回流提取后過(guò)濾得到藥渣和濾液，然后在藥渣中按I克恰瑪古干粉中加入10毫升或30毫升的純凈水計(jì)向藥渣中加入純凈水進(jìn)行下次回流提取。
[0032]實(shí)施例3，作為上述實(shí)施例的優(yōu)化，實(shí)施例3中恰瑪古干片中的質(zhì)量百分含水量小于等于12.0% ;或/和，干燥粉末中的質(zhì)量百分含水量小于等于12.0%。
[0033]實(shí)施例4，作為上述實(shí)施例的優(yōu)化，實(shí)施例4的第二步和第四步中的水浴溫度為60°C至100°C ;或/和，第一步、第三步和第四步中的真空干燥溫度為40°C至60°C，真空干燥的壓力為-0.09Mpa至-0.06Mpa。
[0034]實(shí)施例5，作為上述實(shí)施例的優(yōu)化，實(shí)施例5中sevag試劑為三氯甲烷和正丁醇按體積比為1:1至4:1混勻后得至Ij ;或/和，離心機(jī)的轉(zhuǎn)速為3000r/min至5000r/min ;或/和，恰瑪古干粉的粒徑為100目至10目；或/和,搖床的振搖頻率是IOOrpm至400rpm。
[0035]實(shí)施例6，作為上述實(shí)施例的優(yōu)化，實(shí)施例6中原料恰瑪古為完整無(wú)病蟲(chóng)害的恰瑪古，在原料恰瑪古切片前先進(jìn)行清洗；恰瑪古薄片的厚度為0.3厘米至0.8厘米。
[0036]本發(fā)明上述實(shí)施例中各工藝參數(shù)的優(yōu)選按如下步驟確定:
一、多糖提取(多糖提取中多糖吸光度的測(cè)定根據(jù)苯酚-硫酸法進(jìn)行測(cè)定)
1.液料比考察
表1為液料比(純凈水和恰瑪古干粉之比，即純凈水用量(毫升/克)的平均單因素考察表，按表1中的水平因素進(jìn)行多糖的提取，然后測(cè)定多糖吸光度。
[0037]液料比考察平均單因素試驗(yàn)結(jié)果:從圖1可看出，不同的液料比對(duì)本發(fā)明上述實(shí)施例得到的恰瑪古多糖提取物中多糖的含量有一定的影響，從10:1到20:1這一段來(lái)看隨著提取純凈水用量的增加，多糖含量增加，但當(dāng)液料比大于20:1時(shí)，多糖含量隨著提取純凈水用量的增加而減小，故最佳提取的液料比為20:1。
[0038]2.提取時(shí)間考察
表2為提取時(shí)間的平均單因素考察表，按表2中的水平因素進(jìn)行多糖的提取，然后測(cè)定多糖吸光度。
[0039]提取時(shí)間考察平均單因素試驗(yàn)結(jié)果:多糖溶解于提取介質(zhì)中需要一定的時(shí)間，時(shí)間過(guò)短，多糖溶解不充分，多糖含量不高。從圖2中可看出，提取時(shí)間在小于1.5h時(shí)，本發(fā)明上述實(shí)施例得到的恰瑪古多糖提取物中多糖含量隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增加；提取時(shí)間在超過(guò)1.5h后，本發(fā)明上述實(shí)施例得到的恰瑪古多糖提取物中多糖含量隨時(shí)間的延長(zhǎng)而減?。痪C合考慮提取時(shí)間對(duì)多糖結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的影響；實(shí)際提取時(shí)間控制在1.5h較為合適。
[0040]3.提取次數(shù)考察表3為提取次數(shù)的平均單因素考察表，按表3中的水平因素進(jìn)行多糖的提取，然后測(cè)定多糖吸光度。
[0041]提取次數(shù)考察平均單因素試驗(yàn)結(jié)果:原料恰瑪古中多糖含量較高，一次性提取不可能將所有水溶性多糖均提取出來(lái)，提取次數(shù)過(guò)少，會(huì)造成多糖損失，原料浪費(fèi)，進(jìn)而增加成本，而提取次數(shù)過(guò)多會(huì)導(dǎo)致提取液體積過(guò)大，增加濃縮步驟的負(fù)擔(dān)，因此選擇合適的提取次數(shù)，對(duì)合理利用恰瑪古資源尤為重要。
[0042]從圖3中可看出，當(dāng)提取次數(shù)低于3次時(shí)，本發(fā)明上述實(shí)施例得到的恰瑪古多糖提取物中多糖含量隨著提取次數(shù)的增加上升較快，但3次以后，本發(fā)明上述實(shí)施例得到的恰瑪古多糖提取物中多糖含量上升緩慢，故提取次數(shù)控制在3次為宜。
[0043]4.正交試驗(yàn)
在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取液料比、提取時(shí)間和提取次數(shù)3項(xiàng)作為考察因素，每個(gè)因素各取3個(gè)水平，進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)L9(34)(表4)。以多糖含量為指標(biāo)，確定最優(yōu)提取工藝條件，并對(duì)最優(yōu)條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。
[0044]正交試驗(yàn)結(jié)果:經(jīng)過(guò)正交試驗(yàn)及方差分析得出，3個(gè)因素對(duì)本發(fā)明上述實(shí)施例得到的恰瑪古多糖提取物中多糖含量的影響大小依次為C>B>A，即提取次數(shù)〉提取時(shí)間〉液料t匕，最佳提取工藝為A3B3C3，即液料比(V/W)為25: 1、提取時(shí)間為2h、提取次數(shù)為3次。結(jié)果見(jiàn)表5和表6。
[0045]5.優(yōu)化工藝的驗(yàn)證
正交試驗(yàn)和單因素試驗(yàn)最 佳提取工藝不一樣，因此進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)，表7為正交驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果、表8單因素驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果，根據(jù)單因素試驗(yàn)分析得出的提取工藝進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，多糖含量平均為44.15%，依據(jù)正交試驗(yàn)分析所得出的提取工藝，進(jìn)行了 3次重復(fù)試驗(yàn)，多糖含量平均為50.09%，其結(jié)果高于前面試驗(yàn)提取得到的多糖含量，表明此優(yōu)化工藝可行。
[0046]6.討論與結(jié)論
正交試驗(yàn)表明，在加熱回流提取本發(fā)明上述實(shí)施例得到的恰瑪古多糖提取物的工藝中，提取次數(shù)是影響多糖提取率的最關(guān)鍵因素，然后依次是提取時(shí)間和液料比。試驗(yàn)得出，本發(fā)明上述實(shí)施例得到的恰瑪古多糖提取物的最佳工藝條件為液料比(V/W)為25: 1、提取時(shí)間為2h、提取次數(shù)為3次。在最佳條件下，本發(fā)明上述實(shí)施例得到的恰瑪古多糖提取物中多糖含量平均為50.09%,表明該提取方法穩(wěn)定可行。
[0047]二、多糖醇沉(多糖醇沉中多糖吸光度的測(cè)定根據(jù)苯酚-硫酸法進(jìn)行測(cè)定)
1.單因素試驗(yàn)
精密吸取濃縮液10ml，共四份，分別選取對(duì)多糖醇沉有重要影響的因素:乙醇體積百分比濃度:60%、70%、80%、90% ;醇沉?xí)r間:4h、8h、14h、20h ;濃縮液濃度:0.4g/ml、0.3g/ml、
0.2g/ml、0.lg/ml進(jìn)行試驗(yàn),5000r/min離心15min,將沉淀置于恒重過(guò)(連續(xù)兩次稱(chēng)重差異不超過(guò)5mg)的蒸發(fā)皿中蒸干，恒重(連續(xù)兩次稱(chēng)重差異不超過(guò)5mg)，精密稱(chēng)重。研磨成粉末并取0.1g加純凈水至100mL容量瓶中定容，然后測(cè)定其多糖吸光度得到多糖含量，算其綜合評(píng)分。
[0048]按照綜合評(píng)分=(標(biāo)志性成分/最大標(biāo)志含量)*30+ (浸出物量/最大浸出物量)*70,進(jìn)行篩選。
[0049]1.1醇沉中乙醇水溶液的濃度對(duì)多糖醇沉的影響濃縮液濃度為0.4g/ml，醇沉?xí)r間為8h，考察醇沉中乙醇水溶液的濃度對(duì)多糖醇沉的影響。測(cè)定多糖吸光度，算其綜合評(píng)分。
[0050]醇沉中乙醇水溶液的濃度考察單因素試驗(yàn)結(jié)果:從圖4中可以看出隨著醇沉中乙醇水溶液的濃度的增加，所得干燥粉末綜合評(píng)分增加，故采取最佳醇沉的乙醇水溶液的體積百分比濃度為90%。
[0051]1.2醇沉?xí)r間對(duì)多糖醇沉的影響
濃縮液濃度為0.4g/ml，醇沉的乙醇水溶液的體積百分比濃度為80%，考察醇沉?xí)r間對(duì)多糖醇沉的影響；然后測(cè)定多糖吸光度，算其綜合評(píng)分。
[0052]醇沉?xí)r間考察單因素試驗(yàn)結(jié)果:從圖5中可以看出隨著醇沉?xí)r間的增加多糖綜合評(píng)分增加的并不明顯，在8h綜合評(píng)分最高，故采取最佳的醇沉?xí)r間為8h。
[0053]1.3濃縮液濃度對(duì)多糖醇沉的影響
醇沉的乙醇水溶液的體積百分比濃度為80%，醇沉?xí)r間為8h，考察濃縮液濃度對(duì)多糖醇沉的影響。測(cè)定多糖吸光度，算其綜合評(píng)分。
[0054]濃縮液濃度考察單因素試驗(yàn)結(jié)果:從圖6中可以看出濃縮液濃度越大，綜合評(píng)分也高，因此最佳提取濃縮液濃度為0.4g/ml。
[0055]2.多糖醇沉正交試驗(yàn)
參考單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取醇沉的乙醇水溶液濃度、濃縮液濃度、醇沉?xí)r間3項(xiàng)作為考察因素，每個(gè)因素各取3個(gè)水平，進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)L9(34)(表9)。以綜合評(píng)分為指標(biāo)，確定本發(fā)明上述實(shí)施例得到的恰瑪古多糖提取物的最優(yōu)醇沉工藝條件，并對(duì)最優(yōu)條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。
[0056]多糖醇沉正交試驗(yàn)結(jié)果:經(jīng)過(guò)正交試驗(yàn)及方差分析得出，3個(gè)因素對(duì)恰瑪古多糖含量的影響大小依次為B>A>C，即醇沉中乙醇水溶液的濃度 > 濃縮液濃度 > 醇沉?xí)r間，最佳提取工藝為A1B3C2,即濃縮液濃度為0.4g/ml、醇沉中乙醇水溶液的濃度為90%、醇沉?xí)r間8h。結(jié)果見(jiàn)表10正交試驗(yàn)表和表11方差分析表。
[0057]由表10和表11可知最佳實(shí)驗(yàn)方案為A1B3C2即濃縮液濃度為0.4g/ml,乙醇水溶液的濃度為90%，醇沉?xí)r間為8小時(shí)。根據(jù)直觀分析及方差分析可知，三個(gè)因素中只有濃縮液濃度和醇沉中乙醇水溶液的濃度對(duì)綜合評(píng)分影響顯著，而醇沉?xí)r間因素則可以在三水平中選擇更節(jié)能、更節(jié)省時(shí)間的水平，所以醇沉?xí)r間也可以選擇4h。
[0058]3.醇沉驗(yàn)證試驗(yàn)
由正交試驗(yàn)表分析出最優(yōu)條件為A1B3C2,正交表中沒(méi)有此條件，需做驗(yàn)證試驗(yàn)(表12)，依據(jù)正交試驗(yàn)分析所得出的提取工藝綜合評(píng)分的平均值為98.1795，其結(jié)果高于前面試驗(yàn)提取得到的綜合評(píng)分，表明此工藝可行。
[0059]4.結(jié)論
在多糖的醇沉過(guò)程中，濃縮液濃度和乙醇水溶液濃度是影響多糖醇沉的2個(gè)關(guān)鍵因素。提取液中由于多糖起始濃度較低，沉淀多糖前一般都需要進(jìn)行濃縮處理。隨著濃縮過(guò)程的進(jìn)行，濃縮比的增大，溶液黏度變大，使得后續(xù)的醇沉分離難度加大，導(dǎo)致多糖得率降低，因此濃縮比不宜過(guò)大。
[0060]三.多糖除蛋白(多糖除蛋白中蛋白質(zhì)吸光度的測(cè)定根據(jù)中華人民共和國(guó)藥典2010版二部附錄VII蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法第五法考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行測(cè)定；多糖除蛋白中多糖吸光度的測(cè)定根據(jù)苯酚-硫酸法進(jìn)行測(cè)定)
1.除蛋白單因素試驗(yàn)
精密稱(chēng)取干燥粉末0.5g，加入純凈水配制成250ml多糖儲(chǔ)備液，低溫保存，待用。每次精密移取多糖儲(chǔ)備液20ml，加入不同體積的sevag試劑、不同的振搖時(shí)間及除蛋白次數(shù)，取上清液，測(cè)多糖吸光度以及蛋白質(zhì)吸光度。
[0061]蛋白去除率(％) =(脫蛋白前蛋白含量一脫蛋白后蛋白含量)/脫蛋白前蛋白含量 XlOO
多糖損失率(％)=(脫蛋白前多糖含量一脫蛋白后多糖含量)/脫蛋白前多糖含量 XlOO
根據(jù)以上2個(gè)指標(biāo)考察單因素最佳條件。
[0062]1.1多糖儲(chǔ)備液與試劑體積比對(duì)除蛋白的影響
三氯甲烷:正丁醇(V/V)=4:l、振蕩時(shí)間6min、除蛋白次數(shù)I次，考察多糖儲(chǔ)備液與sevag試劑體積比。測(cè)定多糖吸光度以及蛋白質(zhì)吸光度。
[0063]多糖儲(chǔ)備液與sevag試劑體積比考察單因素試驗(yàn)結(jié)果:由圖7可知，當(dāng)多糖儲(chǔ)備液與sevag試劑體積比為2:1時(shí)，多糖吸光度為0.5855，蛋白的吸光度為0.2697，低于其他體積比的蛋白吸光度，蛋白去除率最高，綜合考慮，選取多糖儲(chǔ)備液與sevag試劑體積比為2:1。
[0064]1.2三氯甲烷與正丁醇體積比對(duì)除蛋白的影響
多糖儲(chǔ)備液與sevag試劑(V/V)2:l、振蕩時(shí)間6min、除蛋白次數(shù)I次,考察三氯甲燒與正丁醇體積比。然后測(cè)定多糖吸光度以及蛋白質(zhì)吸光度。
[0065]三氯甲烷與正丁醇體積比考察單因素試驗(yàn)結(jié)果:由圖8可知，當(dāng)三氯甲烷與正丁醇體積比為3:1時(shí)，多糖的吸光度為0.5806，相對(duì)較低，但蛋白吸光度為0.2765，低于其他體積比的蛋白吸光度，即蛋白去除率最聞。綜合考慮，二氣甲燒與正丁醇的最優(yōu)體積比為3:1。
[0066]1.3振搖時(shí)間對(duì)除蛋白的影響
多糖儲(chǔ)備液=Sevag試劑(V/V)2:l、三氯甲烷:正丁醇(V/V)3:l、除蛋白次數(shù)I次，考察振蕩時(shí)間；然后測(cè)定多糖吸光度以及蛋白質(zhì)吸光度。
[0067]振搖時(shí)間考察單因素試驗(yàn)結(jié)果:由圖9知，當(dāng)振蕩時(shí)間為4 min時(shí)，多糖的吸光度為0.5848，蛋白吸光度為0.3035，低于其他振蕩時(shí)間的蛋白吸光度，即蛋白去除率最高，綜合考慮，選取振蕩時(shí)間為4min。
[0068]I.4除蛋白次數(shù)對(duì)除蛋白的影響
多糖儲(chǔ)備液:sevag試劑(V/V)2:l、三氯甲烷:正丁醇(V/V)3:l、振蕩時(shí)間4min，考察除蛋白次數(shù)；然后測(cè)定多糖吸光度以及蛋白質(zhì)吸光度。
[0069]除蛋白次數(shù)考察單因素試驗(yàn)結(jié)果:由圖10可知，當(dāng)除蛋白次數(shù)為4次時(shí)，多糖的平均吸光度為0.4638，蛋白的平均吸光度為0.2369，蛋白的吸光度最低，即蛋白去除率最高，但是考慮到試劑用量大且有毒性，所以選取3次為最佳試驗(yàn)條件。
[0070]2.除蛋白正交試驗(yàn)
參考單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取多糖儲(chǔ)備液與試劑體積比、三氯甲烷與正丁醇體積比、振搖時(shí)間和除蛋白次數(shù)4項(xiàng)作為考察因素，每個(gè)因素各取3個(gè)水平，進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)L9(34)(表13)。以蛋白去除率為指標(biāo)，確定本發(fā)明上述實(shí)施例得到的恰瑪古多糖提取物的最優(yōu)除蛋白工藝條件，并對(duì)最優(yōu)條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。
[0071]正交試驗(yàn)結(jié)果:經(jīng)過(guò)正交試驗(yàn)及方差分析得出，4個(gè)因素對(duì)蛋白質(zhì)含量的影響大小依次為A>D>C>B，即多糖儲(chǔ)備液與試劑體積比 > 除蛋白次數(shù)〉振搖時(shí)間〉三氯甲烷與正丁醇體積比，最佳提取工藝為A1B1C3 D3,即多糖儲(chǔ)備液與試劑體積比為1: 1、三氯甲烷與正丁醇體積為2: 1、振搖時(shí)間為6min、除蛋白次數(shù)為3次。試驗(yàn)中，隨著除蛋白次數(shù)的增加，蛋白的去除率在增加，但多糖的損失也在增加。結(jié)果見(jiàn)表14和表15。
[0072]3.除蛋白驗(yàn)證試驗(yàn)
由上圖可知最優(yōu)條件為A1B1C3D3，正交表中沒(méi)有此條件，需做驗(yàn)證試驗(yàn)(表16)。依據(jù)正交試驗(yàn)分析所得出的醇沉工藝，蛋白去除率為74.6886%，其結(jié)果高于正交試驗(yàn)中的蛋白去除率，表明此工藝可行。
[0073]4.結(jié)論
sevag法使蛋白質(zhì)乳化,能夠達(dá)到除蛋白純化多糖的目的，而且sevag法除蛋白對(duì)多糖的損失小，該試驗(yàn)的結(jié)論對(duì)大批量多糖除蛋白有一定的指導(dǎo)意義，可作為多糖除蛋白質(zhì)的參考依據(jù)。
[0074]根據(jù)上述實(shí)施例得到的恰瑪古多糖提取物中多糖的平均質(zhì)量百分含量為10.36%至12.67%，且使用加熱純凈水回流提?。欢F(xiàn)有從恰瑪古中提取多糖的方法中，都是用石油醚脫脂、乙醇及沸水回流進(jìn)行提取，提取物中多糖的平均質(zhì)量百分含量為10.18%，經(jīng)對(duì)比:本發(fā)明恰瑪古多糖提取物中多糖的平均質(zhì)量百分含量較現(xiàn)有恰瑪古多糖提取物中多糖的平均質(zhì)量百分含量有很 大提高，而現(xiàn)有從恰瑪古中提取多糖的方法中使用石油醚脫脂、乙醇及沸水回流進(jìn)行提取的成本較本發(fā)明中采用加熱純凈水回流提取的成本高，因此說(shuō)明本發(fā)明恰瑪古多糖提取物中多糖的得率高，能耗低，從而降低了生產(chǎn)成本，提高了提取效率，更能滿(mǎn)足現(xiàn)有工業(yè)化生產(chǎn)的要求。
[0075]以上技術(shù)特征構(gòu)成了本發(fā)明的實(shí)施例，其具有較強(qiáng)的適應(yīng)性和實(shí)施效果，可根據(jù)實(shí)際需要增減非必要的技術(shù)特征，來(lái)滿(mǎn)足不同情況的需求。
【權(quán)利要求】
1.一種恰瑪古多糖提取物，其特征在于按下述方法得到:第一步，取適量原料恰瑪古切成恰瑪古薄片，恰瑪古薄片經(jīng)真空干燥后得到恰瑪古干片，然后將恰瑪古干片粉碎成恰瑪古干粉；第二步，按I克恰瑪古干粉中加入10毫升至30毫升的純凈水計(jì)，向恰瑪古干粉中加入純凈水回流提取2次至5次，每次回流提取的溫度為80°C至100°C、每次回流提取的時(shí)間為0.5h至2.5h，每次回流提取后過(guò)濾得到濾液，合并濾液得到混合濾液，將混合濾液在水浴中濃縮至濃度為0.lg/ml至0.4g/ml的濃縮液；第三步，在濃縮液中加入1.5倍至18倍濃縮液體積的乙醇水溶液并混合均勻，乙醇水溶液的體積百分比濃度為60%至90%，在溫度為1°C至8°C下醇沉4h至20h，然后在離心機(jī)中離心10分鐘至15分鐘得到沉淀，沉淀經(jīng)真空干燥后得到干燥粉末；第四步，在干燥粉末中加入純凈水配置成濃度為0.lmg/ml至5mg/ml的多糖儲(chǔ)備液,在多糖儲(chǔ)備液中加入1/4倍至I倍多糖儲(chǔ)備液體積的sevag試劑，在搖床中振搖I次至4次，每次振搖2分鐘至8分鐘，振搖后靜置10分鐘至20分鐘取上清液，上清液經(jīng)水浴干燥0.5h至4h后，再真空干燥至質(zhì)量百分含水量小于12.0%，得到恰瑪古多糖提取物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的恰瑪古多糖提取物，其特征在于恰瑪古干片中的質(zhì)量百分含水量小于等于12.0% ;或/和，干燥粉末中的質(zhì)量百分含水量小于等于12.0%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的恰瑪古多糖提取物，其特征在于第二步和第四步中的水浴溫度為60°C至100°C;或/和，第一步、第三步和第四步中的真空干燥溫度為400C至60°C，真空干燥的壓力為-0.09Mpa至-0.06Mpa。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的恰瑪古多糖提取物，其特征在于sevag試劑為三氯甲烷和正丁醇按體積比為1:1至4:1混勻后得到；或/和，離心機(jī)的轉(zhuǎn)速為3000r/min至5000r/min ;或/和，恰瑪 古干粉的粒徑為100目至10目；或/和，搖床的振搖頻率是IOOrpm至 400rpm。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3或4所述的恰瑪古多糖提取物，其特征在于原料恰瑪古為完整無(wú)病蟲(chóng)害的恰瑪古，在原料恰瑪古切片前先進(jìn)行清洗；恰瑪古薄片的厚度為0.3厘米至0.8厘米。
6.一種恰瑪古多糖提取物的制備方法，其特征在于按下述方法進(jìn)行:第一步，取適量原料恰瑪古切成恰瑪古薄片，恰瑪古薄片經(jīng)真空干燥后得到恰瑪古干片，然后將恰瑪古干片粉碎成恰瑪古干粉；第二步，按I克恰瑪古干粉中加入10毫升至30毫升的純凈水計(jì)，向恰瑪古干粉中加入純凈水回流提取2次至5次，每次回流提取的溫度為80°C至100°C、每次回流提取的時(shí)間為0.5h至2.5h，每次回流提取后過(guò)濾得到濾液，合并濾液得到混合濾液，將混合濾液在水浴中濃縮至濃度為0.lg/ml至0.4g/ml的濃縮液；第三步，在濃縮液中加入1.5倍至18倍濃縮液體積的乙醇水溶液并混合均勻，乙醇水溶液的體積百分比濃度為60%至90%，在溫度為1°C至8°C下醇沉4h至20h，然后在離心機(jī)中離心10分鐘至15分鐘得到沉淀，沉淀經(jīng)真空干燥后得到干燥粉末；第四步，在干燥粉末中加入純凈水配置成濃度為0.lmg/ml至5mg/ml的多糖儲(chǔ)備液,在多糖儲(chǔ)備液中加入1/4倍至I倍多糖儲(chǔ)備液體積的sevag試劑，在搖床中振搖I次至4次，每次振搖2分鐘至8分鐘，振搖后靜置10分鐘至20分鐘取上清液，上清液經(jīng)水浴干燥0.5h至4h后，再真空干燥至質(zhì)量百分含水量小于12.0%，得到恰瑪古多糖提取物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的恰瑪古多糖提取物的制備方法，其特征在于恰瑪古干片中的質(zhì)量百分含水量小于等于12.0% ;或/和，干燥粉末中的質(zhì)量百分含水量小于等于12.0%。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的恰瑪古多糖提取物的制備方法，其特征在于第二步和第四步中的水浴溫度為60°C至100°C ;或/和，第一步、第三步和第四步中的真空干燥溫度為40°C至60°C，真空干燥的壓力為-0.09Mpa至-0.06Mpa。
9.根據(jù)權(quán)利要求6或7或8所述的恰瑪古多糖提取物的制備方法，其特征在于sevag試劑為三氯甲烷和正丁醇按體積比為1:1至4:1混勻后得到；或/和，離心機(jī)的轉(zhuǎn)速為3000r/min至5000r/min ;或/和，恰瑪古干粉的粒徑為100目至10目；或/和，搖床的振搖頻率是IOOrpm 至 400rpm。
10.根據(jù)權(quán)利要求6或7或8或9所述的恰瑪古多糖提取物的制備方法，其特征在于原料恰瑪古為完整無(wú) 病蟲(chóng)害的恰瑪古，在原料恰瑪古切片前先進(jìn)行清洗；恰瑪古薄片的厚度為0.3厘米至0.8厘米。
【文檔編號(hào)】C08B37/00GK104017100SQ201410266707
【公開(kāi)日】2014年9月3日 申請(qǐng)日期:2014年6月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月16日
【發(fā)明者】安熙強(qiáng), 張濤, 趙婷婷, 向陽(yáng), 向小東, 程江南, 胡旭, 張娟 申請(qǐng)人:新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所, 柯坪縣圣泉實(shí)業(yè)有限公司