本發(fā)明屬于分子生物學和免疫學領域，食品及飼料中狐貍源DNA的PCR核酸擴增，及側(cè)向流免疫膠體金試紙條試劑盒的制備和應用方法。

背景技術：
為防止牛海綿狀腦病(bovinespongiformencephalopathy,BSE)經(jīng)添加在動物飼料中的牛肉、牛骨傳播，1994年歐盟和1997年美國分別在1994年和1997年制定禁止在反芻動物的飼料中添加反芻動物源性蛋白的法規(guī)，2000年歐盟將這項禁令擴大到禁止向用于食用的動物飼喂加工過的哺乳動物、鳥類和魚類蛋白成分。我國農(nóng)業(yè)部于2004年頒布的《動物源性飼料產(chǎn)品安全衛(wèi)生管理辦法》中規(guī)定禁止在反芻動物飼料中使用動物源性飼料產(chǎn)品(乳及乳制品除外)，但在動物飼料中人為摻入反芻動物（主要是牛、羊）肉和骨制品的現(xiàn)象時有發(fā)生。近年來，國內(nèi)外食品市場上假羊肉、假牛肉等以假亂真現(xiàn)象層出不窮，動物源性食品摻雜摻假等各種食品安全事件的頻發(fā)越來越讓老百姓心驚膽顫。2013年初，歐洲的“馬肉風波”愈演愈烈，使得消費者“聞馬色變”。之后歐美的”魚肉風波”又再一次拉響了食品安全的警鐘。要保證食品及飼料的安全，需要靈敏、便捷、準確的檢測方法提供基礎。傳統(tǒng)的食品及飼料中動物性成分鑒定主要通過顯微鏡檢、基于蛋白質(zhì)檢測的免疫學方法以及基于核酸檢測的各類PCR方法，近年還發(fā)展了近紅外檢測法(NIRS)。食品及飼料成分中摻入的各種動物源成分在高溫處理和加工過程中易于受到破壞，不同種屬動物的蛋白質(zhì)序列之間差異不大，難以區(qū)別，發(fā)明專利“SDS-PAGE法鑒別肉及肉制品中動物源性成份”（公開號：CN102213720A）提供了一種以蛋白質(zhì)的SDS-PAGE電泳方式鑒定豬、牛、羊、鵝、魚的動物蛋白的方法，但不同來源和處理方式的蛋白電泳譜帶不同，帶來結果判別的障礙，對于飼料中的動物成分更難以實施。因為基因編碼序列的簡并性特征和非編碼序列的存在，核酸成為較蛋白更易檢出差異的靶分子，特別是線粒體DNA，拷貝數(shù)高，存在物種間差異，對其差異片段的分析是主要的鑒定方法，這類方法因靈敏度高，特異性好，耗時少而發(fā)展迅速，主要的方法包括普通/熒光PCR方法及基因芯片技術。在以線粒體DNA序列進行物種的種屬鑒別時，常用的區(qū)域包括編碼細胞色素B的Cytochromeb基因（cytB）、核糖體小亞基12SRNA編碼序列（12SribosomalRNA）、細胞色素C亞基I（cytochromeCoxidasesubunitI）的編碼基因coxI、編碼ATP8及ATP6的atp8及atp6基因以及控制區(qū)D-loop片段。這些區(qū)域的序列變異適中，即在種內(nèi)有一定的保守性，又體現(xiàn)出一定的種間差異。熒光定量PCR技術是一種高靈敏度核酸檢測和定量方法，基本原理是在實時熒光定量PCR反應中，引入了一種熒光化學物質(zhì)，隨著PCR反應的進行，PCR反應產(chǎn)物不斷積累，熒光信號強度也等比例增加。熒光定量PCR技術使定性檢測邁上了可以量化的臺階，而且具有靈敏度高、特異性和可靠性更強、能實現(xiàn)多重反應、自動化程度高、無污染性，具有實時性和準確性等特點，特別是依賴探針結合的TaqMan方法，目前已廣泛應用于分子生物學研究和醫(yī)學研究等領域。在物種鑒定應用方面，國內(nèi)已經(jīng)發(fā)布的國家標準或行業(yè)標準涵蓋了鵝、羊、鹿、駱駝、馬、驢、豬、兔、狗和魚等哺乳動物或水生生物。發(fā)明專利“用于檢測食品和飼料中狐貍成分的引物和探針”（公開號：CN103060435A）描述了一種能本發(fā)明選取狐貍的線粒體細胞色素C氧化還原酶I亞單位基因序列，設計一組特異性引物和探針，使用該引物和探針，采用實時熒光PCR技術，可快速、靈敏、特異地檢測食品和飼料中的狐貍成分，公開號為CN103088116A的發(fā)明專利“食品和飼料中狐貍成分快速檢測試劑盒的制備和檢測方法”以用實時熒光PCR技術檢測食品和飼料中狐貍成分的試劑盒及方法，主要目的是防止以其他動物源制品替代狐貍源成分。出于此種目的檢測方法，比如，檢測方法公開號為CN103361422A的發(fā)明“一種鑒別摻假肉及其制品的多重PCR快速檢測方法”涉及一種多重PCR快速檢測技術快速檢測肉品中是否含有某種被測定肉的技術。上述方法均為常規(guī)的PCR方法，需要對產(chǎn)物凝膠電泳后進行圖像采集和分析，耗費時間較長，且難以保證檢測的靈敏度。通過將免疫學檢測的方法移植于核酸產(chǎn)物檢測可以有效提高核酸產(chǎn)物的檢測效率。通過將PCR擴增使用的引物標記特定的蛋白質(zhì)或化合物可以在其擴增產(chǎn)物中引入同時包括兩種化合物/蛋白質(zhì)標記的核酸復合物，這個標記的產(chǎn)物可以通過抗體或者配體以類似雙抗體夾心的方式進行檢測，這個過程類似常規(guī)的免疫金標記檢測技術，這種方法已經(jīng)在單核苷酸多態(tài)性以及恒溫擴增靶基因的方法中使用，特別是對病原微生物或疾病關聯(lián)基因的鑒定，公開號為CN102134596A的發(fā)明專利-一種基于核酸橫向流試紙條檢測單核苷酸多態(tài)性的方法即以此方法進行單核苷酸多態(tài)性的檢測。而公開號為CN102520172A的發(fā)明專利-單增李斯特氏菌核酸層析檢測試劑盒及其檢測方法和應用描述了一種分別采用生物素和地高辛標記引物的單增李斯特氏菌基因組檢測方法。因此類方法僅對擴增產(chǎn)物的有無進行判斷，不對產(chǎn)物的分子量確認，因此在擴增反應中的干擾因素更多一些，常見的引起假陽性的原因包括：非特異性擴增、引物二聚體、擴增產(chǎn)物間的異常復性，解決引物二聚體、異常退火造成的干擾可以從PCR聚合酶的選擇、引物序列優(yōu)化、dNTP底物、雜交過程的控制幾個方面開展。選擇具有熱啟動（Hot-start）功能的DNA聚合酶可以明顯降低引物二聚體和非特異擴增產(chǎn)物的形成。在引物優(yōu)化方面，公開號為CN102146432A的發(fā)明專利-“一對部分同序引物減少其二聚體的方法”描述了一種在引物5′端帶有短回文序列的引物設計方法，該引物常溫下自身環(huán)化，避免形成異源二聚體，公開號為CN102719547A的發(fā)明專利-“檢測HER2基因表達水平的實時熒光定量PCR試劑”也采用了類似的方法用于實時定量PCR的擴增；公開號為CN101842494A的發(fā)明專利-“使用嵌合引物降低異源二聚體形成”描述了一種使用嵌合引物進行擴增的方法；在對反應底物的優(yōu)化中，公開號CN101171343A的發(fā)明專利“含有假異胞嘧啶核酸堿基衍生物的3′修飾寡核苷酸及其作為引物或探針的應用”提供了一種使用特別修飾的核苷酸作為底物以減少引物二聚體形成的方法，使用探針或者引入內(nèi)控探針也可以降低非特異擴增的干擾，公開號為CN101957373A的發(fā)明專利-“一種加入內(nèi)控核酸對病原體核酸進行半定量檢測的方法”即采用內(nèi)控探針來降低干擾，上述方法中，使用熱啟動技術和環(huán)化引物是通行的方法，其余方法或者采用了特殊合成的底物及底物，或者需要通過探針引入第二次雜交過程，都會增加檢測過程的復雜程度，特別是探針雜交方法，因需要保溫過程而失去了試紙條方法的便利性。本發(fā)明引物設計中，在保持特異性基礎上，對引物對及引物內(nèi)5′及3′末端退火的自由能進行評估后選擇合適的區(qū)域避免二聚體的形成，針對試紙條檢測方法二聚體的干擾情況以適當?shù)臄U增子長度，配合展開緩沖液中去污劑及變性劑的濃度優(yōu)化，可以實現(xiàn)引物二聚體和非特異擴增產(chǎn)物的有效清除。

技術實現(xiàn)要素：
將生物小分子或化合物標記的核酸分子可以被該小分子或化合物的抗體特異性識別，從而通過免疫學方法檢測。常見的可用于核酸分子標記的分子包括半抗原分子生物素（Biotin）、地高辛（Digoxin），熒光染料分子羅丹明(RBITC)、異硫氰酸熒光素(fluoresceinisothiocyanate,FITC)、Cy3、Cy5等。上述標記分子中，地高辛、異硫氰酸熒光素都易于獲得特異的抗體，而生物素分子與其配體-鏈親和素具有高度特異的結合特性，因此這幾種分子都可以選擇用于核酸分子的標記和免疫學檢測。本發(fā)明旨在將抗原或半抗原小分子標記單鏈寡核酸作為引物，對待檢的靶核酸特異性擴增，形成的復合物分子同時具備兩種抗原或半抗原標記，免疫原性的，該復合物即可用與特異抗體或特異配體結合，實現(xiàn)核酸擴增產(chǎn)物的免疫膠體金檢測。因此，一方面，本發(fā)明提供一種試紙條法檢測食品及飼料中狐貍源成分的的檢測技術，主要包括：1)設計兩條獨特的擴增引物，其中正向引物Fox-CYTB-F具有如下序列：5′-CCCTATATCGGAACCGATC-3′，用抗原或半抗原分子生物素（Biotin）、異硫氰酸熒光素（FITC）或地高辛（Digoxin）中的一種標記；下游引物Fox-CYTB-R的序列為5′-GAACTGAAAGGAGAAGTAAAAC-3′，以不同于上游引物的一種標記，；在適宜的擴增條件下，可擴增狐貍線粒體基因組COX區(qū)域一段長度為250bps的DNA片段；當無被檢核酸模板存在時，無特異性核酸片段擴增產(chǎn)物；2)將一種標準的通用抗體，如抗FITC抗體與膠體金顆粒交聯(lián)，在顆粒表面形成包被的抗體；3)將另一種標記分子的抗體或配體，如抗地高辛抗體或生物素分子的配體-鏈親和素分子以線條狀固定于膜上形成檢測線；4)當存在待檢的特異性擴增產(chǎn)物時，因上、下游引物的作用，擴增產(chǎn)物中同時帶有上述三種標記物中的兩種，形成標記分子1-擴增產(chǎn)物-標記分子2的復合物；5)將步驟4)形成的標志物1-擴增產(chǎn)物-標志物2與膠體金顆粒表面包被的標志物1的抗體結合，形成抗標志物1抗體-標志物1-擴增產(chǎn)物-標志物2有色顆粒復合物；6)將步驟5)得到的有色顆粒復合物在溶液中通過毛細現(xiàn)象沿纖維膜向上流動至涂布有標志物2的抗體或配體的線條上，復合物因與標志物2的抗體（配體）結合而沉積，滯留在檢測線上，形成肉眼可見的有色線條，判定為陽性；7)當特異性擴增產(chǎn)物不存在時，不發(fā)生上述步驟4)-6)，不能形成標志物1-擴增產(chǎn)物-標志物2復合物，也就不能形沉積于檢測線上標志物2的抗體（配體）之上，不形成可見的條帶，判為陰性。另一方面，本發(fā)明還提供了用于核酸序列檢測的展開液，該展開液可以減少引物二聚體對實驗結果的干擾；另一方面，本發(fā)明提供了用于食品及飼料中狐貍源成分的快速檢測的試紙條，其包括在帶有不干膠的襯墊，按順序有：1：吸水濾紙墊；2：結合物墊，附有第一種核酸標記物的抗體或配體的生色顆粒（膠體金或乳膠）；3：側(cè)向?qū)游龌|(zhì)（硝酸纖維素膜或尼龍膜）；4：檢測帶，附有第二種核酸標記物的抗體；5：質(zhì)控帶，附有可結合特定種屬來源抗體的抗體；6：襯底；7：吸水墊。另一方面，本發(fā)明還提供了用于檢測核酸擴增產(chǎn)物的通用標準試紙條。最后，本發(fā)明還提供了上述檢測方法和試紙條在食品及飼料中狐貍源性成分檢測中的用途。本發(fā)明說明書中所使用的技術術語解釋：引物：DNA合成的起始物。一般為一對單鏈寡核甘酸，在與模板雜交后，DNA合成從其3′末端開始。標記：將可檢測的信號分子(如半抗原，熒光，放射性等)與單鏈寡核苷酸相偶聯(lián)的方法。雜交：特指互補的DNA單鏈通過堿基配對形成雙鏈結構。展開：經(jīng)擴增反應的PCR產(chǎn)物在展開緩沖液的層析作用下由試紙條吸水墊底端開始向檢測線、質(zhì)控線方向移動的過程。核酸：脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)的通稱?？乖桶肟乖壕邆涿庖咴缘奈镔|(zhì)。通常為大分子蛋白質(zhì)或細胞組分。但有些小分子也具備免疫原性，被稱為半抗原((Hapten)。半抗原常被用于標記探針。抗體：能與抗原或半抗原特異性結合的蛋白質(zhì)分子。復合體：由兩種或兩種以上分子特異性結成的結合物。引物二聚體：在聚合酶鏈式反應（PCR）過程中，因引物對間、或單條引物相互退火形成的二聚體分子，由兩條不同引物構成的二聚體為異二聚體，因帶有兩種標記而可能引起與種抗體（配體）的結合而造成假陽性，由單一引物退火形成的二聚體為同二聚體，僅帶有一種標記而不會引起假陽性，但過多的二聚體形成會降低擴增效率。免疫試紙條：用于快速檢測的醫(yī)學工具。又稱為呈色薄膜層析。核酸聚合酶：合成核酸長鏈的酶類。分為DNA聚合酶和RNA聚合酶兩大類。有益效果由于本發(fā)明是以標記的特異性引物擴增適當長度的基因片段，能夠保證檢測的高度特異性，從而保證了檢測結果的準確性。本發(fā)明的新穎之處避免了擴增產(chǎn)物稀釋和探針雜交等流程，保持了免疫膠體金(試紙條)技術直觀、快速、方便、成熟、廉價等優(yōu)點，又具備PCR擴增方法高度靈敏度、高度特異性的特點，因此，本發(fā)明的方法是一種有效的狐貍源動物成分檢測方法。作為一個核酸擴增產(chǎn)物檢測的通用技術平臺，本發(fā)明的方法及其試紙條可以廣泛用于飼料中動物源成分的鑒定及食源性病原微生物的檢測，在農(nóng)牧業(yè)、海關檢驗檢疫都有廣泛的應用前景。目前雖有多種基于PCR的動物源成分鑒定方法，但其引物設計和產(chǎn)物片段都適于探針法或凝膠電泳，而對于膠體金試紙條法中降低引物二聚體及非特異復性的干擾去除缺乏必要的考慮，解決方法也并不適用。本發(fā)明目的在于提供一種基于免疫膠體金方法檢測狐貍源動物成分的PCR引物、擴增和檢測方法，以及該方法的應用。其他常見物種，如羊、豬、牛、驢、兔、駱駝、羊、雞、鴨、貂、鹿等的鑒定都可以采用與此類似的方法完成。核酸試紙條檢測方法的發(fā)明將大大簡化核酸擴增后的檢測程序。結果判讀簡單明了、直觀(檢測示意結果如附圖2)。本專利所申請的食品及飼料中狐貍源成分試紙條快速檢測技術，作為一種新型的核酸擴增后檢測技術，具有以下優(yōu)點：操作簡單：只需要把核酸擴增后的樣品直接滴到核酸試劑檢測版上即可，不需要專業(yè)人員操作，便于推廣；快速：檢測5分鐘后判讀結果；靈敏：與瓊脂糖凝膠電泳相比，檢測靈敏度提高近100～200倍；特異性高：由于在檢測過程中加使用的為特異性標記引物，使結果更加準確；價格便宜：費用大大低于傳統(tǒng)的凝膠電泳和ELISA檢測。附圖說明圖1顯示本發(fā)明的核酸序列擴增產(chǎn)物檢測的試紙條的基本結構；圖2是核酸檢測試紙條的檢測結果示意圖；圖3是顯示用實施例1的方法，采用特異性標記引物檢測狐貍成分PCR-試紙條的檢測結果；圖4是顯示用實施例2的方法，采用檢測狐貍特異性標記引物的特異性PCR-試紙條的檢測結果；圖5是用實施例2的方法，顯示核酸擴增后試紙條與凝膠電泳檢測法的敏感度比較結果。具體實施方式如下實施例舉例說明本發(fā)明的檢測方法及其檢測效果。實施例僅用來舉例，并不構成對本發(fā)明保護范圍的任何限制，本發(fā)明的保護范圍在所附的權利要求書說明。實施例11材料與方法狐貍線粒體DNA1.2引物設計1.3PCR擴增體系：1.3PCR擴增體系：反應條件：同時分別取5μl用于核酸試紙條檢，測取5μL擴增產(chǎn)物，加入到95μL展開液中進行檢測點于樣品墊，5分鐘后觀察結果。1.4PCR特異性實驗利用建立起來的PCR反應體系對1：狐貍；2：鼠；3：牛；4：鹿5：貂；6：狗；7：豬；8：貓；9：雞；10：鴨；11：鵝；12：NTC空白對照（水）驗證其特異性。2結果2.1PCR反應體系及條件采用TaKaRa公司的HSTaqDNApolymerase，總反應體系為20μl。用Bio-RadPCR儀進行檢測，反應參數(shù)為：94℃5min，94℃30s，55℃30s，72℃30s進行擴增，30個循環(huán)后轉(zhuǎn)入72℃5min，4℃保存。取5μl產(chǎn)物在含溴化乙錠的2%瓊脂糖凝膠電泳中進行電泳，電泳后判斷有無特異性條帶。核酸擴增后試紙條與凝膠電泳的檢測結果顯示于附圖4中。2.2特異性試驗本發(fā)明建立的PCR方法對狐貍基因組DNA具有較好的特異性，對其他哺乳動物及家禽類物種等無交叉反應。實施例2核酸試紙條檢測方法的靈敏性，將PCR模板以1/10，1/102，1/103，1/104，1/105，1/106，1/107，1/108，1/109，1/1010的比例稀釋后，按已建立的PCR體系進行擴增。1材料與方法狐貍線粒體DNA1.2引物設計1.3PCR擴增體系：反應條件：分別取5μl用于瓊脂糖凝膠電泳。凝膠電泳條件為：1XTBE緩沖液，電壓100V，電泳時間30分。同時分別取5μl用于核酸試紙條檢測，取5μl樣品點于樣品墊，加入到95μL展開液中進行檢測，5分鐘后觀察結果。2結果2.1PCR反應體系及條件采用TaKaRa公司的HSTaqDNApolymerase，總反應體系為20μl。用Bio-RadPCR儀進行檢測，反應參數(shù)為：94℃5min，94℃30s，56.5℃30s，72℃80s進行擴增，30個循環(huán)后轉(zhuǎn)入72℃5min，4℃保存。取5μl產(chǎn)物在含溴化乙錠的2%瓊脂糖凝膠電泳中進行電泳，電泳后判斷有無特異性條帶。核酸擴增后試紙條與凝膠電泳的敏感度比較結果顯示于附圖5中，由附圖5的結果可以看出，與傳統(tǒng)的凝膠電泳相比，其敏感度增加10~102倍以上。