本發(fā)明屬于植物分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種落葉松miR166a在調(diào)控植物發(fā)育中的應(yīng)用，特別涉及一種落葉松miR166a在促進(jìn)植物側(cè)根發(fā)育中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：
落葉松（Larixspp.）是我國(guó)北方重要的速生造林用材針葉樹(shù)種，可用于木材和造紙?jiān)稀娜騺?lái)看，落葉松天然分布在溫帶山區(qū)、寒溫帶的平原以及高山氣候區(qū)，前兩帶大致在北緯48°～60°之間，具有高緯度高海拔的特點(diǎn)。我國(guó)天然分布的落葉松有10個(gè)種和5個(gè)變種。它們分別分布于西北、華北、華中、東北和西南的山地和高山地區(qū)。大力開(kāi)展落葉松的科學(xué)研究，對(duì)于我國(guó)北方生態(tài)文明建設(shè)、推動(dòng)國(guó)民經(jīng)濟(jì)的發(fā)展具有重要意義。落葉松作為我國(guó)重要的針葉速生造林用材樹(shù)種，對(duì)其進(jìn)行大量繁育和遺傳改良，不經(jīng)能夠滿足人們對(duì)木材原料日益增長(zhǎng)的需求，也能為我國(guó)生態(tài)文明建設(shè)做出巨大貢獻(xiàn)。MicroRNAs（miRNAs）是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼RNA，其大小長(zhǎng)約20～25個(gè)核苷酸。成熟的miRNAs是由較長(zhǎng)的初級(jí)轉(zhuǎn)錄物經(jīng)過(guò)一系列核酸酶的剪切加工而產(chǎn)生的，隨后組裝進(jìn)RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體，通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式識(shí)別靶mRNA，并根據(jù)互補(bǔ)程度的不同指導(dǎo)沉默復(fù)合體降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻譯。植物miRNA的目標(biāo)基因大多是植物體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育、環(huán)境應(yīng)答和抗病響應(yīng)等諸多方面起著廣泛的調(diào)控作用。通過(guò)正向遺傳篩選、直接克隆、計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)和EST序列分析，目前已經(jīng)在67種植物中鑒定出約6000個(gè)miRNA（miRBase19.0）。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展和測(cè)序成本的下降，越來(lái)越多的植物中miRNA在基因組水平被生物信息學(xué)預(yù)測(cè)出來(lái)。而目前研究的最大挑戰(zhàn)之一是，如何驗(yàn)證單個(gè)的miRNA及其對(duì)應(yīng)的目標(biāo)基因在生物體內(nèi)發(fā)揮的功能。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種落葉松miR166a的新用途。本發(fā)明所提供的新用途，具體為如下（1）-（4）中任一所示的核酸分子在促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育中的應(yīng)用：（1）序列表中序列1所示的RNA分子；（2）序列表中序列2所示的RNA分子（落葉松前體miR166a）；（3）序列表中序列3所示的DNA分子（落葉松前體miR166a的全長(zhǎng)cDNA，命名為L(zhǎng)aMIR166a基因）；（4）序列表中序列3的第27-539位所示的DNA分子。在上述應(yīng)用中，所述促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育具體可體現(xiàn)在如下（A）-（C）中的至少一種：（A）促進(jìn)植物側(cè)根的發(fā)育；（B）提高植物生長(zhǎng)速率；（C）提高植物成活率。在上述應(yīng)用中，（A）中所述的“促進(jìn)植物側(cè)根發(fā)育”為促進(jìn)植物側(cè)根的發(fā)生；（B）中所述的“提高植物生長(zhǎng)速率”為提高組培苗（如在生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)4個(gè)月的組培苗）的生長(zhǎng)速率；（C）中所述的“提高植物成活率”為提高植物移栽后的成活率。如下（1）-（4）中任一所示的核酸分子在選育具有如下（I）-（III）中的至少一種的植物品種中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍：（1）序列表中序列1所示的RNA分子（落葉松成熟miR166a）；（2）序列表中序列2所示的RNA分子（落葉松前體miR166a）；（3）序列表中序列3所示的DNA分子（LaMIR166a基因）；（4）序列表中序列3的第27-539位所示的DNA分子。（I）側(cè)根根系發(fā)達(dá)；（II）植株生長(zhǎng)速率提高；（III）植株成活率提高。在實(shí)際應(yīng)用中，選育具有如上所述（I）-（III）中的至少一種的植物品種時(shí)，需將所述（1）-（4）中任一所示的核酸分子表達(dá)量較高的胚性細(xì)胞系，作為獲得目的轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞系。本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法。本發(fā)明所提供的培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，具體可包括如下a）和b）的步驟：a）向目的植物中導(dǎo)入如下（1）-（4）中任一所示的核酸分子，得到表達(dá)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物；（1）序列表中序列1所示的RNA分子（落葉松成熟miR166a）；（2）序列表中序列2所示的RNA分子（落葉松前體miR166a）；（3）序列表中序列3所示的DNA分子（LaMIR166a基因）；（4）序列表中序列3的第27-539位所示的DNA分子。b）從步驟a）所得轉(zhuǎn)基因植物中得到與所述目的植物相比，具有如下（I）-（III）中的至少一種的轉(zhuǎn)基因植物：（I）側(cè)根根系發(fā)達(dá)；（II）植株生長(zhǎng)速率提高；（III）植株成活率提高。其中，序列1由21個(gè)核苷酸組成，為落葉松成熟miR166a序列；序列2由95個(gè)核苷酸組成，為落葉松前體miR166a序列；序列3由884個(gè)脫氧核苷酸組成，為落葉松前體miR166a的全長(zhǎng)cDNA序列，即為L(zhǎng)aMIR166a基因。在本發(fā)明中，培育轉(zhuǎn)基因植物時(shí)采用的是將序列表中序列3的第27-539位所示的DNA分子導(dǎo)入所述目的植物中的。進(jìn)一步，所述序列表中序列3的第27-539位所示的DNA分子，是通過(guò)重組表達(dá)載體的形式轉(zhuǎn)入所述目的植物中的。更進(jìn)一步，所述重組表達(dá)載體上啟動(dòng)所述序列表中序列3的第27-539位所示的DNA分子轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子是Super啟動(dòng)子。更為具體的，所述重組表達(dá)載體為在pSuper1300+載體的多克隆位點(diǎn)（如HindIII和KpnI）處插入序列表中序列3的第27-539位所示的DNA分子后得到的重組質(zhì)粒。當(dāng)然，所述重組表達(dá)載體也可用現(xiàn)有的其他植物表達(dá)載體構(gòu)建，如雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等，更加具體如pGreen0029、pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pBI121、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表達(dá)載體。所述植物表達(dá)載體還可包含外源基因的3’端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號(hào)和任何其它參與mRNA加工或基因表達(dá)的DNA片段。所述聚腺苷酸信號(hào)可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mRNA前體的3’端。使用所述基因構(gòu)建重組表達(dá)載體時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)型、組成型、組織特異型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，例如花椰菜花葉病毒（CAMV）35S啟動(dòng)子、泛素基因Ubiquitin啟動(dòng)子（pUbi）、脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子rd29A等，它們可單獨(dú)使用或與其它的植物啟動(dòng)子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建重組表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號(hào)和起始密碼子的來(lái)源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來(lái)自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所用重組表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因、具有抗性的抗生素標(biāo)記物或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因等。也可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。在上述培育轉(zhuǎn)基因植物的方法中，將所述重組表達(dá)載體導(dǎo)入所述目的植物，具體可為：通過(guò)使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物組織培育成植株。在上述各應(yīng)用或各方法中，所有的（I）中所述的“側(cè)根根系發(fā)達(dá)”為側(cè)根數(shù)目增多；所有的（II）中所述的“植株生長(zhǎng)速率提高”為組培苗（如在生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)4個(gè)月的組培苗）生長(zhǎng)速率提高；所有的（III）中所述的“植株成活率提高”為移栽后的植株成活率提高。在上述各應(yīng)用或各方法中，所述植物可為裸子植物。在本發(fā)明中，所述裸子植物為落葉松屬植物，具體可為日本落葉松（Larixleptolepis）、長(zhǎng)白落葉松（LarixolgensisHenry）、興安落葉松（Larixgmelinii）或華北落葉松（Larixprincipis-rupprechtiiMayr）。實(shí)驗(yàn)證明，將序列表中序列3的第27-539位所示的DNA分子在落葉松中過(guò)表達(dá)，獲得轉(zhuǎn)基因植株。結(jié)果顯示LaMIR166a基因過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株在生根培養(yǎng)基a17上培養(yǎng)4個(gè)月時(shí)，有大量的側(cè)根發(fā)生，且植株生長(zhǎng)良好；而非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓辏挥兄鞲扉L(zhǎng)，沒(méi)有側(cè)根發(fā)生，且相比之下植株生長(zhǎng)緩慢。這說(shuō)明過(guò)表達(dá)miR166a可促進(jìn)落葉松組培苗的生長(zhǎng)速率、促進(jìn)側(cè)根的發(fā)生，從而提高其移栽成活率。附圖說(shuō)明圖1為前體miR166a的RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)。方框內(nèi)為成熟miR166a的序列。圖2為轉(zhuǎn)基因落葉松的PCR檢測(cè)結(jié)果。其中，A為目的基因LaMIR166a的擴(kuò)增結(jié)果；各泳道模板DNA分別是：水，陰性對(duì)照（CK-，未轉(zhuǎn)基因的落葉松胚性細(xì)胞系），a1～a5、陽(yáng)性對(duì)照（CK+，導(dǎo)入重組表達(dá)載體pSuper::MIR166a的轉(zhuǎn)基因落葉松胚性細(xì)胞系）；泳道M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。B為潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（HPT）的擴(kuò)增結(jié)果；各泳道模板DNA分別是：水，陰性對(duì)照（CK-，未轉(zhuǎn)基因的落葉松胚性細(xì)胞系），a1～a5、陽(yáng)性對(duì)照（CK+，導(dǎo)入重組表達(dá)載體pSuper::MIR166a的轉(zhuǎn)基因落葉松胚性細(xì)胞系）；泳道M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。C為農(nóng)桿菌毒性基因VirG的擴(kuò)增結(jié)果；各泳道模板DNA分別是：水，陰性對(duì)照（CK-，未轉(zhuǎn)基因的落葉松胚性細(xì)胞系），a1～a5、陽(yáng)性對(duì)照（CK+，農(nóng)桿菌GV3101）泳道M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。圖3為轉(zhuǎn)基因落葉松的qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果。圖4為在生根培養(yǎng)基a17上培養(yǎng)4個(gè)月時(shí)轉(zhuǎn)基因落葉松組培苗的形態(tài)。其中，A為未轉(zhuǎn)基因落葉松組培苗；B為轉(zhuǎn)入重組表達(dá)載體pSuper::MIR166a的轉(zhuǎn)基因落葉松組培苗a4。具體實(shí)施方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。pSuper1300+載體：記載于“朱彩虹,李水根,齊力旺,韓素英.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的日本落葉松胚性細(xì)胞遺傳轉(zhuǎn)化研究.中國(guó)生物工程雜志,2013,33（5）:75-80”一文。農(nóng)桿菌GV3101：記載于“趙湛,李文生.不同根癌農(nóng)桿菌菌株類型對(duì)木霉菌遺傳轉(zhuǎn)化效率的影響.北方園藝,2006年03期”一文。實(shí)施例1、miR166a過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植物的獲得及鑒定本實(shí)施例中所涉及的miR166a為日本落葉松（Larixleptolepis）的miR166a。其中，成熟miR166a序列的序列為序列表中序列1；前體miR166a序列的序列為序列表中序列2；前體miR166a序列的全長(zhǎng)cDNA為序列表中序列3，命名為L(zhǎng)aMIR166a基因。其中，前體miR166a的RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)如圖1所示。一、重組表達(dá)載體pSuper::MIR166a的構(gòu)建1、引物設(shè)計(jì)根據(jù)序列表中序列3所示的前體miR166a序列的全長(zhǎng)cDNA（LaMIR166a基因），在該cDNA上的miR166a莖環(huán)結(jié)構(gòu)序列的兩端各約200bp處設(shè)計(jì)引物，如下：引物1：5’-CCCAAGCTTGCAACACCATACTTACGCC-3’（下劃線部分為HindIII的識(shí)別序列，其后的序列為序列3的第27-45位；引物2：5’-GGGGTACCCCCTGGAAAACTCACCTATAC-3’（下劃線部分為KpnI的識(shí)別序列，其后的序列為序列3的第519-539位的反向互補(bǔ)序列）2、PCR擴(kuò)增提取日本落葉松（Larixspp.）的總RNA，反轉(zhuǎn)錄后得到cDNA序列。以所得cDNA為模板，采用上述引物對(duì)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)測(cè)序鑒定PCR產(chǎn)物的核苷酸序列為“CCCAAGCTT+序列表的序列3的第27-539位+GGTACCCC”。3、載體構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶HindIII和KpnI雙酶切步驟2所得PCR產(chǎn)物，膠回收后與經(jīng)過(guò)同樣雙酶切的pSuper1300+載體的骨架大片段相連，獲得重組質(zhì)粒。對(duì)所得重組質(zhì)粒進(jìn)行HindIII和KpnI雙酶切鑒定，鑒定正確（得到大小約為10kbp和525bp）后送樣測(cè)序。將經(jīng)測(cè)序表明在pSuper1300+載體的多克隆位點(diǎn)HindIII和KpnI之間插入序列表中序列3的第27-539位所示的DNA分子后得到的重組質(zhì)粒，命名為pSuper::MIR166a。在重組表達(dá)載體pSuper::MIR166a中，啟動(dòng)序列表中序列3的第27-539位所示的DNA分子轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子為Super啟動(dòng)子。當(dāng)然，在構(gòu)建重組表達(dá)載體pSuper::MIR166a的過(guò)程中，也可以采用序列表中序列3所示的DNA分子為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。二、轉(zhuǎn)基因落葉松的獲得1、轉(zhuǎn)基因落葉松胚性細(xì)胞系的獲得（1）重組農(nóng)桿菌的制備YEB液體培養(yǎng)基（1L）：牛肉浸膏5g+酵母膏5g+胰蛋白胨5g+蔗糖5g+MgSO4·7H2O0.493g，溶劑為水；pH7.0。YEB固體培養(yǎng)基（1L）：牛肉浸膏5g+酵母膏5g+胰蛋白胨5g+蔗糖5g+MgSO4·7H2O0.493g+瓊脂粉15g，溶劑為水；pH7.0。將步驟一得到的重組表達(dá)載體pSuper::MIR166a導(dǎo)入農(nóng)桿菌GV3101。具體操作如下：將10μL重組表達(dá)載體pSuper::MIR166a加入到200μL農(nóng)桿菌GV3101的感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻；冰浴30min，液氮冷凍3～5min，37℃水浴5min；加入1mLYEB液體培養(yǎng)基，28℃，180rpm振蕩培養(yǎng)4h；4000rpm、室溫離心8min，棄上清，加入200μLYEB液體培養(yǎng)基重懸菌體，涂布于YEB固定培養(yǎng)基（含利福平，慶大霉素和卡那霉素各50mg/L）；28℃，黑暗培養(yǎng)2d，挑取單菌落并PCR檢測(cè)驗(yàn)證，所采用引物為步驟一中的引物1和引物2，將經(jīng)PCR擴(kuò)增得到大小約為525bp目的條帶的重組農(nóng)桿菌命名GV3101/MIR166a。同時(shí)設(shè)置轉(zhuǎn)入pSuper1300+空載體的農(nóng)桿菌作為對(duì)照，將所得對(duì)應(yīng)重組農(nóng)桿菌命名為GV3101/pSuper1300+。（2）受體材料的準(zhǔn)備及預(yù)培養(yǎng)將落葉松胚性細(xì)胞轉(zhuǎn)接到新的培養(yǎng)基S0（具體為“申請(qǐng)?zhí)枮?00510090282.X，授權(quán)公告號(hào)為CN100427586C的專利”中記載的增殖培養(yǎng)基）上15d后，挑取表面生長(zhǎng)旺盛的胚性組織約1g作為遺傳轉(zhuǎn)化的受體材料。（3）農(nóng)桿菌液制備。培養(yǎng)基Y0（1L）：具體為“申請(qǐng)?zhí)枮?00510090282.X，授權(quán)公告號(hào)為CN100427586C的專利”中記載的增殖培養(yǎng)基中不加瓊脂。浸染液Y1（1L）：培養(yǎng)基Y0+AS10-40mg；pH5.75～5.85。取出儲(chǔ)存于－80℃的甘油農(nóng)桿菌（重組農(nóng)桿菌GV3101/MIR166a或重組農(nóng)桿菌GV3101/pSuper1300+），置于冰上使其溶解，再置于4℃保存?zhèn)溆谩Ｈ〕鲆呀鈨龅闹亟M農(nóng)桿菌，在YEB固體培養(yǎng)基（添加利福平霉素，慶大霉素、卡那霉素各50mg/L）上劃板，25℃黑暗培養(yǎng)。大約48h后，重組農(nóng)桿菌長(zhǎng)出。從平板上挑取單菌落，接種于YEB液體培養(yǎng)基（添加與上述相同的抗生素）中，28℃、黑暗、180rpm震蕩培養(yǎng)。約18h后，重組農(nóng)桿菌長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期，菌液濃度約為0.6～0.8（OD600nm）時(shí)，將其轉(zhuǎn)移至離心管中，配平后轉(zhuǎn)移到低溫高速離心機(jī)，4000rpm，4℃離心10min。小心倒去上清，將收集到的菌液用浸染液Y1重懸。轉(zhuǎn)移到已滅菌的三角瓶中，并調(diào)至所需濃度0.4（OD600nm）。（4）侵染、共培養(yǎng)及抗性篩選。培養(yǎng)基S1（1L）：培養(yǎng)基S0+AS10-40mg；pH5.75～5.85。培養(yǎng)基S2（1L）：培養(yǎng)基S0+頭孢霉素200-700mg；pH5.75～5.85。培養(yǎng)基S3（1L）：培養(yǎng)基S0+頭孢霉素200-700mg+潮霉素3-20mg；pH5.75～5.85。將收集到的胚性細(xì)胞加入到上述已制備好的重組農(nóng)桿菌液中20-30min。將三角瓶靜置，倒去上層液體。將胚性細(xì)胞轉(zhuǎn)移至固體培養(yǎng)基S1上。將接種后的材料置于暗培室中，25℃共培養(yǎng)3-5d。待胚性組織塊周圍長(zhǎng)出重組農(nóng)桿菌后，用鑷子小心挑取，轉(zhuǎn)移至已滅菌的三角瓶中。反復(fù)清洗后至上清液呈清亮透澈，倒去上層液體，用含頭孢霉素的液體培養(yǎng)基S2清洗20min。收集胚性細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至含抑菌抗生素的培養(yǎng)基S2上，恢復(fù)培養(yǎng)3-7d。將恢復(fù)培養(yǎng)的愈傷組織轉(zhuǎn)移至篩選培養(yǎng)基S3上，等待抗性組織的長(zhǎng)出，將抗性組織再次篩選，直到抗性穩(wěn)定，獲得轉(zhuǎn)入重組表達(dá)載體pSuper::MIR166a的轉(zhuǎn)基因落葉松胚性細(xì)胞系，以及轉(zhuǎn)入pSuper1300+空載體的轉(zhuǎn)基因落葉松胚性細(xì)胞系。其中，轉(zhuǎn)入重組表達(dá)載體pSuper::MIR166a的轉(zhuǎn)基因落葉松胚性細(xì)胞系共獲得了5個(gè)，分別記為pSuper::MIR166a1-5（簡(jiǎn)稱a1-a5）。2、轉(zhuǎn)基因落葉松胚性細(xì)胞系的鑒定（1）PCR檢測(cè)分別提取步驟1獲得的5個(gè)轉(zhuǎn)入重組表達(dá)載體pSuper::MIR166a的轉(zhuǎn)基因落葉松胚性細(xì)胞系a1-a5，以及轉(zhuǎn)入pSuper1300+空載體的轉(zhuǎn)基因落葉松胚性細(xì)胞系的基因組DNA。同時(shí)以非轉(zhuǎn)化的落葉松胚性細(xì)胞系為陰性對(duì)照，以重組表達(dá)載體pSuper::MIR166a和重組農(nóng)桿菌GV3101/MIR166a菌液為陽(yáng)性對(duì)照。分別設(shè)計(jì)目的基因（位于載體上，跨目的基因LaMIR166a）特異性引物和潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（HPT）特異性引物。另外，為了排除陽(yáng)性轉(zhuǎn)化細(xì)胞受農(nóng)桿菌污染而出現(xiàn)的假陽(yáng)性，設(shè)計(jì)VirG基因（位于T-DNA之外）特異性引物檢測(cè)農(nóng)桿菌。目的基因LaMIR166a的特異性引物，如下：上游引物：5’-AGATACGCTGACACGCCAA-3’；下游引物：5’-CCGGACACGCTGAACTTG-3’。潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（HPT）特異性引物，如下：上游引物：5’-ATGGCATCTGCAACATTGTCCA-3’；下游引物：5’-ATAGATACGCTGACACGCCA-3’。VirG基因（位于T-DNA之外）特異性引物，如下：上游引物：5’-GATTTTATTGCCAAGCCTTTT-3’；下游引物：5’-TACTTCTGTCATACACCTCCTCC-3’。采用Ex-Taq酶（Takara）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系如下：Ex-Taqmix10μL，上下游引物各1μL，模板DNA1μL，加水補(bǔ)至20μL。1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR結(jié)果。如圖2所示，其中目的基因LaMIR166a（圖2中A）特異性引物在5個(gè)轉(zhuǎn)入重組表達(dá)載體pSuper::MIR166a的轉(zhuǎn)基因落葉松胚性細(xì)胞系a1-a5和陽(yáng)性對(duì)照中均擴(kuò)增出大小約為800bp的目的條帶，而在轉(zhuǎn)入pSuper1300+空載體的轉(zhuǎn)基因落葉松胚性細(xì)胞系和非轉(zhuǎn)基因落葉松胚性細(xì)胞系中未能擴(kuò)出目的條帶，與預(yù)期結(jié)果一致；潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（HPT）（圖2中B）特異性引物在5個(gè)轉(zhuǎn)入重組表達(dá)載體pSuper::MIR166a的轉(zhuǎn)基因落葉松胚性細(xì)胞系a1-a5、轉(zhuǎn)入pSuper1300+空載體的轉(zhuǎn)基因落葉松胚性細(xì)胞系和陽(yáng)性對(duì)照中均擴(kuò)增出大小約為500bp的目的條帶，而在非轉(zhuǎn)基因落葉松胚性細(xì)胞系中未能擴(kuò)出目的條帶。由此證明5個(gè)轉(zhuǎn)入重組表達(dá)載體pSuper::MIR166a的轉(zhuǎn)基因落葉松胚性細(xì)胞系a1-a5均攜帶有目的基因和潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因片段。農(nóng)桿菌毒性基因VirG（圖2中C）的特異性引物的擴(kuò)增結(jié)果表明只在農(nóng)桿菌中擴(kuò)增出目的條帶，因此5個(gè)轉(zhuǎn)入重組表達(dá)載體pSuper::MIR166a的轉(zhuǎn)基因落葉松胚性細(xì)胞系a1-a5均沒(méi)有受到農(nóng)桿菌殘留的污染，從而排除了假陽(yáng)性。（2）qRT-PCR檢測(cè)以步驟1獲得的5個(gè)轉(zhuǎn)入重組表達(dá)載體pSuper::MIR166a的轉(zhuǎn)基因落葉松胚性細(xì)胞系a1-a5，轉(zhuǎn)入pSuper1300+空載體的轉(zhuǎn)基因落葉松胚性細(xì)胞系，以及非轉(zhuǎn)化的落葉松胚性細(xì)胞系為實(shí)驗(yàn)材料。提取各實(shí)驗(yàn)材料的總RNA。為了排除基因組DNA對(duì)后續(xù)試驗(yàn)的干擾，在1μg總RNA中加入1μLDNase（Fermentas，加拿大）進(jìn)行消化去除RNA中殘留的基因組DNA。再加入1μLbuffer，加水補(bǔ)至10μL；37℃反應(yīng)30min；加入1μLEDTA，65℃孵育10min使DNase酶失活以終止反應(yīng)。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Fermentas），將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。在上一步消化好的RNA中加入以下組分：1μLoligo（dT）引物，4μLBuffer，1μLRNaseInhibitor，2μLdNTPmix，1μL反轉(zhuǎn)錄酶。反應(yīng)條件42℃，60min；72℃，5min；反應(yīng)完成后存于-80℃?zhèn)溆?。qRT-PCR采用試劑盒SYBRPremixEXTaqKit（寶生物工程），按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。將cDNA稀釋后，取2μL在7500Real-timePCRSystem（AppliedBiosystems,USA）上進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增檢測(cè)LaMIR166a基因表達(dá)量。建立20μL反應(yīng)體系如下：SYBRPremixExTaqTM10μL，正向引物（濃度10μM）0.4μL，反向引物（濃度10μM）0.4μL，ROXReferenceDyeII0.4μL，cDNA2.0μL，dH2O6.8μL。正向引物：5’-CTTACGCCGCCGTCTATTCA-3’（序列3的第38-57位）；反向引物：5’-GCCAACCATTCCCAAGCTAT-3’（序列3的第193-212位的反向互補(bǔ)序列）。反應(yīng)程序：95℃，30s；95℃，5s，60℃，34s，重復(fù)40個(gè)循環(huán)。內(nèi)參基因采用LaEF1A1（GenBank：JX157845）。內(nèi)參基因的擴(kuò)增引物為5’-GACTGTACCTGTTGGTCGTG-3’和5’-CCTCCAGCAGAGCTTCAT-3’。使用相對(duì)定量方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算和統(tǒng)計(jì)，每個(gè)樣品重復(fù)4次，取平均值。PCR之后通過(guò)溶解曲線分析（采用機(jī)器默認(rèn)程序）和1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，驗(yàn)證PCR結(jié)果為特異性擴(kuò)增。LaMIR166a基因的相對(duì)表達(dá)量（利用qRT-PCR技術(shù)，采用2-ΔΔCt方法計(jì)算）的qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果如圖3所示，步驟1獲得的5個(gè)轉(zhuǎn)入重組表達(dá)載體pSuper::MIR166a的轉(zhuǎn)基因落葉松胚性細(xì)胞系a1-a5中LaMIR166a基因的表達(dá)水平均比作為對(duì)照的未轉(zhuǎn)基因落葉松胚性細(xì)胞系顯著升高，且在a4中的表達(dá)水平最高。對(duì)于轉(zhuǎn)入pSuper1300+空載體的轉(zhuǎn)基因落葉松胚性細(xì)胞系，其LaMIR166a基因的表達(dá)水平與作為對(duì)照的未轉(zhuǎn)基因落葉松基本一致，無(wú)顯著差異。3、轉(zhuǎn)基因落葉松的獲得將經(jīng)上述鑒定LaMIR166a基因的表達(dá)量最高的轉(zhuǎn)入重組表達(dá)載體pSuper::MIR166a的轉(zhuǎn)基因落葉松胚性細(xì)胞系a4，轉(zhuǎn)接到成熟培養(yǎng)基（具體為“申請(qǐng)?zhí)枮?00510090282.X，授權(quán)公告號(hào)為CN100427586C的專利”中記載的成熟培養(yǎng)基）上誘導(dǎo)體細(xì)胞胚的發(fā)生與成熟，獲得發(fā)育良好的成熟體細(xì)胞胚，將其置于生根培養(yǎng)基a17（1/2MS+IBA1.0mg/L+蔗糖20g/L+瓊脂5.5g/L）直至生根發(fā)芽。將生長(zhǎng)良好的組培苗，移栽到溫室繼續(xù)培養(yǎng)，最終獲得轉(zhuǎn)入重組表達(dá)載體pSuper::MIR166a的轉(zhuǎn)基因落葉松a4。實(shí)施例2、轉(zhuǎn)基因落葉松的功能鑒定以實(shí)施例1獲得的轉(zhuǎn)入重組表達(dá)載體pSuper::MIR166a的轉(zhuǎn)基因落葉松a4、轉(zhuǎn)入pSuper1300+空載體的轉(zhuǎn)基因落葉松，以及未轉(zhuǎn)基因的落葉松為實(shí)驗(yàn)材料。將各實(shí)驗(yàn)材料的成熟體細(xì)胞胚置于生根培養(yǎng)基a17（1/2MS+IBA1.0mg/L+蔗糖20g/L+瓊脂5.5g/L）上，于4℃、黑暗環(huán)境下處理7d，然后置于25℃、光照（16h/8h）條件下培養(yǎng)，觀察并記錄各實(shí)驗(yàn)材料的植株形態(tài)、植株生長(zhǎng)速率、根系發(fā)育情況等。待各實(shí)驗(yàn)材料的植株生根發(fā)芽后，將生長(zhǎng)良好的組培苗移栽到溫室繼續(xù)培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。結(jié)果顯示，在生根培養(yǎng)基a17上培養(yǎng)4個(gè)月時(shí)，未轉(zhuǎn)基因的落葉松的組培苗只有主根伸長(zhǎng)，沒(méi)有側(cè)根發(fā)生，植株生長(zhǎng)緩慢；相比而言，轉(zhuǎn)入重組表達(dá)載體pSuper::MIR166a的轉(zhuǎn)基因落葉松a4的組培苗側(cè)根大量發(fā)生，植株生長(zhǎng)速率顯著快于未轉(zhuǎn)基因的對(duì)照植株。其形態(tài)具體如圖4所示。而對(duì)于轉(zhuǎn)入pSuper1300+空載體的轉(zhuǎn)基因落葉松而言，其植株形態(tài)、植株生長(zhǎng)速率、根系發(fā)育情況等均與未轉(zhuǎn)基因的對(duì)照植株基本一致，無(wú)顯著差異。以上結(jié)果說(shuō)明，過(guò)表達(dá)MIR166a可促進(jìn)落葉松組培苗側(cè)根的發(fā)生，從而利于提高其移栽成活率。