專利名稱：一種提高當(dāng)歸多糖免疫增強(qiáng)活性的硒化修飾方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一種當(dāng)歸多糖的硒化修飾方法，屬于中藥多糖的結(jié)構(gòu)改造技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
多糖廣泛存在于植物、 微生物、藻類和動物體內(nèi)，是構(gòu)成生命的四大基本物質(zhì)之一。隨著化學(xué)和生物學(xué)的快速發(fā)展和分離技術(shù)的提高，多糖的生物學(xué)功能，特別是作為生命物質(zhì)參與生命的全部時間和空間功能，突破了多糖作為支持組織和能量來源的傳統(tǒng)觀念，發(fā)現(xiàn)其具有更廣泛的生物學(xué)功效，如增強(qiáng)免疫、抗腫瘤、抗炎、抗菌、抗病毒、抗氧化、抗突變、抗衰老、降血糖、降血脂等，而且具有毒性小、安全性高等優(yōu)點(diǎn)。特別是多糖具有免疫增強(qiáng)、抗病毒等功能使得多糖物質(zhì)成為人類及動植物醫(yī)療、保健、病蟲害防治領(lǐng)域的重要成員，也是食品功能化學(xué)關(guān)注的焦點(diǎn)。近年來，多糖研究一直是國際前沿課題。研究證實(shí)，多糖的活性直接或間接地受到其結(jié)構(gòu)的制約。影響多糖生物學(xué)活性的結(jié)構(gòu)因素包括多糖的主鏈性質(zhì)、支鏈性質(zhì)和分子的高級結(jié)構(gòu)，主鏈的糖單元組成和糖苷鍵類型直接決定多糖的活性，支鏈的類型、聚合度和在糖鏈上的分布及其取代度決定了多糖活性的大小，多糖分子的高級結(jié)構(gòu)如鏈的柔韌性和空間構(gòu)像與多糖的活性緊密相關(guān)。因此，可根據(jù)需要選擇合適的分子修飾方法對多糖進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造。利用糖殘基上的羥基、羧基、氨基等基團(tuán)進(jìn)行化學(xué)修飾以引入新的基團(tuán)，增強(qiáng)多糖的活性或使多糖產(chǎn)生新的活性。硒是生命必需的微量元素，是谷胱甘肽過氧化物酶的主要活性成分，可以直接或間接地清除體內(nèi)氧自由基，抑制脂氧化或過氧化，阻斷活性氧和自由基的致病作用，保護(hù)細(xì)胞免遭過氧化物的損傷，維護(hù)細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，對動物的生長、繁殖、免疫、抗感染、抗應(yīng)激等方面起著重要的作用，但是我國約72%的地區(qū)屬于低硒或缺硒地區(qū)，飼料和牧草硒含量小于0. 05mg/kg，不能滿足動物的正常生理需要，補(bǔ)硒成為一種必要措施。硒的存在形式有無機(jī)硒和有機(jī)硒兩種,常見的無機(jī)硒如亞硒酸鈉和硒酸鈉,有機(jī)硒主要是硒蛋白和硒多糖。硒多糖是一種多糖有機(jī)硒化合物，具備了硒和多糖兩者的活性，而且其生物活性普遍高于多糖和硒。補(bǔ)無機(jī)硒具有蓄積性毒性和致突變作用，使用時劑量難以控制；而有機(jī)硒的毒性低、副作用小，不但能夠更好地發(fā)揮硒的作用，而且在促進(jìn)生長和激發(fā)免疫反應(yīng)上比無機(jī)硒顯著，更易于為機(jī)體吸收和利用。然而天然硒多糖一般存在于植物或微生物中，含量較低，即使在高硒地區(qū)的植物或微生物中，硒多糖中的硒含量也相對較低。除了通過一些富硒手段(如人工協(xié)迫富硒栽培、富硒酵母培養(yǎng)等)使生物體中硒多糖的硒含量增加外，通過硒化修飾的方法獲取硒多糖是重要手段。當(dāng)歸為傘形科植物當(dāng)歸Angelica sinensis (Oliv. ) Diels的干燥根,其性溫味甘、辛，歸肝、心、脾經(jīng)，具有補(bǔ)血養(yǎng)血、活血止痛、潤燥通便等功效，主治血虛勞傷、血瘀疼痛、跌打損傷、癰腫瘡瘍、腸燥便秘、胎產(chǎn)諸病?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)，當(dāng)歸多糖是當(dāng)歸的主要活性成分，具有增強(qiáng)免疫、抗病毒、降血糖、抗腫瘤、抗氧化等作用。本發(fā)明首次對當(dāng)歸多糖進(jìn)行硒化修飾，建立了當(dāng)歸多糖的硒化修飾方法，基于產(chǎn)物的增強(qiáng)免疫活性優(yōu)化了修飾條件，發(fā)現(xiàn)硒化修飾能顯著提高當(dāng)歸多糖的增強(qiáng)免疫活性。
發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明針對中藥多糖生物活性低的問題，提供一種通過當(dāng)歸多糖免疫增強(qiáng)活性的硒化修飾方法，達(dá)到顯著提高當(dāng)歸多糖的增強(qiáng)免疫活性的目的。技術(shù)方案
一種提高當(dāng)歸多糖免疫增強(qiáng)活性的硒化修飾方法，包括提取、純化當(dāng)歸多糖，用硝酸-亞硒酸鈉法對當(dāng)歸多糖進(jìn)行硒化修飾，其特征在于，基于產(chǎn)物的增強(qiáng)免疫活性比較，確定最佳修飾條件為亞硒酸鈉用量200mg(500mg當(dāng)歸多糖)，反應(yīng)溫度70°C，反應(yīng)時間6h ；并篩選出一種活性最好的硒化當(dāng)歸多糖產(chǎn)品。有益效果I.建立了當(dāng)歸多糖的硒化修飾方法,通過正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了當(dāng)歸多糖的硒化修飾條件。2.證明硒化修飾能夠顯著提高當(dāng)歸多糖的增強(qiáng)免疫活性，并篩選出一種增強(qiáng)免疫活性最好的硒化當(dāng)歸多糖。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)如下I.當(dāng)歸多糖的硒化修飾國內(nèi)外未見報道，本發(fā)明提供了一種提高當(dāng)歸多糖免疫增強(qiáng)活性的硒化修飾方法及其優(yōu)化的修飾條件，填補(bǔ)了國內(nèi)外研究的空白。2.通過本發(fā)明的實(shí)施，證明硒化修飾能夠顯著提高當(dāng)歸多糖的增強(qiáng)免疫活性，并篩選出一種活性最好的硒化當(dāng)歸多糖，為研制新型免疫增強(qiáng)劑提供了材料和示范。
具體實(shí)施例方式I.當(dāng)歸多糖的提取用水煎-醇沉法。取當(dāng)歸飲片lOOOg，粉碎成O. 3 Icm3的小塊，加95%乙醇2000mL浸泡12h，80°C水浴回流2次，每次lh，藥物晾12h，加20倍量水煎煮2次，每次30min,合并濾液,濃縮至IOOOmL, 2500rpm離心20min,棄去沉淀,加95%乙醇使醇含量達(dá)90%，4°C靜置12h，回收乙醇，離心，沉淀60°C真空干燥，得到粗的當(dāng)歸多糖。2.當(dāng)歸多糖的純化將粗當(dāng)歸多糖用Sevage法去蛋白，真空干燥,加蒸懼水溶解成50mg mL—1的溶液，上Sephadex G-200 (2cmX 100cm)柱,用蒸懼水洗脫,流速12mL · IT1,自動收集器收集洗脫液，每管4mL，苯酚-硫酸法檢測各管是否含糖，繪制洗脫曲線(得到I個峰)。合并含糖管洗脫液，減壓濃縮，冷凍干燥，得到純化的當(dāng)歸多糖(CAP)，用苯酚-硫酸法測定糖含量為92. 7%。3.當(dāng)歸多糖的硒化修飾用硝酸-亞硒酸鈉法。(I)修飾條件設(shè)計(jì)由于亞硒酸鈉用量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間是影響多糖硒化修飾的主要因素，在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以亞硒酸鈉用量(每500mg多糖)(A)、反應(yīng)溫度(B)和反應(yīng)時間(C)為因素，按3因素3水平的L9 (34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)9種修飾條件(表I)。表IL9 (34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表
權(quán)利要求
1.一種提高當(dāng)歸多糖免疫增強(qiáng)活性的硒化修飾方法，包括提取、純化當(dāng)歸多糖，用硝酸-亞硒酸鈉法進(jìn)行硒化修飾，其特征在于，修飾條件為亞硒酸鈉用量200mg (500mg當(dāng)歸多糖)，反應(yīng)溫度70°C，反應(yīng)時間6h。
2.權(quán)利要求I所述方法獲得的硒化當(dāng)歸多糖的增強(qiáng)免疫活性最高，較未修飾的當(dāng)歸多糖活性顯著提高。
全文摘要
本發(fā)明為一種提高當(dāng)歸多糖免疫增強(qiáng)活性的硒化修飾方法，屬于中藥多糖的結(jié)構(gòu)改造技術(shù)領(lǐng)域。提取、純化當(dāng)歸多糖，用硝酸-亞硒酸鈉法進(jìn)行硒化修飾，以產(chǎn)物的增強(qiáng)免疫活性為指標(biāo)，用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)對亞硒酸鈉用量、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間3因素進(jìn)行優(yōu)選，確定最佳修飾條件為亞硒酸鈉用量200mg(500mg當(dāng)歸多糖)，反應(yīng)溫度70℃，反應(yīng)時間6h。本發(fā)明能顯著提高當(dāng)歸多糖的增強(qiáng)免疫活性。
文檔編號C08B37/00GK102718882SQ20121022604
公開日2012年10月10日 申請日期2012年7月3日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月3日
發(fā)明者劉家國, 姚萬玲, 王德云, 秦韜, 胡元亮 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)