專利名稱：一種制備多功能納米載體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制備多功能納米載體的方法，尤其是利用退溶技術(shù)和層層組裝修飾技術(shù)相結(jié)合制備多功能納米微粒的方法。
背景技術(shù)：
藥物納米載體包括脂質(zhì)體、膠束、納米乳、聚合物納米粒、固體脂質(zhì)納米粒、柔性囊泡，經(jīng)表面修飾后可獲得可控的生物學(xué)性質(zhì)，進(jìn)而在治療或診斷上同時(shí)執(zhí)行多種重要功能。 納米技術(shù)對(duì)醫(yī)學(xué)發(fā)展具有重要的推動(dòng)作用，疾病診斷、預(yù)防和治療的實(shí)際需求對(duì)納米技術(shù)提出了獲得更先進(jìn)的藥物傳輸系統(tǒng)和早期檢測(cè)與診斷技術(shù)的期望，如早期診斷和預(yù)警；代謝產(chǎn)物中的生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)及其微量或痕跡量或瞬間的樣品量的檢測(cè)技術(shù)；適于大量或批量的實(shí)用檢測(cè)技術(shù)平臺(tái)；靶向、緩釋、可控的藥物載體等。
理想的納米藥物載體具備以下性質(zhì)①具有較高的載藥量；②具有較高的包封率；③有適宜的制備及提純方法載體材料可生物降解，毒性較低或沒有毒性具有適當(dāng)?shù)牧脚c粒形；⑥具有較長(zhǎng)的體內(nèi)循還時(shí)間。延長(zhǎng)納米粒在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間，能使所載的有效成分濃度增大且循環(huán)時(shí)間延長(zhǎng)，這樣藥物能更好地發(fā)揮全身治療或診斷作用，增強(qiáng)藥物在病灶靶部位的療效。
近年來，發(fā)展了許多新的納米載體的制備方法，如多嵌段共聚物形成膠束或囊泡、 脂質(zhì)體、樹枝狀聚合物等。其中，由于蛋白的可降解性和生物相容性，以蛋白質(zhì)為原料采用退溶法得到尺寸均勻可控的納米粒子的方法被廣泛應(yīng)用。而這種方法制備的蛋白納米粒子缺乏多功能和良好的穩(wěn)定性，需要對(duì)其表面進(jìn)行修飾以達(dá)到多功能性。而以膠體微粒為模板，利用層層自組裝技術(shù)在模板粒子上組裝聚合物超薄膜，具有結(jié)構(gòu)和性能可控、易賦予各種獨(dú)特功能等特點(diǎn)。尤其是各種活性基團(tuán)為下一步接枝靶向分子奠定了基礎(chǔ)。納米微粒及其表面包覆的多層膜的滲透性以及包埋物質(zhì)的釋放性能可以通過環(huán)境條件如溫度、離子種類和離子強(qiáng)度、PH值、溶液性質(zhì)、光、電、聲等進(jìn)行控制。因此在藥物控制釋放、酶的包埋與催化反應(yīng)、組織工程等領(lǐng)域顯示了十分重要的應(yīng)用前景。結(jié)合退溶技術(shù)和層層組裝技術(shù)可以使充分發(fā)揮各自優(yōu)勢(shì)，制備出多功能納米載體。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種通過退溶技術(shù)和層層組裝修飾技術(shù)制備多功能納米載體的方法。
本發(fā)明的制備多功能納米載體的方法，包括以下步驟1)將濃度為100mg/mL的蛋白質(zhì)水溶液,調(diào)至pH=7;在磁力攪拌下，以0. 5mL/min的速度加入乙醇，蛋白質(zhì)水溶液與乙醇的體積比I :4，持續(xù)攪拌，然后加入0.8 % w/v戊二醛交聯(lián)劑，戍二醒與蛋白質(zhì)質(zhì)量比為I U g :lmg,反應(yīng)6小時(shí),離心洗漆,凍干,得到蛋白質(zhì)納米粒子;2)將相對(duì)分子質(zhì)量為2000的一端帶有羧基、一端帶有醛基的聚乙二醇加入lOmg/mL的相對(duì)分子質(zhì)量為15000的聚烯丙基胺或者相對(duì)分子質(zhì)量為15000聚賴氨酸溶液中，保持二者的質(zhì)量比為4. 3 :1，調(diào)節(jié)混合溶液pH值為8. 5，反應(yīng)6小時(shí)后透析，凍干，得到聚烯丙基胺-g_聚乙二醇-COOH或聚賴氨酸-g-聚乙二醇-COOH ；3)將聚陽離子、聚陰離子和聚烯丙基胺-g_聚乙二醇-COOH分別溶解于IMNaCl溶液中，各配成2mg/mL的聚電解質(zhì)溶液；或者將聚陽離子、聚陰離子和聚賴氨酸-g-聚乙二醇-COOH分別溶解于IM NaCl溶液中，各配成2mg/mL的聚電解質(zhì)溶液；4)取步驟I)制備的蛋白質(zhì)納米粒子分散于水中，得到濃度為0.5% w/w蛋白質(zhì)粒子懸浮液，于離心管中超聲分散，離心除去上清液；往離心管中加入ImL三蒸水，超聲分散；加入步驟3)配制的聚陽離子溶液0. 5mL，孵化15min，期間輕微振蕩離心管；離心去上清，水洗， 得到吸附聚陽離子的蛋白質(zhì)納米粒子懸浮液，然后加入步驟3)配制的0. 5mL聚陰離子溶液，孵化15min，期間輕微振蕩，離心去上清，水洗；重復(fù)以上過程，在納米粒子表面交替吸附帶相反電荷的聚電解質(zhì)，組裝2個(gè)雙層后得到表面為聚陰離子的核殼結(jié)構(gòu)的納米粒子；5)將步驟4)所得的核殼結(jié)構(gòu)的納米粒子分散到ImL三蒸水中，超聲30s，加入0.5mL 步驟3)配制的聚烯丙基胺-g_聚乙二醇-COOH或者聚賴氨酸-g_聚乙二醇-C00H，反應(yīng) 15min,期間輕微振蕩，然后離心去上清，水洗，得到表面為聚烯丙基胺-g_聚乙二醇-COOH 或聚賴氨酸-g_聚乙二醇-COOH的納米粒子；6)將步驟5)所得的微粒分散到ImL三蒸水中，超聲30s，加入0.5mL I. 5mg/mL N-羥基琥珀酰亞胺溶液，孵化15min ;再加入0. 5mL I. 5mg/mL的N- 二甲胺基丙基-N，-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和6 ii g/mL適配體分子,反應(yīng)20min,離心去上清,水洗,得到多功能納米載體。
本發(fā)明中所說的蛋白質(zhì)是牛血清白蛋白、人血清白蛋白或明膠；所說聚陽離子是聚烯丙基胺鹽酸鹽、聚二烯丙基二甲基季銨鹽、殼聚糖、膠原、聚賴氨酸、陽離子化葡聚糖、 陽離子化聚丙烯酸酯或聚乙烯亞胺；所說聚陰離子是聚苯乙烯磺酸鈉、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、硫酸軟骨素、硫酸肝素、透明質(zhì)酸、硫酸葡聚糖、DNA或羧甲基纖維素鈉。
本發(fā)明的原理是在蛋白質(zhì)溶液中，逐漸滴加蛋白質(zhì)的不良溶劑乙醇，蛋白質(zhì)則會(huì)逐漸沉淀出來，形成微小的納米粒子，通過化學(xué)交聯(lián)使納米粒子的結(jié)構(gòu)得以穩(wěn)定，從而得到在水中能夠穩(wěn)定存在的納米粒子；通過層層組裝可以提高納米粒子的膠體穩(wěn)定性，減少聚集及大顆粒的形成；最后通過組裝接枝有聚乙二醇(PEG)的聚烯丙基胺-g_聚乙二醇-C00H，可以進(jìn)一步減少粒子間的聚集，同時(shí)利用PEG端基的羧基在N-羥基琥珀酰亞胺 (NHS)/N-二甲胺基丙基-N’ -乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)作用下，共價(jià)偶聯(lián)靶向分子適配體，該適配體對(duì)癌細(xì)胞有高親和性，可實(shí)現(xiàn)粒子的靶向傳遞。
本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明材料來源廣泛，可控性好，靈活性好，適合多種多功能粒子的制備；得到的納米微粒，具有良好的穩(wěn)定性和靶向癌細(xì)胞等特點(diǎn)，有良好的應(yīng)用前景。


圖I是牛血清白蛋白(BSA)納米粒子的透射電鏡照片。
圖2是(PAH/PSS)2多層膜修飾BSA納米粒子干燥后的透射電鏡照片。
圖3是(PAH/PSS) 2/PAH-g-PEG-C00H多層膜修飾BSA納米粒子干燥后的透射電鏡照片。
圖4 是(PAH/PSS)2/PAH-g-PEG-AS1411 (AS1411，一種適配體)多層膜修飾 BSA 納米粒子干燥后的透射電鏡照片。
圖5是(PLL/h印arin) 2/PLL_g_PEG多層膜修飾BSA納米粒子干燥后的透射電鏡照片。
具體實(shí)施方式
以下結(jié)合實(shí)例進(jìn)一步說明本發(fā)明，但這些實(shí)例并不用來限制本發(fā)明。
實(shí)施例I1)將濃度為lOOmg/mL的牛血清白蛋白(BSA)水溶液，調(diào)至pH=7;在磁力攪拌下，以0.5mL/min的速度加入乙醇，水溶液與乙醇的體積比I :4，持續(xù)攪拌，然后加入0. 8% w/v戊二醒，使交聯(lián)劑與BSA的質(zhì)量比為I y g lmg,反應(yīng)6小時(shí)，離心洗滌3次，凍干，得到BSA納米粒子，其透射電鏡圖見圖I ;2)將一定量的相對(duì)分子質(zhì)量為2000的一端帶有羧基、一端帶有醛基的聚乙二醇加入 10mg/mL的相對(duì)分子質(zhì)量為15000的聚烯丙基胺溶液中，保持二者的質(zhì)量比為4. 3 :1，調(diào)節(jié)溶液PH值為8. 5，反應(yīng)6小時(shí)后透析，凍干，得到聚烯丙基胺-g_聚乙二醇-COOH ；3)將聚苯乙烯磺酸鈉(PSS)、聚烯丙基胺鹽酸鹽(PAH)和聚烯丙基胺-g_聚乙二醇-COOH分別溶解于IM NaCl溶液中，各配成2mg/mL的溶液；4)取一定量步驟I)制備的蛋白質(zhì)納米粒子分散于水中，得到濃度為0.5% w/w蛋白質(zhì)粒子懸浮液，于離心管中超聲分散，離心除去上清液；往離心管中加入ImL三蒸水，超聲分散；加入步驟3)配制的PAH溶液0. 5mL，孵化15min，期間輕微振蕩離心管；離心去上清，水洗，得到吸附PAH的蛋白質(zhì)納米粒子懸浮液，然后加入步驟3)配制的0. 5mL PSS溶液，孵化 15min,期間輕微振蕩，離心去上清，水洗；重復(fù)以上過程，在BSA納米粒子表面交替吸附PAH 和PSS，組裝2個(gè)雙層后得到PSS為表面層的核殼結(jié)構(gòu)的納米粒子，其透射電鏡圖見圖2 ；5)將步驟4)所得的微粒分散到ImL三蒸水中，超聲30s，加入0.5 mL 2mg/mL聚烯丙基胺-g_聚乙二醇-COOH水溶液，孵化15min，期間輕微振蕩，然后離心去上清，水洗三次，得到包覆PEG的納米粒子，其透射電鏡圖見圖3 ；6)將步驟5)所得的納米粒子分散到ImL三蒸水中，超聲30s，加入0.5mL I. 5mg/mL N-輕基琥拍酰亞胺溶液,孵化15min ;加入0. 5mL I. 5mg/mL的碳二亞胺和6 ii g/mL氨基修飾的適配體，反應(yīng)20min，離心去上清，水洗三次，得到多功能納米粒子，其透射電鏡圖見圖4。
實(shí)施例2步驟同實(shí)例1，但在步驟2)中是將相對(duì)分子質(zhì)量為2000的一端帶有羧基、一端帶有醛基的聚乙二醇加入lOmg/mL的相對(duì)分子質(zhì)量為15000聚賴氨酸溶液中，保持二者的質(zhì)量比為4. 3 調(diào)節(jié)混合溶液pH值為8. 5,反應(yīng)6小時(shí)后透析,凍干,合成的是聚賴氨酸-g_聚乙二醇-COOH ;在步驟3) -5)中使用聚賴氨酸(PLL)溶液代替2mg/mL的PAH溶液，肝素 (11印&1^11)溶液代替PSS溶液，聚賴氨酸-g-聚乙二醇-COOH溶液代替聚烯丙基胺-g_聚乙二醇-COOH溶液，所得多功能納米微粒的透射電鏡圖見圖5。
實(shí)施例3步驟同實(shí)例1，但在步驟3)和4)中使用聚賴氨酸溶液代替PAH溶液，肝素溶液代替PSS溶液。
實(shí)施例4步驟同實(shí)例I，但在步驟3)和4)中使用殼聚糖溶液代替PAH溶液，硫酸軟骨素溶液代替PSS溶液。
實(shí)施例5步驟同實(shí)例1，但在步驟I中用人血清白蛋白代替牛血清白蛋白，在步驟3)和4)中使用聚乙烯亞胺溶液代替PAH溶液，透明質(zhì)酸溶液代替PSS溶液。
實(shí)施例6步驟同實(shí)例1，但在步驟I)中用明膠代替牛血清白蛋白，在步驟3)和4)中使用陽離子化葡聚糖溶液代替PAH溶液，DNA溶液代替PSS溶液。
表I是具有不同最外層的粒子在不同介質(zhì)中的穩(wěn)定性對(duì)比。
表ITopHfiPBSMedium (10%FBS)BSA214(0. 06)634(0. 26)247(0.18)PSS222(0. 10)agglomeration487(0. 21)PAH699(0. 19)agglomeration443(0. 24)PAH(15)-g-PEG(2)9267(0. 18)435(0. 19)267(0. 19)PAH(15)-g-PEG(2)25.6290(0. 11)284(0. 08)253(0. 23)PAH-g-PEG-COOH41.7296(0. 12)287(0. 10)260(0. 20)PAH-g-PEG41.7-Apt290(0. 12)288(0. 11)265(0. 19)Heparin527(0. 11)Agglomeration550(0. 19)PLL-g-PEG5.3278————PLL-g-PEGn. 9277————PLL-g-PEG20.4266————
權(quán)利要求
1.一種制備多功能納米載體的方法，包括以下步驟1)將濃度為100mg/mL的蛋白質(zhì)水溶液,調(diào)至pH=7;在磁力攪拌下，以0. 5mL/min的速度加入乙醇，蛋白質(zhì)水溶液與乙醇的體積比I :4，持續(xù)攪拌，然后加入0.8 % w/v戊二醛交聯(lián)劑，戍二醒與蛋白質(zhì)質(zhì)量比為I U g :lmg,反應(yīng)6小時(shí),離心洗漆,凍干,得到蛋白質(zhì)納米粒子;2)將相對(duì)分子質(zhì)量為2000的一端帶有羧基、一端帶有醛基的聚乙二醇加入lOmg/mL的相對(duì)分子質(zhì)量為15000的聚烯丙基胺或者相對(duì)分子質(zhì)量為15000聚賴氨酸溶液中，保持二者的質(zhì)量比為4. 3 :1，調(diào)節(jié)混合溶液pH值為8. 5，反應(yīng)6小時(shí)后透析，凍干，得到聚烯丙基胺-g_聚乙二醇-COOH或聚賴氨酸-g-聚乙二醇-COOH ；3)將聚陽離子、聚陰離子和聚烯丙基胺-g_聚乙二醇-COOH分別溶解于IMNaCl溶液中，各配成2mg/mL的聚電解質(zhì)溶液；或者將聚陽離子、聚陰離子和聚賴氨酸-g-聚乙二醇-COOH分別溶解于IM NaCl溶液中，各配成2mg/mL的聚電解質(zhì)溶液；4)取步驟I)制備的蛋白質(zhì)納米粒子分散于水中，得到濃度為0.5% w/w蛋白質(zhì)粒子懸浮液，于離心管中超聲分散，離心除去上清液；往離心管中加入ImL三蒸水，超聲分散；加入步驟3)配制的聚陽離子溶液0. 5mL，孵化15min，期間輕微振蕩離心管；離心去上清，水洗， 得到吸附聚陽離子的蛋白質(zhì)納米粒子懸浮液，然后加入步驟3)配制的0. 5mL聚陰離子溶液，孵化15min，期間輕微振蕩，離心去上清，水洗；重復(fù)以上過程，在納米粒子表面交替吸附帶相反電荷的聚電解質(zhì)，組裝2個(gè)雙層后得到表面為聚陰離子的核殼結(jié)構(gòu)的納米粒子；5)將步驟4)所得的核殼結(jié)構(gòu)的納米粒子分散到ImL三蒸水中，超聲30s，加入0.5 mL 步驟3)配制的聚烯丙基胺-g_聚乙二醇-COOH或者聚賴氨酸-g_聚乙二醇-C00H，反應(yīng) 15min,期間輕微振蕩，然后離心去上清，水洗，得到表面為聚烯丙基胺-g_聚乙二醇-COOH 或聚賴氨酸-g_聚乙二醇-COOH的納米粒子；6)將步驟5)所得的微粒分散到ImL三蒸水中，超聲30s，加入0.5mL I. 5mg/mL N-羥基琥珀酰亞胺溶液，孵化15min ;再加入0. 5mL I. 5mg/mL的N- 二甲胺基丙基-N，-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和6 ii g/mL適配體分子,反應(yīng)20min,離心去上清,水洗,得到多功能納米載體。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備多功能納米載體的方法，其特征是所說的蛋白質(zhì)是牛血清白蛋白、人血清白蛋白或者明膠。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備多功能納米載體的方法，其特征是所說的聚陽離子是聚烯丙基胺鹽酸鹽、聚二烯丙基二甲基季銨鹽、殼聚糖、膠原、聚賴氨酸、陽離子化葡聚糖、陽離子化聚丙烯酸酯或聚乙烯亞胺。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備多功能納米載體的方法，其特征是所說的聚陰離子是聚苯乙烯磺酸鈉、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、硫酸軟骨素、硫酸肝素、透明質(zhì)酸、硫酸葡聚糖、 DNA或羧甲基纖維素鈉。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種通過退溶技術(shù)和層層組裝修飾技術(shù)制備多功能納米載體的方法。在攪拌條件下，在蛋白質(zhì)的水溶液中,逐漸滴加不良溶劑乙醇，使蛋白質(zhì)從溶液中逐漸析出并沉淀出來納米粒子；加入戊二醛交聯(lián)劑穩(wěn)定納米粒子結(jié)構(gòu)后，用水洗滌；在納米粒子表面交替沉積多層聚電解質(zhì)膜，最外層沉積接枝有短鏈聚氧乙烯的聚電解質(zhì)，得到聚電解質(zhì)修飾的納米粒子；進(jìn)一步在聚氧乙烯的羧基端固定靶向分子適配體，從而得到多功能納米載體。本發(fā)明制備方法簡(jiǎn)單、材料來源廣泛、生產(chǎn)效率高，得到的納米粒子具有良好的穩(wěn)定性和靶向癌細(xì)胞等特點(diǎn)，有良好的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C08G81/00GK102532580SQ201210024989
公開日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2012年2月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月6日
發(fā)明者仝維鋆, 謝黎黎, 高長(zhǎng)有 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)