專利名稱：一種抗癌的黃綠蜜環(huán)菌多糖及提取工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了一種新型抗癌活性多糖——綠蜜環(huán)菌多糖及其提取工藝，黃綠蜜環(huán)菌多糖在抑制腫瘤生長、侵襲與轉(zhuǎn)移方面具有很好的療效，與化療藥物同時(shí)使用能夠起到減毒增效之作用，可制備成預(yù)防和治療腫瘤的藥物或保健品。二、技術(shù)背景癌癥是一種世界性的疾病，已經(jīng)成為導(dǎo)致人類死亡的重要病種。世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究中心日前公布的一份研究報(bào)告表明，根據(jù)目前癌癥的發(fā)病趨勢(shì)， 2020年全世界癌癥發(fā)病率將比現(xiàn)在增加50%，全球每年新增癌癥患者人數(shù)將達(dá)到1500萬人。目前，我國每年新發(fā)癌癥病例200萬人，因癌癥死亡人數(shù)為140萬。癌癥死亡率比90 年代初期增加了 22.5%，更可怕的是，癌癥發(fā)病年齡提前了 15-20年。眾多的癌癥患者，無疑形成了一個(gè)龐大的抗癌癥藥物市場。當(dāng)前癌癥臨床治療方法主要包括機(jī)械治療(手術(shù)治療和放射治療)和藥物治療。 機(jī)械治療同時(shí)也需藥物輔助治療，藥物治療多用化療藥，雖然近年來國外相繼開發(fā)出許多針對(duì)性強(qiáng)、療效較好的新型化療藥，但多數(shù)化療藥物都伴隨有不同程度的毒副作用，化療藥物最大的副作用是缺乏對(duì)腫瘤細(xì)胞的選擇性殺傷，殺傷癌細(xì)胞的同時(shí)，也損害造血系統(tǒng)和胃腸道系統(tǒng)，有些藥物對(duì)心臟、肝臟有明顯的毒性，化療還可產(chǎn)生延遲或遠(yuǎn)期的副作用。因此誠待開發(fā)療效好、毒副作用小的新型抗癌藥，以及緩解化療藥毒副作用的輔助藥物。黃綠蜜環(huán)菌(Armillaria luteovirens)，又名黃蘑菇，黃環(huán)菌，是一種名貴食用菌，也是一種重要的高原生物資源，主要分布于青海、西藏、四川、甘肅，其海拔分布范圍約為3000-4300m，其中以祁連的黃蘑菇最為質(zhì)優(yōu)。黃綠蜜環(huán)菌鮮味獨(dú)特，口感極佳，頗受世人歡迎。它的蛋白質(zhì)含量極高，富含各種營養(yǎng)物質(zhì)，具有較高的營養(yǎng)價(jià)值和食療保健作用，但目前黃綠蜜環(huán)菌多僅用于食用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種新型抗癌活性多糖一黃綠蜜環(huán)菌多糖，用于預(yù)防和治療腫瘤；本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種簡單高效、無污染、低能耗、易推廣的黃綠蜜環(huán)菌多糖提取工藝。本發(fā)明的技術(shù)方案為本發(fā)明黃綠蜜環(huán)菌多糖的提取工藝，包括如下步驟(1)采摘新鮮黃綠蜜環(huán)菌，經(jīng)清洗、勻漿，真空冷凍干燥后，粉碎，過40-120目篩， 得黃綠蜜環(huán)菌粉；(2)上述黃綠蜜環(huán)菌粉加6-14倍體積蒸餾水勻漿，超聲處理后8-35分鐘后得到黃綠蜜環(huán)菌勻漿液；(3)上述黃綠蜜環(huán)菌勻漿液加15-25倍體積蒸餾水，60-80°C水浴提取0. 2-0. 8小時(shí)，提取三次，3000rpm離心5_15分鐘，提取液合并，得到黃綠蜜環(huán)菌多糖提取液；(4)上述黃綠蜜環(huán)菌多糖提取液濃縮后加入適量乙醇，使醇沉濃度達(dá)到87-93%， 醇沉18-30小時(shí)，3000rpm離心5_15分鐘，得到黃綠蜜環(huán)菌多糖沉淀；(5)上述黃綠蜜環(huán)菌多糖沉淀經(jīng)真空冷凍干燥后得到黃綠蜜環(huán)菌多糖；
步驟⑴中采用真空冷凍干燥處理原材料，可以使材料在較低的溫度下干燥，以避免高溫破壞黃綠蜜環(huán)菌多糖成分。步驟( 在提取多糖前，對(duì)材料進(jìn)行超聲波預(yù)處理，利用超聲波破碎細(xì)胞壁，從而有助于多糖的溶出，縮短了多糖提取的時(shí)間，提高了多糖提取的效率。步驟C3) (4)所用的水提醇沉條件是通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)得到的最佳提取工藝。步驟( 所采用真空冷凍干燥法制備黃綠蜜環(huán)菌多糖，避免了高溫加熱對(duì)多糖活性的破壞，且所得固體產(chǎn)品易粉碎，易于進(jìn)行下一步的純化研究。本發(fā)明的黃綠蜜環(huán)菌多糖在使用時(shí)，可以將其與藥學(xué)上常用的輔料制備成注射劑、膠囊劑、滴丸劑、片劑、顆粒劑、散劑、口服液等。所述輔料包含稀釋劑如乳糖、木糖醇、甘露醇、甲殼胺等，根據(jù)選擇劑型的不同，可以按照現(xiàn)有的常規(guī)制劑方法選擇不同的輔料。可以選擇的崩解劑如羧甲基淀粉鈉、微晶纖維素等；粘合劑如聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纖維素鈉、低取代羥丙基纖維素、聚乙二醇等；穩(wěn)定劑如山梨酸、對(duì)羥基苯甲酸酯、乙醇、枸櫞酸等；包合劑如α -環(huán)糊精、β -環(huán)糊精和N-LOK變性淀粉等；包衣劑如羥丙基甲基纖維素、聚乙二醇、丙烯酸樹脂等；矯味劑如蜂蜜、蔗糖等。本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)(1)本發(fā)明提供的黃綠蜜環(huán)菌多糖，其對(duì)腫瘤有良好的預(yù)防和治療效果，且?guī)缀鯚o毒副作用。(2)本發(fā)明提供的黃綠蜜環(huán)菌多糖提取工藝，采用了單因素實(shí)驗(yàn)和正交試驗(yàn)法優(yōu)選最佳提取工藝，提取率高；采用超聲輔助提取多糖，縮短了多糖提取的時(shí)間，提高了多糖提取的效率；采用水提醇沉法，工藝流程簡單，能耗低，設(shè)備投入小，易于推廣到工業(yè)生產(chǎn)中；所使用的溶媒為水和乙醇，均安全無毒，價(jià)格低廉，且這兩種有機(jī)溶劑可回收利用，對(duì)環(huán)境的污染??；所得黃綠蜜環(huán)菌多糖含量高，活性強(qiáng)，可直接作為食品添加劑，以及直接作為抗癌藥品或保健品的原料。黃綠蜜環(huán)菌多糖對(duì)荷瘤(肝癌H22)小鼠的抗癌作用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物CD-(ICR)小鼠，雌雄各半，體重19_21g。藥物劑量及給藥方式將實(shí)施例2所得的黃綠蜜環(huán)菌多糖顆粒作為供試藥物，取 50只小鼠，隨機(jī)分為5組，大、中、小劑量組分別按552，276，138mg/kg劑量每天灌胃，連續(xù) 13天，荷瘤對(duì)照組以等體積蒸餾水灌胃，陽性對(duì)照環(huán)磷酰胺(來源)組腹腔注射給藥。評(píng)價(jià)方法末次給藥M小時(shí)后，各組動(dòng)物頸椎脫白處死，解剖并剝離瘤體，摘取胸腺、脾，電子天平稱重，以t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。結(jié)果顯示陽性對(duì)照藥環(huán)磷酰胺可明顯抑制荷瘤(肝癌H22)小鼠瘤體重量，但使小鼠體重減輕。ALP高、中、低三個(gè)劑量組都能明顯減輕荷瘤(肝癌H22)小鼠瘤體重量，中劑量組的效果相對(duì)較差；三個(gè)劑量組均使小鼠體重增長且明顯高于陽性對(duì)照藥環(huán)磷酰胺組，高劑量組明顯高于荷瘤對(duì)照組。體重是衡量藥物毒性作用的綜合性指標(biāo)之一，ALP給藥組使荷瘤小鼠體重增加的速度加快，而環(huán)磷酰胺組則明顯的降低小鼠的體重，說明ALP在抑制腫瘤的同時(shí)對(duì)小鼠沒有明顯的副作用，或者說與陽性對(duì)照藥環(huán)磷酰胺組相比，毒副作用較小。三個(gè)劑量組對(duì)小鼠胸腺、脾指數(shù)均高于環(huán)磷酰胺組，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。取小鼠骨髓，檢測(cè)骨髓有核細(xì)胞數(shù)，結(jié)果顯示環(huán)磷酰胺組小鼠有核細(xì)胞數(shù)比正常小鼠降低80%，說明化療藥物嚴(yán)重?fù)p傷小鼠免疫能力；而黃綠蜜環(huán)菌多糖口服治療組小鼠的骨髓有核細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組無顯著差異。取瘤體進(jìn)行RNA的提取，并以之作為模板，用針對(duì)鼠源性的VEGF(血管內(nèi)皮生長因子)的引物進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。我們發(fā)現(xiàn)相對(duì)于生理鹽水組來說，低劑量、中劑量和高劑量的黃綠蜜環(huán)菌多糖組都能明顯地抑制腫瘤組織中VEGF的表達(dá)。結(jié)果表明，黃綠蜜環(huán)菌多糖具有抑制腫瘤的作用。黃綠蜜環(huán)菌多糖的免疫促進(jìn)作用以C57小鼠為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停?0只小鼠，隨機(jī)分為4組。將實(shí)施例2所得的黃綠蜜環(huán)菌多糖顆粒作為供試藥物處理環(huán)磷酰胺組，大、中、小劑量組分別按陽2，276，138mg/kg劑量每天灌胃，對(duì)照組采用生理鹽水灌胃，連續(xù)2周。然后，取脾臟的B淋巴細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。取106的B細(xì)胞，用Balb/c小鼠的淋巴細(xì)胞作為抗原刺激，4天后加入3H-TdR摻入細(xì)胞，18小時(shí)后收細(xì)胞，利用液閃測(cè)定同位素的摻入，以此來檢測(cè)小鼠的免疫增強(qiáng)情況。將常對(duì)照組的3H-TdR摻入的增高比率定為100%，則低劑量、中劑量和高劑量的黃綠蜜環(huán)菌多糖組的增高比率分別為132%、147%和196%，這證實(shí)了口服黃綠蜜環(huán)菌多糖能夠刺激B 細(xì)胞的增殖從而激發(fā)機(jī)體的體液免疫。取小鼠脾臟淋巴細(xì)胞進(jìn)行RNA的提取，并以之作為模板，用針對(duì)鼠源性的TNF-α， IL-2和β-Actin的引物進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。我們發(fā)現(xiàn)相對(duì)于生理鹽水組來說，低劑量、中劑量和高劑量的黃綠蜜環(huán)菌多糖組都能明顯地增加TNF-α與IL-2的表達(dá)。取脾臟檢測(cè)小鼠⑶4Τ/⑶8Τ，黃綠蜜環(huán)菌多糖組小鼠顯著高于對(duì)照組，說明黃綠蜜環(huán)菌多糖能夠明顯刺激CD4T淋巴細(xì)胞的增殖，具有免疫促進(jìn)作用。由于本申請(qǐng)為一種新藥，目前還沒有做人體臨床實(shí)驗(yàn)，為搶申請(qǐng)日故在未做人體臨床實(shí)驗(yàn)前就申請(qǐng)。
四、具體實(shí)施方案實(shí)施例1 (1)采摘新鮮黃綠蜜環(huán)菌，經(jīng)清洗、勻漿，真空冷凍干燥后，粉碎，過40目篩，得黃綠蜜環(huán)菌粉； (2)上述黃綠蜜環(huán)菌粉加6倍體積蒸餾水勻漿，超聲處理后8分鐘后得到黃綠蜜環(huán)菌勻漿液；(3)上述黃綠蜜環(huán)菌勻漿液加15倍體積蒸餾水，60°C水浴提取0. 2小時(shí)，提取三次，3000rpm離心5分鐘，提取液合并，得到黃綠蜜環(huán)菌多糖提取液；(4)上述黃綠蜜環(huán)菌多糖提取液濃縮后加入適量乙醇，使醇沉濃度達(dá)到87%，醇沉18小時(shí)，3000rpm離心5分鐘，得到黃綠蜜環(huán)菌多糖沉淀；(5)上述黃綠蜜環(huán)菌多糖沉淀經(jīng)真空冷凍干燥后得到黃綠蜜環(huán)菌多糖；實(shí)施例2 :(1)采摘新鮮黃綠蜜環(huán)菌，經(jīng)清洗、勻漿，真空冷凍干燥后，粉碎，過120 目篩，得黃綠蜜環(huán)菌粉；(2)上述黃綠蜜環(huán)菌粉加14倍體積蒸餾水勻漿，超聲處理后35分鐘后得到黃綠蜜環(huán)菌勻漿液；(3)上述黃綠蜜環(huán)菌勻漿液加25倍體積蒸餾水，80°C水浴提取0. 8小時(shí)，提取三次，3000rpm離心15分鐘，提取液合并，得到黃綠蜜環(huán)菌多糖提取液；(4)上述黃綠蜜環(huán)菌多糖提取液濃縮后加入適量乙醇，使醇沉濃度達(dá)到93%，醇沉30小時(shí)，3000rpm離心15分鐘，得到黃綠蜜環(huán)菌多糖沉淀；(5)上述黃綠蜜環(huán)菌多糖沉淀經(jīng)真空冷凍干燥后得到黃綠蜜環(huán)菌多糖；實(shí)施例3 :(1)采摘新鮮黃綠蜜環(huán)菌，經(jīng)清洗、勻漿，真空冷凍干燥后，粉碎，過80目篩，得黃綠蜜環(huán)菌粉；(2)上述黃綠蜜環(huán)菌粉加9倍體積蒸餾水勻漿，超聲處理后25分鐘后得到黃綠蜜環(huán)菌勻漿液；(3)上述黃綠蜜環(huán)菌勻漿液加20倍體積蒸餾水，70°C水浴提取0. 5小時(shí)，提取三次，3000rpm離心8分鐘，提取液合并，得到黃綠蜜環(huán)菌多糖提取液；(4)上述黃綠蜜環(huán)菌多糖提取液濃縮后加入適量乙醇，使醇沉濃度達(dá)到90%，醇沉M小時(shí)，3000rpm離心8分鐘，得到黃綠蜜環(huán)菌多糖沉淀；(5)上述黃綠蜜環(huán)菌多糖沉淀經(jīng)真空冷凍干燥后得到黃綠蜜環(huán)菌多糖。
權(quán)利要求
1.一種抗癌的黃綠蜜環(huán)菌多糖，其特征是它由如下提取工藝步驟制得(1)采摘新鮮黃綠蜜環(huán)菌，經(jīng)清洗、勻漿，真空冷凍干燥后，粉碎，過40-120目篩，得黃綠蜜環(huán)菌粉；(2)上述黃綠蜜環(huán)菌粉加6-14倍體積蒸餾水勻漿，超聲處理后8-35分鐘后得到黃綠蜜環(huán)菌勻漿液；(3)上述黃綠蜜環(huán)菌勻漿液加15-25倍體積蒸餾水，60-80°C水浴提取0.2-0. 8小時(shí)，提取三次，3000rpm離心5_15分鐘，提取液合并，得到黃綠蜜環(huán)菌多糖提取液；(4)上述黃綠蜜環(huán)菌多糖提取液濃縮后加入適量乙醇，使醇沉濃度達(dá)到87-93%，醇沉 18-30小時(shí)，3000rpm離心5_15分鐘，得到黃綠蜜環(huán)菌多糖沉淀；(5)上述黃綠蜜環(huán)菌多糖沉淀經(jīng)真空冷凍干燥后得到黃綠蜜環(huán)菌多糖。
2.一種抗癌的黃綠蜜環(huán)菌多糖的提取工藝，其特征是它包括如下步驟完成(1)采摘新鮮黃綠蜜環(huán)菌，經(jīng)清洗、勻漿，真空冷凍干燥后，粉碎，過40-120目篩，得黃綠蜜環(huán)菌粉；(2)上述黃綠蜜環(huán)菌粉加6-14倍體積蒸餾水勻漿，超聲處理后8-35分鐘后得到黃綠蜜環(huán)菌勻漿液；(3)上述黃綠蜜環(huán)菌勻漿液加15-25倍體積蒸餾水，60-80°C水浴提取0.2-0. 8小時(shí)，提取三次，3000rpm離心5_15分鐘，提取液合并，得到黃綠蜜環(huán)菌多糖提取液；(4)上述黃綠蜜環(huán)菌多糖提取液濃縮后加入適量乙醇，使醇沉濃度達(dá)到87-93%，醇沉 18-30小時(shí)，3000rpm離心5_15分鐘，得到黃綠蜜環(huán)菌多糖沉淀；(5)上述黃綠蜜環(huán)菌多糖沉淀經(jīng)真空冷凍干燥后得到黃綠蜜環(huán)菌多糖。
全文摘要
本發(fā)明一種抗癌的黃綠蜜環(huán)菌多糖及其提取工藝，屬藥物或保健品技術(shù)領(lǐng)域。其技術(shù)方案為黃綠蜜環(huán)菌多糖及提取工藝，包括如下步驟(1)采摘新鮮黃綠蜜環(huán)菌，得黃綠蜜環(huán)菌粉；(2)黃綠蜜環(huán)菌粉經(jīng)超聲處理后得黃綠蜜環(huán)菌勻漿液；(3)黃綠蜜環(huán)菌勻漿液經(jīng)提取合并得黃綠蜜環(huán)菌多糖提取液；(4)黃綠蜜環(huán)菌多糖提取液再制得黃綠蜜環(huán)菌多糖沉淀；(5)黃綠蜜環(huán)菌多糖沉淀經(jīng)真空冷凍干燥得黃綠蜜環(huán)菌多糖。本發(fā)明的黃綠蜜環(huán)菌多糖，對(duì)腫瘤有良好的預(yù)防和治療效果，且?guī)缀鯚o毒副作用。其提取工藝，提取率高，工藝流程簡單，能耗低，設(shè)備投入小，易于推廣，使用的溶媒為水和乙醇，這兩種溶劑可回收利用，環(huán)境污染小。
文檔編號(hào)C08B37/00GK102153668SQ201110050699
公開日2011年8月17日 申請(qǐng)日期2011年2月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月23日
發(fā)明者邵赟, 陶燕鐸 申請(qǐng)人:青海紅鼎生物工程有限公司