專(zhuān)利名稱(chēng)：中空微粒主體的制作方法
中空微粒主體本發(fā)明涉及中空微粒主體、制備該主體的方法和該主體在固相過(guò)程中的用途，并且特別涉及中空、有浮力的微粒聚合物主體。該主體在廣泛范圍的物理和化學(xué)方法中是有用的，特別是當(dāng)需要與底物的相互作用時(shí)，例如固相合成、固相萃取、固相試劑、物類(lèi)的固定、細(xì)胞培養(yǎng)、催化、色譜法和在醫(yī)學(xué)診斷中。在固相合成過(guò)程中有用的固體支持材料是已知的。廣泛范圍的物理和化學(xué)方法采用固體支持材料，包括例如有機(jī)分子特別是肽和寡肽的合成、物類(lèi)的固定化、催化劑的支持、離子交換、從材料中萃取物類(lèi)、診斷學(xué)和色譜法。
一般地，有機(jī)分子的多階段合成涉及眾多分離步驟，以在進(jìn)行至后續(xù)階段前，分離在每個(gè)階段時(shí)產(chǎn)生的中間產(chǎn)物。這些過(guò)程通常是費(fèi)時(shí)、昂貴的并且就得率而言可以是沒(méi)有效率的。中間產(chǎn)物通常需要純化，以去除過(guò)量試劑和反應(yīng)副產(chǎn)物，并且可以采用操作步驟例如沉淀、過(guò)濾、雙相溶劑萃取固相萃取、結(jié)晶和色譜法。固相合成提供超過(guò)液相合成的某些優(yōu)點(diǎn)。例如，在液相合成中使用的分離操作步驟可以在一定程度上通過(guò)將靶分子可逆地附著至固相支持物得到避免。過(guò)量試劑和某些副產(chǎn)物可以通過(guò)固相支持物的過(guò)濾和洗滌去除。靶分子可以在某些過(guò)程中以基本上定量的得率回收，所述過(guò)程在液相合成中一般是特別困難的。此外，在固相支持物上執(zhí)行操作所需的時(shí)間一般比在液相合成中執(zhí)行等價(jià)階段所需的少得多。在一系列過(guò)程中物類(lèi)的固定化也是已知的。例如，聚合物支持物通常用于催化劑的固定化以在常規(guī)有機(jī)化學(xué)中使用，包括化學(xué)和生物催化劑。固定化的酶可以用于執(zhí)行有機(jī)化學(xué)反應(yīng)或用于手性分辨，例如，固定化的青霉素酰胺酶用于分辨仲醇的用途(E. Baldaro等人Tet. Asym. 4,1031, (1993),并且固定化的青霉素G酰胺酶在阿莫西林的制造中也用于水解節(jié)基青霉素(Carleysmith, S. W.和 Lilly, M. D. . Biotechnol. Bioeng.，21，1057-73，1979)。固相支持物也用于固定化生物學(xué)大分子用于醫(yī)學(xué)和診斷應(yīng)用。這包括蛋白質(zhì)、単克隆和多克隆抗體的固定化。細(xì)胞培養(yǎng)通常在具有特定表面特征和形態(tài)的固相支持物上執(zhí)行。在珠中固定化的酶可以用作傳感器，以生成信號(hào)。例子是通過(guò)葡萄糖氧化酶/過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的酶系統(tǒng)的葡萄糖檢測(cè)，其中葡萄糖的存在生成過(guò)氧化氫，其進(jìn)而是過(guò)氧化物酶的底物，所述過(guò)氧化物酶用于氧化廣泛多樣的底物，以提供有色、熒光或發(fā)光信號(hào)。其熒光對(duì)特定陽(yáng)離子或陰離子敏感的多種熒光素(fluor)可以用于指示特定離子包括用于PH測(cè)量的氫離子的濃度。聚合微粒通常用在色譜法中，其中固相支持物稱(chēng)為靜止相。在一定模式的色譜法中，靜止相的成本可以是受限的。在其他模式中，靜止相的物理性質(zhì)可以減少技術(shù)的有效性。例如，由于微粒的可變形性質(zhì)，通常用于親和力、離子交換和凝膠滲透層析的柔軟聚合物不能以高流速使用。用于許多其他模式的色譜法的剛性大孔聚合物通?？梢允菣C(jī)械上脆性的且隨后具有短壽命。在色譜分離中應(yīng)用固相支持物或靜止相是非常昂貴的，例如在藥學(xué)和生物技術(shù)エ業(yè)中使用的復(fù)雜高技術(shù)分離和在采礦エ業(yè)中使用的更大規(guī)模過(guò)程。某些藥學(xué)エ業(yè)的最有價(jià)值藥物通過(guò)制備型色譜法純化，并且改善的色譜分離將是技術(shù)上有利和經(jīng)濟(jì)上有利的。在采礦和貴金屬回收エ業(yè)中，全世界的大部分鈀可以使用固定化的冠醚進(jìn)行精煉，所述鈀是廣泛范圍的エ業(yè)應(yīng)用和過(guò)程包括催化轉(zhuǎn)換器和高價(jià)值產(chǎn)品的制造中的關(guān)鍵組分(Traczyk，F(xiàn). P. ；Bruening, R. L. ；Izatt, N. E. fhe Application of Molecular RecognitionTechnologyCMRT)for Removal and Recovery of Metal Ions from Aqueous Solutions ；In Fortschritte in der Hydrometallurgie ； 1998,Vor t rag6beim34. MetallurgischenSeminar des Fachausschusses fuer Metallurgische Aus—und Weiterbildung der GDMB ；18-20 November 1998 ；Goslar)0聚合微粒在固相萃取和固相試劑的制備中的用途也是化學(xué)、藥學(xué)和生物技術(shù)エ業(yè)中已知的。
已知的固相支持物一般包含特定大小和物理性質(zhì)的聚合物微粒，以適合應(yīng)用。為了易于使用，這些聚合物微粒通常是球形的且具有限定的微粒大小分布。微粒的球形性質(zhì)改善聚合物的流動(dòng)和過(guò)濾特征。盡管固相支持物的使用具有操作優(yōu)點(diǎn)，但存在關(guān)于固相方法的缺點(diǎn)。例如，由于例如復(fù)雜的制造過(guò)程，通常用于肽和寡肽的固相合成的商購(gòu)可得支持物可以是昂貴的。一般使用微孔聚合物和大孔聚合物。微孔聚合物具有相對(duì)低水平的交聯(lián)齊 ，其允許聚合物微粒在合適溶劑中成溶劑化物且隨后膨脹。大孔聚合物具有在聚合物基質(zhì)中高水平的交聯(lián)劑且含有大孔。這些聚合物微粒一般是剛性的且具有良好的流動(dòng)特征，并且適合于用于在填充柱中使用。聚合微粒一般可以通過(guò)分散體或乳液聚合過(guò)程進(jìn)行，其中在聚合作用起始前，將単體的溶液分散在不能混合的溶劑(連續(xù)相)中。形成的聚合物微粒一般隨后過(guò)濾、洗滌且分類(lèi)，以分離所需微粒大小分布。這些過(guò)程在某些方面是不利的，包括對(duì)于連續(xù)相的單體喪失，在聚合過(guò)程中一系列微粒大小的生成和細(xì)粒的不希望生成，費(fèi)カ的微粒大小分類(lèi)例如篩分和風(fēng)選。除在制備過(guò)程中不希望有的制造成本和廢物，已知聚合微粒的物理性質(zhì)產(chǎn)生ー些缺點(diǎn)，特別是弱物理穩(wěn)定性。微孔聚合微粒一般是柔軟的，并且一般不適合于在填充柱床中以高流速在色譜應(yīng)用中使用。此外，柔軟微?？赡鼙徊幌Ｍ貕嚎s，并且例如在過(guò)濾過(guò)程中引起污垢，通常導(dǎo)致壓縮侵入進(jìn)入在柱底部使用的燒結(jié)物或網(wǎng)目?jī)?nèi)。剛性大孔和大網(wǎng)格微粒更適合于在填充柱床中的高流速。然而，由于剛性性質(zhì)，微?？梢允谴嘈缘那以谖锢響?yīng)カ下成碎片。這些問(wèn)題被常規(guī)填充操作步驟所惡化，所述常規(guī)填充操作步驟可以包括將聚合物微粒從底部向上插入柱內(nèi)，從而對(duì)聚合物微粒實(shí)施不希望有地大應(yīng)力，并且這可以引起對(duì)微粒的物理削弱或損害，并且致使柱對(duì)于色譜過(guò)程較不有效。我們目前已發(fā)現(xiàn)與已知聚合物微粒相關(guān)的這些及其他問(wèn)題可以通過(guò)提供如下微粒主體得到改進(jìn)，所述微粒主體包含具有中空中心的預(yù)先形成的支持聚合物，任選具有放置于中空中心表面上的聚合物。中空中心提供低密度的微粒主體，適當(dāng)?shù)靥峁┰谝合嘀械母×?。W02008/012064描述了包含聚合物浸潰珠的固相支持物，其中珠在其中具有洞并且聚合物放置于洞中。珠完全是實(shí)心的并且充當(dāng)框架，以支持洞中的聚合物。在產(chǎn)生固相支持物中，聚合物被說(shuō)成在珠上和在洞中形成，并且例如通過(guò)磨損去除在珠的外部上的聚合物。然而，W02008/012064沒(méi)有公開(kāi)或建議珠是中空的或以殼的形式。在第一個(gè)方面，本發(fā)明提供了有浮力的微粒主體，其包含中空微粒和任選地放置于中空微粒外部上的表面聚合物，所述中空微粒包含聚合物。合適的微粒主體是有浮力的。微粒主體適合于在液相中使用，其中微粒主體具有的密度小于液相的密度。優(yōu)選地，微粒主體具有的密度小于lg/cm3、更優(yōu)選小于O. 8g/cm3、且特別小于O. 7g/cm3，使得在ニこ醚中有浮力。在一個(gè)進(jìn)ー步的實(shí)施方案中，微粒主體具有的密度小于O. 5g/cm3、且更特 別O. 3g/cm3或更少。適當(dāng)?shù)兀⒘Ｖ黧w具有的密度為至少O. 005g/cm3、且適當(dāng)?shù)刂辽貽. 01g/cm3。優(yōu)選地，微粒主體具有的密度在范圍O. 01-0. 05g/cm3中、更優(yōu)選O. 01-0. 03g/cm3、例如O. 015g/cm3。希望地,微粒主體可以用于分批操作中，允許快速加工。如本文采用的，術(shù)語(yǔ)“微粒主體”包括微粒支持物，并且可以例如在固相合成中用作支持物。如本文采用的，術(shù)語(yǔ)“聚合物”包括有機(jī)聚合物，例如聚苯こ烯和聚丙烯腈。優(yōu)選地，中空微粒主體的聚合物包含可以衍生的官能團(tuán)，例如腈基。在本發(fā)明的背景中，術(shù)語(yǔ)“中空”意指微粒具有完全封閉空間的聚合物壁，從而使得微粒是具有氣體填充或空的中心的売。有利地，中空微粒是剛性和機(jī)械上強(qiáng)壯的，并且可以以高流速在填充柱床中利用。中空微粒可以適當(dāng)?shù)匕芯酆衔锏亩栊圆牧?，并且?yōu)選基本上由聚合物組成。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，中空微粒包含聚合物，其選自聚苯こ烯、聚丙烯腈、聚甲基丙烯酸酯、聚氯こ烯的聚合物和聚合物的混合物?？梢圆捎霉簿畚铮⑶覂?yōu)選地共聚物包含選自苯こ烯、丙烯腈、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯和氯こ烯的多種單體，例如包含聚甲基丙烯酸酯和/或聚氯こ烯的聚丙烯腈。需要時(shí)，還可以采用不同均聚物(homopolymer)或共聚物(copolymer)的摻和物。合適的中空聚合物微?？梢岳鐝腁kzo Nobel, Expancel, Box300, S-850 13，Sundsvaii,瑞典商業(yè)獲得,并且以商標(biāo)Expancel )銷(xiāo)售。適當(dāng)?shù)兀景l(fā)明的微粒主體是球形、接近球形或橢圓形的。有利地，該主體是球形的。球形體在許多應(yīng)用中是有利的，并且促進(jìn)例如在柱中填充和在過(guò)濾過(guò)程中超過(guò)床的改善流動(dòng)特征。然而，可以使用不規(guī)則、卵形和其他形狀的微粒。存在可獲得的許多級(jí)別的中空聚合物微粒，其在外徑和內(nèi)徑上不同，即売的內(nèi)壁的直徑允許殼的聚合物微粒的厚度符合所需用途。適當(dāng)?shù)?，微粒主體具有的微粒大小為1-500 μ m、優(yōu)選5-150 μ m,并且微粒大小將根據(jù)所需應(yīng)用進(jìn)行選擇。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，微粒大小是1-50 μ m、優(yōu)選5-20 μ m，例如10 μ m。在這個(gè)范圍中的微粒大小適合于在高壓液相色譜法中使用。在另ー個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，微粒大小適當(dāng)?shù)厥?0-500μπι、優(yōu)選50-200 μ m，例如100 μ m。具有在這個(gè)范圍中的微粒大小的微粒主體適合于在固相合成中使用，特別用于肽合成、DNA合成和RNA合成。每個(gè)級(jí)別的中空微粒的這個(gè)密度在制造過(guò)程中是容易控制的，并且通過(guò)中空微粒的內(nèi)徑與外徑的比而進(jìn)行改變。這個(gè)比越高，最終產(chǎn)物將越不致密且越有浮力。適當(dāng)?shù)兀锌瘴⒘Ｖ械木酆衔锍尸F(xiàn)這樣的表面，物類(lèi)可以與該表面共價(jià)鍵合或者經(jīng)修飾與之共價(jià)或以其他方式結(jié)合，或者可以對(duì)該表面應(yīng)用包衣，并且優(yōu)選與中空微粒的聚合物結(jié)合。微粒表面可以進(jìn)行修飾，以提供共價(jià)鍵用于在某些用于中直接使用，例如在肽或核酸序列的合成中。在一個(gè)實(shí)施方案中，表面聚合物可以用于包被微?；蚺c微粒的外部結(jié)合。聚合物可以與微粒直接或間接共價(jià)結(jié)合。當(dāng)微粒由具有活性位點(diǎn)的材料制成時(shí)，聚合物可以是直接結(jié)合的。當(dāng)微粒由更惰性的聚合物制成時(shí)，可能希望處理微粒，以提供表面聚合物可以與之結(jié)合的活性位點(diǎn)。微粒可以進(jìn)行衍生，以提供用干與表面聚合物反應(yīng)的活性位點(diǎn)。在ー個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，聚合物包含腈基，并且這些可以進(jìn)行衍生或轉(zhuǎn)換為其他官能團(tuán)。例如，腈可以通過(guò)用酸或堿的水解而轉(zhuǎn)換為羧酸，使用甲醇鹽酸而轉(zhuǎn)換為甲酯，通過(guò)使用例如在四氫呋喃中 的氫化鋁鋰的還原而轉(zhuǎn)換為胺。腈還可以與胺直接反應(yīng)以形成酰胺，例如こニ胺和ニ氨基PEGS可以用于摻入伯胺表面。腈還可以進(jìn)行衍生，以產(chǎn)生醛或醇官能團(tuán)或需要的其他官能團(tuán)。表面聚合物可以是根據(jù)所需應(yīng)用的任何合適材料。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，表面聚合物選自一系列聚合物類(lèi)型，包括但不限于聚丙烯酰胺、聚苯こ烯、纖維素、瓊脂糖、聚丙烯酸酯、聚ニ甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸甲酷、聚甲基丙烯酸酯、聚脲、聚丙烯酰嗎啉、聚こ烯醇、ニ氧化硅、聚β羥基酯和聚丙烯臆。中空微粒聚合物或表面聚合物可以進(jìn)一歩反應(yīng)，以提供特定功能性用于給定應(yīng)用。適當(dāng)?shù)?，中空微粒聚合物或表面聚合物與具有至少2個(gè)官能團(tuán)的化合物反應(yīng)，ー個(gè)用干與中空微粒聚合物或表面聚合物反應(yīng)，并且另ー個(gè)提供游離功能性用于在所需應(yīng)用中使用。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，聚合物例如具有N-丙烯酰肌氨酸甲酯的聚ニ甲基丙烯酰胺和聚丙烯酰嗎啉共聚物與ニ胺化合物例如こニ胺反應(yīng)。胺官能化的主體例如適合于在肽合成、寡肽合成，例如DNA和RNA和固相有機(jī)化學(xué)中使用。氨基功能聚合物可以用于肽合成和寡核苷酸(DNA/RNA)合成，其中使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的技術(shù)附著連接試劑并且逐步裝配肽或寡核苷酸。胺官能化的主體可以進(jìn)ー步官能化，例如需要時(shí)通過(guò)使用琥珀酸轉(zhuǎn)換為羧酸。例如，在用于固定化蛋白質(zhì)例如蛋白質(zhì)A的制備中，胺官能化的主體可以用N-羥基琥珀酰亞胺和1_こ基-3-[3_ ニ甲基氨基丙基]-碳化ニ亞胺(carbodimide)鹽酸鹽處理。在一個(gè)進(jìn)ー步的實(shí)施方案中，該主體包含聚合物微粒和表面聚合物，以及包被微粒的惰性材料。特別優(yōu)選的惰性材料是Polyhipe。Polyhipe是高內(nèi)相乳化液聚合物并且是多孔的和高度吸收的。這種材料對(duì)于其中材料待被微粒主體吸收的應(yīng)用是特別優(yōu)選的。根據(jù)本發(fā)明的微粒主體還可以包含由表面聚合物支持的功能材料。合適功能材料的例子包括催化劑、用于肽合成的引發(fā)劑物類(lèi)、藥物活性剤、農(nóng)用化學(xué)活性剤、大分子、酶、核酸序列和蛋白質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，多層表面聚合物可以應(yīng)用于中空微粒，以對(duì)每層提供不同性質(zhì)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了有浮力的微粒主體，其包含含有聚合物的中空微粒和放置于中空微粒上的多層表面聚合物。每層可以包圍所有或部分下面的中空微粒主體或具有表面聚合物的主體。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，微粒主體包含親水表面聚合物例如聚丙烯酰胺、和疏水聚合物例如聚苯こ烯。希望地，親水聚合物包圍部分或優(yōu)選整個(gè)中空微粒，并且疏水層包圍部分或優(yōu)選整個(gè)親水層。有利地，多重表面包被允許修改微粒主體的性質(zhì)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了有浮力的微粒主體，其包含含有聚合物的中空微粒和放置于中空微粒上的多層表面聚合物，并且微粒主體進(jìn)一步包含活性組分，例如藥物和農(nóng)用化學(xué)品，多層表面聚合物提供活性組分的控制釋放?；钚越M分可以是任何已知藥學(xué)或農(nóng)用化學(xué)活性組分，適合于來(lái)自微粒的控制釋放。本發(fā)明在支持貴金屬催化劑例如鈀催化劑中是特別 有用的。特別有利的例子是在聚脲上支持的乙酸鈀。本發(fā)明的微粒主體可以通過(guò)有效和相對(duì)簡(jiǎn)單的方法產(chǎn)生。在一個(gè)進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了用于產(chǎn)生微粒主體材料的方法，其包括步驟提供包含具有中空中心的聚合物的微粒，使微粒與單體或單體溶液接觸，實(shí)現(xiàn)單體的聚合作用，由此在中空微粒表面上形成表面聚合物包衣。適當(dāng)?shù)?，聚合作用通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法起始。例如，將與單體或單體溶液混合的微粒加入溶劑中，所述溶劑與單體溶劑不能混合，并且加熱以實(shí)現(xiàn)聚合作用。當(dāng)單體溶液是水性的時(shí)，溶劑是例如煤油。如果優(yōu)選，那么表面聚合物可以在聚合作用過(guò)程中或在聚合作用后與中空微粒共價(jià)連接。備選地，作為表面聚合物前體的一種或多種組成成分單體可以在聚合作用起始前與微粒表面共價(jià)連接。本發(fā)明的微粒主體可以用于其中使用固相支持物的任何化學(xué)或物理方法中。微粒主體可以用于涉及導(dǎo)電和發(fā)光聚合物的應(yīng)用中。含有發(fā)光聚合物的微粒主體可以排列在顯示板上。存在與使用常規(guī)固體聚合物微粒有關(guān)的許多實(shí)際問(wèn)題，這部分涉及固體微粒的相對(duì)高密度。本發(fā)明的中空微粒主體的更低密度提供在廣泛范圍應(yīng)用中的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明的微粒主體可以在用于產(chǎn)生生物燃料的新方法中采用。已知產(chǎn)生通過(guò)化學(xué)方法產(chǎn)生的生物柴油。然而，這需要使用甲醇和苛性鈉，這是衍生自化石來(lái)源、能源的原料，并且需要顯著的資本投資和來(lái)自過(guò)程的廢棄物處置。生物柴油還可以通過(guò)酶水解產(chǎn)生，所述酶水解被認(rèn)為比化學(xué)方法更經(jīng)濟(jì)和環(huán)境上更可接受的，但已知酶方法具有酶可以從過(guò)程中喪失的缺點(diǎn)。在該過(guò)程期間，產(chǎn)生脂肪酸和甘油，并且從反應(yīng)器底部抽取作為反應(yīng)過(guò)程中的重級(jí)分的甘油。不幸的是，顯著量的酶也可以向反應(yīng)器的底部定位，并且無(wú)意中與甘油一起被抽取。在一個(gè)進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了有浮力的中空微粒主體在反應(yīng)區(qū)中保留組分或催化劑的用途，所述主體具有與主體結(jié)合的反應(yīng)組分或催化劑，其中反應(yīng)產(chǎn)生比微粒主體和組分或催化劑具有更大密度的重組分，并且從反應(yīng)區(qū)中抽取重組分，在反應(yīng)區(qū)中留下微粒主體和組分或催化劑。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，微粒主體組分用于在反應(yīng)區(qū)中保留催化劑例如酶。由于微粒主體的浮力，通過(guò)致使酶定位遠(yuǎn)離從其中抽取甘油的區(qū)，具有與其表面結(jié)合的酶的中空有浮力的微粒主體減少酶從過(guò)程中的喪失。這個(gè)原理可以應(yīng)用于任何反應(yīng)，其中反應(yīng)的組分或催化劑待保留在反應(yīng)器中，并且其中組分或催化劑可以通過(guò)根據(jù)本發(fā)明的有浮力的微粒主體攜帶。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于產(chǎn)生生物柴油的方法，其包括使植物油與有浮力的中空微粒主體接觸，所述中空微粒主體具有酶例如脂肪酶例如Cal B，在反應(yīng)區(qū)中與主體結(jié)合，以產(chǎn)生脂肪酸和甘油，從反應(yīng)區(qū)中抽取甘油，在反應(yīng)區(qū)中留下酶。具有結(jié)合的酶的中空微粒主體是有浮力的，并且在反應(yīng)區(qū)中作為甘油保留，是重組分，從反應(yīng)區(qū)的底部中抽取。還可以設(shè)想形成生物柴油的酯化反應(yīng)，使用相同的固定化的酶在相同反應(yīng)器皿中發(fā)生。微粒主體對(duì)于有機(jī)物類(lèi)特別是大分子的固相合成是特別有用的。在一個(gè)進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了用于合成反應(yīng)產(chǎn)物的方法，其包含用密度D1的液體、具有密度Dt的根據(jù)本發(fā)明的微粒主體裝載反應(yīng)區(qū)，其中Dt小于D1，并且其中微粒主體的表面包含反應(yīng)位點(diǎn)，在一種或多種反應(yīng)物與主體上的反應(yīng)位點(diǎn)反應(yīng)的條件下，將一種 或多種反應(yīng)物補(bǔ)料給反應(yīng)區(qū)，以提供反應(yīng)產(chǎn)物。適當(dāng)?shù)?，反?yīng)產(chǎn)物自身具有反應(yīng)位點(diǎn)用于與其他反應(yīng)物反應(yīng)。該方法適當(dāng)?shù)匕辽僖粋€(gè)進(jìn)一步步驟將反應(yīng)物補(bǔ)料給反應(yīng)區(qū)，以與反應(yīng)產(chǎn)物反應(yīng)，以產(chǎn)生進(jìn)一步的反應(yīng)產(chǎn)物。這個(gè)步驟可以用根據(jù)預(yù)期大分子產(chǎn)物選擇的不同反應(yīng)物重復(fù)，由此反應(yīng)產(chǎn)物是大分子。適當(dāng)?shù)?，大分子是寡核苷酸或寡糖，但在肽或核酸序列的合成中是特別有利的。當(dāng)大分子是肽時(shí)，反應(yīng)物是氨基酸或能夠提供反應(yīng)產(chǎn)物中氨基酸部分的物類(lèi)。當(dāng)大分子是核酸序列例如DNA或RNA時(shí),反應(yīng)物是核苷或能夠提供反應(yīng)產(chǎn)物中核酸部分的物類(lèi)。本發(fā)明的微粒主體在肽和核苷酸合成中是特別有用的。將根據(jù)本發(fā)明的微粒主體用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)適當(dāng)?shù)叵礈?。連接試劑例如Fmoc-Am-Rink-OH和2- (IH-苯并三唑-I-基)-N, N, N /，N '-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)可以溶解于溶劑例如DMF中?？梢约尤?-甲基嗎啉(NMM)，并且在加入洗滌的微粒主體前，使混合物預(yù)活化。偶聯(lián)反應(yīng)優(yōu)選在30分鐘內(nèi)通過(guò)茚三酮測(cè)定適當(dāng)?shù)赝瓿?。將支持物用DMF適當(dāng)?shù)叵礈欤⑶彝ㄟ^(guò)式Fmoc-X-OH化合物的反應(yīng)與微粒支持物上的連接試劑偶聯(lián)，其中X是所需氨基酸。Fmoc-X-OH隨后與微粒主體和連接試劑偶聯(lián)，并且用溶劑例如哌啶/DMF處理。所需肽序列中的每個(gè)氨基酸隨后通過(guò)相同程序加入序列中，直至肽鏈完成。肽使用已知方法適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行切割。例如，將微粒主體用含二氯甲烷和三氟乙酸(TFA)的水適當(dāng)?shù)叵雌?例如適當(dāng)?shù)丶尤?% v/vo溶液適當(dāng)?shù)刈兂杉t色，指示切割在進(jìn)行中。在10分鐘后，適當(dāng)?shù)丶尤脒M(jìn)一步的TFA，并且使得混合物切割I(lǐng)小時(shí)。將微粒主體用TFA適當(dāng)?shù)叵礈?。組合的TFA切割溶液和洗滌希望地減少為例如在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上的油。油用二乙醚研磨，以形成白色固體。通過(guò)傾析適當(dāng)?shù)厝コ?，并且使肽風(fēng)干過(guò)夜。當(dāng)存在時(shí)，中空微粒主體的聚合物或表面聚合物希望地選自聚丙烯腈、聚二甲基丙烯酰胺、聚乙二醇和聚苯乙烯，其在肽的合成中是特別有利的。在固相合成中，在應(yīng)用例如肽合成中使用已知固體聚合微粒的方法一般涉及將微粒懸浮于在多孔過(guò)濾板上的合適溶劑中，且輕輕攪拌微粒，以便不在機(jī)械上損害微粒。已知微粒是致密的且沉降在常用溶劑中的濾器上。關(guān)于微粒的制造過(guò)程通常生成細(xì)粒，其引起濾板中的堵塞，導(dǎo)致緩慢過(guò)濾或需要替換或清潔濾器。此外，固體微粒的攪拌可以引起破裂，導(dǎo)致生成增大過(guò)濾堵塞問(wèn)題的細(xì)粒。在藥學(xué)和相關(guān)工業(yè)中，在動(dòng)態(tài)藥品生產(chǎn)管理規(guī)范(cGMP)下的嚴(yán)格質(zhì)量管理要求在每批產(chǎn)物后替換濾板，以便 避免后續(xù)批次被從濾板中移出的材料所污染。通過(guò)使用比常規(guī)采用更簡(jiǎn)單的設(shè)備，根據(jù)本發(fā)明的有浮力的微粒主體簡(jiǎn)化固相合成。簡(jiǎn)化微粒主體的攪動(dòng)，并且取消濾板的使用。使用本文所述有浮力的微粒主體,固相合成可以在標(biāo)準(zhǔn)溶液相反應(yīng)器中執(zhí)行。這在實(shí)驗(yàn)室中是優(yōu)點(diǎn)，在其中固相合成可以以其最簡(jiǎn)單形式在分液漏斗中執(zhí)行。在生產(chǎn)規(guī)模時(shí)，可以避免對(duì)于預(yù)訂具有專(zhuān)門(mén)過(guò)濾和攪動(dòng)系統(tǒng)的固相反應(yīng)器的需要。通過(guò)避免常規(guī)濾板替換步驟，本發(fā)明的微粒主體的使用有利地致使cGMP操作得到簡(jiǎn)化，伴隨更容易的清潔和與減少的故障時(shí)間偶聯(lián)的清潔驗(yàn)證。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,本發(fā)明的微粒主體可以在相同反應(yīng)器中2種產(chǎn)物的制備中采用。例如，在含有有浮力的微粒和常規(guī)致密微粒的反應(yīng)器中裝配肽或核酸序列將允許微粒的分離，通過(guò)例如在任何階段時(shí)傾析。這將允許獨(dú)立地連續(xù)裝配一種或兩種肽序列。這對(duì)于類(lèi)似物的制備或在固相組合化學(xué)中可以是特別有用的。本發(fā)明提供了用于在單個(gè)反應(yīng)區(qū)中同時(shí)制備2種產(chǎn)物的方法，其包含用密度D1的液體、具有密度Dt且提供主體用于頂部合成反應(yīng)的根據(jù)本發(fā)明的微粒主體、和具有密度Db且提供主體用于底部合成反應(yīng)的實(shí)心體裝載反應(yīng)區(qū)，其中Dt小于D1且D1小于Db，在使頂部合成反應(yīng)和底部合成反應(yīng)發(fā)生的條件下，將用于頂部合成反應(yīng)和用于底部合成反應(yīng)的反應(yīng)物補(bǔ)料給反應(yīng)區(qū)，以產(chǎn)生頂部合成產(chǎn)物和底部合成產(chǎn)物，和任選地分離微粒主體與實(shí)心體，由此分離頂部合成產(chǎn)物和底部合成產(chǎn)物。適當(dāng)?shù)?，頂部合成反?yīng)和底部合成反應(yīng)獨(dú)立地選自肽合成反應(yīng)和核苷酸合成反應(yīng)。本發(fā)明進(jìn)一步提供了關(guān)于根據(jù)本發(fā)明的微粒主體作為色譜過(guò)程中的固相的用途。常規(guī)地，色譜柱一般通過(guò)下述進(jìn)行填充在合適溶劑中制備微粒的漿或靜止相，并且將其轉(zhuǎn)移到具有較低的柱濾板存在的柱內(nèi)。床在色譜柱中的不均勻沉降可以引起不均勻和均勻裂化的靜止相床，導(dǎo)致弱和無(wú)法重現(xiàn)的分離。柱通常必須清空且重新填充幾次以達(dá)到所需性能。這可以是費(fèi)力的，且導(dǎo)致生產(chǎn)規(guī)模操作中的特定缺點(diǎn)的故障時(shí)間。本發(fā)明的有浮力的微粒主體允許用于漿制備和漿轉(zhuǎn)移至柱的方法簡(jiǎn)化。微粒主體的浮力允許通過(guò)主體的漂浮形成靜止相，這提供更簡(jiǎn)單的方法和更均勻填充的柱。有利地，靜止相可以通過(guò)使微粒在柱內(nèi)重新漂浮而容易地動(dòng)員，避免需要時(shí)清空和重新漿化的需要。此外，清空柱的方法是簡(jiǎn)化的，因?yàn)槲⒘？梢栽谥鶅?nèi)漂浮，并且通過(guò)傾析去除。這對(duì)于生產(chǎn)規(guī)模操作特別有利。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，各自具有不同密度的2種或更多種微粒主體可以用于填充柱，以提供具有限定條帶的混合床柱。例如，I gG在基于蛋白質(zhì)A的靜止相上的親和分離可以與離子交換分離組合，以去除相同柱中的浸出蛋白質(zhì)A。在此類(lèi)方法中，靜止相可以通過(guò)利用2種或更多種微粒主體的不同密度進(jìn)行分離。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明可以用于執(zhí)行手性分離，例如其中在相同柱中的不同微粒主體攜帶R和S手性選擇器。微粒還可以裝載或填充到柱內(nèi)，并且空隙空間裝載有整體(monolith)聚合物，以形成整體。本發(fā)明進(jìn)一步提供了包含填充的根據(jù)本發(fā)明的多種微粒主體微粒的特定主體整體，以提供優(yōu)選在柱排列中的整體。
需要時(shí)，在整體中特定主體之間的空隙空間適當(dāng)?shù)匮b載與微粒主體和表面聚合物那種不同的聚合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在整體中微粒之間的空隙空間可以填充不同組分，例如細(xì)胞培養(yǎng)營(yíng)養(yǎng)素。在這個(gè)例子中，細(xì)胞可以在包被微粒的表面聚合物上培養(yǎng)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,本發(fā)明提供了包含中空微粒和任選地放置于中空微粒外部上的表面聚合物的微粒主體，所述中空微粒包含聚丙烯腈。聚丙烯腈是有利的，因?yàn)樗话闶腔瘜W(xué)上穩(wěn)定的，但在二甲基甲酰胺(DMF)中是可溶的，并且具有聚丙烯腈壁的中空微粒主體可以通過(guò)稀釋的DMF溶液滲透，但保持完整。這致使材料通過(guò)中空微粒主體的壁攜帶至內(nèi)部，并且在其中局限在中空微粒的內(nèi)部尺寸之內(nèi)實(shí)施過(guò)程。這使得能夠產(chǎn)生具有極窄微粒大小分布的微粒。本發(fā)明提供了包含聚丙烯腈的中空微粒用于產(chǎn)生具有窄微粒大小分布的微粒的用途。在一個(gè)進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生聚合物微粒的方法，其包括使包含DMF和水溶液與包含聚丙烯腈殼具有中空微粒主體的單體接觸，從而使得溶液經(jīng)過(guò)殼至主體的內(nèi)部，對(duì)溶液實(shí)施起始單體的聚合作用的條件，以在中空微粒主體內(nèi)形成聚合物微粒，并且使微粒主體與DMF接觸，以便溶解微粒殼，從而提供聚合物微粒。適當(dāng)?shù)?，取決于待滲透的聚合物，DMF溶液包含20-80% w/w水平的DMF，且優(yōu)選35-65%、最佳40-60%，例如50%。應(yīng)選擇DMF的特定稀釋度，以允許溶液滲透通過(guò)聚合物壁，其可以以膜的形式。如果溶液太弱，那么滲透將不太可能發(fā)生，并且如果太強(qiáng)，那么聚合酶膜可能破裂。如果希望破裂聚合物，那么將采用比穿透聚合物所需那種更強(qiáng)的DMF溶液。有利地，可以獲得具有窄微粒大小分布和所需多孔性的微粒。常規(guī)地，通過(guò)篩分已獲得具有窄微粒大小分布的微粒，然而，所述篩分是資本密集的，并且可能引起微粒的物理降解。已知其增長(zhǎng)聚合物微粒，然而，這種方法具有微?？赡苋狈Χ嗫仔缘娜秉c(diǎn)。本發(fā)明的微粒主體也可用于固相萃取，以從與主體接觸的液劑中取出物類(lèi)，無(wú)論是以批形式還是作為在主體上的流，例如離子萃取和離子交換。固相萃取一般在柱中或在具有濾板的系統(tǒng)中執(zhí)行，用于分離在萃取下的固相與混合物。本文提及的對(duì)于固相合成和色譜法觀(guān)察到的問(wèn)題可以類(lèi)似地對(duì)于固相萃取觀(guān)察到。本發(fā)明的有浮力的微粒主體提供了與在色譜法和固相合成中提供的相似優(yōu)點(diǎn)。 本發(fā)明的有浮力的微粒主體可以用于通過(guò)使用溶劑不混溶性來(lái)分離物類(lèi)。在包含水相和有機(jī)相例如二氯甲烷的二元系統(tǒng)中，在水相中漂浮的根據(jù)本發(fā)明的親水性有浮力的微粒主體和在二氯甲烷相中漂浮的疏水性微粒主體可以提供不連續(xù)區(qū)，在其中可以執(zhí)行過(guò)程例如分離、萃取或合成。這種排列適當(dāng)有效地提供4相萃取系統(tǒng)。本發(fā)明的主體可以用于固定化物類(lèi)包括抗體、寡核苷酸、酶或熒光素，并且可以置于陣列中，其中每種主體用于測(cè)定溶液的不同組分。具有與其表面共價(jià)附著的或經(jīng)由表面聚合物與表面結(jié)合的配體的微粒主體可以在‘孔’中。隨后可以使用已經(jīng)確立的方法檢測(cè)靶配體例如抗原或者互補(bǔ)DNA或RNA序列的特異性結(jié)合。本發(fā)明的微粒主體還可以用于固定化生物催化劑。生物催化劑通常用在柱中或具有濾板的系統(tǒng)中，用于分離在萃取下的固相與混合物。本文提及的對(duì)于固相合成和色譜法觀(guān)察到的問(wèn)題可以類(lèi)似地對(duì)于固相萃取觀(guān)察到。本發(fā)明的有浮力的微粒主體提供了與在色譜法和固相合成中提供的相似優(yōu)點(diǎn)。、
在實(shí)心體上，常規(guī)固定化的生物催化劑例如固定化的酶可以不利地沉降在反應(yīng)器的基底上，導(dǎo)致生物催化劑與底物的接觸減少。本發(fā)明的微粒主體可以容易地?cái)噭?dòng)，以確保生物催化劑的表面最大限度可用面積保持可用于底物。本發(fā)明還設(shè)想了具有在相同柱或反應(yīng)器中2種或更多種不同固定化的生物催化劑或輔因子的系統(tǒng)。有利地，類(lèi)似于對(duì)于固相萃取觀(guān)察到那種的不能混合的溶劑系統(tǒng)還可以用于提供不同反應(yīng)區(qū)用于在不同微粒主體上固定化的生物催化劑。本發(fā)明的有浮力的微粒主體還可以具有在其中使用對(duì)流的系統(tǒng)或渦旋分離系統(tǒng)中的應(yīng)用。本發(fā)明的微粒主體在固定化物類(lèi)中是特別有用的，所述物類(lèi)包括固相試劑、金屬和其他催化劑、生物催化劑、酶、蛋白質(zhì)、抗體包括多克隆和單克隆抗體、全細(xì)胞和聚合物。本發(fā)明在支持酶例如脂肪酶Cal A良好工作中是特別有利的，特別是與聚二甲基丙烯酰胺和其他相似親水性聚合物組合。本發(fā)明在親和配體例如蛋白質(zhì)A的固定中也是特別有用的。在進(jìn)一步的應(yīng)用中，本發(fā)明的微粒主體還可以用于化學(xué)催化中，例如通過(guò)固定過(guò)渡金屬催化劑和配體。在再進(jìn)一步的應(yīng)用中，本發(fā)明可以用于細(xì)胞培養(yǎng)中。動(dòng)物細(xì)胞系的大量培養(yǎng)在制造病毒疫苗和生物技術(shù)的許多產(chǎn)物中是基礎(chǔ)。在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中通過(guò)重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的生物制品包括酶、合成激素、免疫生物制劑(單克隆抗體、白細(xì)胞介素、淋巴因子)和抗癌齊U。許多更簡(jiǎn)單的蛋白質(zhì)可以使用rDNA在細(xì)菌培養(yǎng)中產(chǎn)生；其為糖基化的(碳水化合物修飾的)的更復(fù)雜蛋白質(zhì)目前必須在動(dòng)物細(xì)胞中制備。此類(lèi)復(fù)雜蛋白質(zhì)的重要例子是激素促紅細(xì)胞生成素。培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物的成本很高，因此公司不斷地注意改善技術(shù)。細(xì)胞可以在懸液中或作為貼壁培養(yǎng)物中進(jìn)行培養(yǎng)。然而，貼壁細(xì)胞需要可以用細(xì)胞外基質(zhì)組分包被的表面，以增加粘附性質(zhì)且提供生長(zhǎng)和分化所需的其他信號(hào)。一般地，衍生自固體組織的細(xì)胞是貼壁的。器官特征培養(yǎng)涉及在三維環(huán)境中培養(yǎng)細(xì)胞，與二維培養(yǎng)皿相反。這種3D培養(yǎng)系統(tǒng)在生物化學(xué)和生理學(xué)上更類(lèi)似于體內(nèi)組織，但由于許多因素(例如擴(kuò)散)，對(duì)于維持在技術(shù)上具有挑戰(zhàn)性。在一個(gè)進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明的有浮力的微粒主體在主體表面上培養(yǎng)細(xì)胞的用途。適當(dāng)?shù)兀杉?xì)胞可以在本發(fā)明的微粒主體上培養(yǎng)，以減少不受控制的分化和控制需要的分化。微粒主體的處理特征和通過(guò)主體浮力的表面區(qū)域的高利用在這種應(yīng)用中是有利的。本發(fā)明在醫(yī)學(xué)診斷測(cè)試?yán)缑庖邷y(cè)定中是特別有用的。相應(yīng)地，本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于檢測(cè)化合物的存在的醫(yī)學(xué)診斷劑，所述診斷劑包含根據(jù)本發(fā)明的微粒主體和由在微粒主體中的表面聚合物支持的功能材料例如酶，例如辣根過(guò)氧化物酶，用于與待檢測(cè)的化合物選擇性反應(yīng)或結(jié)合。許多醫(yī)學(xué)診斷依賴(lài)于固相支持物以固定化多種診斷配體。本發(fā)明的微粒主體可以用于其中固相的物理分離通過(guò)液相的醫(yī)學(xué)診斷操作步驟中。在進(jìn)一步的應(yīng)用中，微粒主體可以用作吸收劑。在這個(gè)應(yīng)用中，如果主體含有與微粒主體結(jié)合并且表面聚合物與之結(jié)合的惰性、吸收性材料，那么它是特別有利的。Polyhipe 是特別優(yōu)選的惰性材料。微粒主體可以用于吸收家庭溢出物例如茶、咖啡和酒，或者可以用于更大規(guī)模的應(yīng)用中，例如以吸收來(lái)自溢出的油。吸收性主體可以用于吸收溢出物且隨后物理去除，或在水體中的油溢出物的情況下，有效地捕獲油且將油保留在有浮力的團(tuán)塊中用于收集和處置。本發(fā)明的微粒主體可以用作載體，以攜帶經(jīng)過(guò)一段時(shí)間釋放的化合物，例如藥學(xué)或農(nóng)用化學(xué)化合物或組合物。這種用途提供了根據(jù)化合物在主體中的裝載修改化合物的給藥方案的方法。在藥物的情況下，這在幫助活性劑的正確劑量是有利的，例如具有連續(xù)緩慢 釋放而不是要求患者服用定期大劑量，例如在化學(xué)治療中。本發(fā)明通過(guò)參考附圖
進(jìn)行舉例說(shuō)明，其中圖I和2各自顯示以橫截面的本發(fā)明微粒主體的舉例說(shuō)明性實(shí)施方案。圖I顯示包含中空微粒(I)具有一致形狀的中空微粒主體，其具有在微粒(I)上均勻地包被的表面聚合物(2)。圖2顯示中空微粒主體，其中中空微粒(I)由表面聚合物(2)包被，并且其具有不規(guī)則形狀。圖3顯示包含多個(gè)中空微粒(I)的中空微粒主體，其由表面聚合物(2)包被，從而使得微粒主體具有一致形狀。圖4顯示包含多個(gè)中空微粒(I)的中空微粒主體，其由表面聚合物(2)包被，從而使得微粒主體具有不一致或不規(guī)則形狀。本發(fā)明通過(guò)下述非限制性例子舉例說(shuō)明。
實(shí)施例實(shí)施例I表面腈至羧酸的轉(zhuǎn)換Expancel 920 DEX 80d 30 (80 μ m聚丙烯腈氣球)(100cm3)用氫氧化鉀溶液(在200cm3的4:lv/v水甲醇中20% w/v)在80°C處理3小時(shí)。在風(fēng)干前，將中空微粒用水(3叉1000113)、濃鹽酸(3叉1000]13)和甲醇(3xl00cm3)洗漆。使用酹酞指示劑,通過(guò)用水性氫氧化鈉(5. 85mmol/dm3)滴定聚合物(250mg)測(cè)定羧酸含量。結(jié)果還通過(guò)加入過(guò)量氫氧化鈉溶液(5. 85mmol/dm3)隨后用水性鹽酸(6mmol/dm3)反滴定加以證實(shí)。羧酸載量是O. 30mmol/g。實(shí)施例2表面腈至羧酸的轉(zhuǎn)換Expancel 920DEX 80d 30 (80μηι聚丙烯腈氣球)(100cm3)用氫氧化鉀溶液(在200cm3的4:lv/v水甲醇中20% w/v)在80°C處理20小時(shí)。在風(fēng)干前，將中空微粒用水(3叉1000113)、濃鹽酸(3叉1000113)和甲醇(3xl00cm3)洗漆。使用酹酞指示劑,通過(guò)用水性氫氧化鈉(5. 85mmol/dm3)滴定聚合物(250mg)測(cè)定羧酸含量。結(jié)果還通過(guò)加入過(guò)量氫氧化鈉溶液(5. 85mmol/dm3)隨后用水性鹽酸(6mmol/dm3)反滴定加以證實(shí)。羧酸載量是I. Ommol/go實(shí)施例3表面腈至伯胺的轉(zhuǎn)換將Expancel 920DEX 80d30 (200cm3)分散在干四氫呋喃(THF) (400cm3)中，并且經(jīng)過(guò)20分鐘緩慢加入在THF中的氫化鋁鋰(30cm3中2mmol/dm3)。將反應(yīng)在50°C放置16小時(shí)。通過(guò)緩慢加入水(100cm3)破壞過(guò)量氫化鋁鋰，隨后在風(fēng)干前，將聚合物用水(5x200cm3)、THF (2xl00cm3)、甲醇(5x200cm3)和二乙醚(Ixl00cm3)洗滌。得率 5. 8g。聚合物對(duì)于用于測(cè)定伯胺含量的茚三酮測(cè)定是陽(yáng)性的。
實(shí)施例4增加胺裝載在作為溶劑的二氯甲烷(DCM) (100cm3)中的二異丙基碳化二亞胺(O. 76g，6mmol)和N-甲基嗎啉(O. 61g,6mmol)的存在下，使來(lái)自實(shí)施例3的產(chǎn)物與Fmoc-Lys (Fmoc) -OH(1.8g，3mmol)反應(yīng)I小時(shí)。將聚合物用DCM (3xl00cm3)洗滌，并且用在DCM中的哌啶(100cm3，20% v/v)處理30分鐘。隨后在風(fēng)干前，將聚合物用DCM (3x 100cm3)、MeOH(3xl00cm3)、水(3xl00cm3)、MeOH (3xl00cm3)和二乙醚(Ixl00cm3)洗滌。得率 6. 3g (
O.6mmol/g)。實(shí)施例5與α -滇代異丁酰滇( BIB)反應(yīng)將來(lái)自實(shí)施例4的聚合物(I. 9g)分散在DCM (30cm3)中，并且加入BIB (2cm3，8. 8mmol),隨后為吡啶(2cm3)。將反應(yīng)放置2小時(shí)，隨后在風(fēng)干前，將聚合物用DCM(3x30cm3)、Me0H (3x30cm3)、水(3x30cm3)、MeOH (3x30cm3)和二乙醚(Ix30cm3)洗滌。實(shí)施例6BIB官能化聚合物的聚合物包被將實(shí)施例5中制備的BIB官能化聚合物(O. 6g)分散在單體水溶液(100cm3)中，所述單體水溶液含有二甲基丙烯酰胺(8. 43g,85mmol)、乙烯二丙烯酰胺(I. 6g,9. 8mmol)和丙烯酰肌氨酸甲酯(I. 57g, lOmmol)。將 CuBr (186mg, I. 3mmol)和 N, N, N'，N〃, N〃-五甲基二乙烯三胺(PMDETA) (0.675g，3.9mmol)溶解于MeOH (5cm3)中，并且加入上述分散體中，以起始聚合作用。在I. 5小時(shí)后，混合物已變稠。加入水(100cm3)以再次分散聚合物，并且將反應(yīng)放置進(jìn)一步的16小時(shí)。在風(fēng)干前，將聚合物用水、DMF、MeOH和隨后二乙醚充分洗滌。得率5. Ig0實(shí)施例7包被聚合物至伯胺的轉(zhuǎn)換實(shí)施例6中制備的聚合物包被的中空球(2. 5g)用乙二胺(50cm3)處理過(guò)夜。在風(fēng)干前，將聚合物用水和MeOH充分洗滌。實(shí)施例8包被聚合物至伯胺的轉(zhuǎn)換實(shí)施例6中制備的聚合物包被的中空球(2. 5g)用1，2_ 二(2-氨基乙氧基)乙烷(50cm3)處理過(guò)夜。在風(fēng)干前，將聚合物用水和MeOH充分洗滌。實(shí)施例9表面腈至甲酯的轉(zhuǎn)換將Expancel 920 DEX 80d 30 (100cm3)分散在 MeOH 中的濃鹽酸(300cm3，I: Iv/V)中，并且在80°C攪拌4小時(shí)。在風(fēng)干前，將聚合物用水和MeOH充分洗滌。實(shí)施例10表面甲酯至伯胺的轉(zhuǎn)換將實(shí)施例9中制備的聚合物(50cm3)分散在乙二胺中，以取代甲酯，并且在室溫?cái)嚢?6小時(shí)。在風(fēng)干前，將聚合物用水和MeOH充分洗滌。聚合物對(duì)于用于測(cè)定伯胺含量的茚三酮測(cè)定是陽(yáng)性的。實(shí)施例11表面甲酯至伯胺的轉(zhuǎn)換將實(shí)施例9中制備的聚合物(50cm3)分散在Jeffamine 800 (二-氨基PEG)中，以取代甲酯，并且在90°C攪拌6小時(shí)。在風(fēng)干前，將聚合物用水和MeOH充分洗滌。聚合物對(duì)于用于測(cè)定伯胺含量的茚三酮測(cè)定是陽(yáng)性的。實(shí)施例12中空聚合物球作為樽子將Expancel 920 DEX 80 d30 (80cm3)分散在水性 DMF (30cm3，I: lv/v)中，所述水性DMF含有二甲基丙烯酰胺(I. 455g，14. 7mmol)、亞甲基二丙烯酰胺(O. 231g，I. 5mmol)和丙烯酰肌氨酸甲酯(O. 314g，2mmol)，并且放置I小時(shí)。將過(guò)量單體溶液倒出( 10cm3)，并且將聚合物微粒分散在甲苯(100cm3)中。加入過(guò)硫酸銨溶液(O. 25cm3,10% w/v)，隨后為四亞甲基乙二胺(TEMEDA) (O. 25cm3)，并且將混合物在80°C攪拌2小時(shí)，隨后在室溫靜置過(guò)夜。在風(fēng)干前，將聚合物用DMF、DCM和二乙醚充分洗滌，以產(chǎn)生基于聚二甲基丙烯酰胺的聚合物的球形微粒(得率，O. 6g)。實(shí)施例13基于聚二甲基丙烯酰胺的聚合物至伯胺的轉(zhuǎn)換實(shí)施例12中制備的聚合物包被的中空球(O. 5g)用乙二胺(20cm3)處理過(guò)夜。在風(fēng)干前，將聚合物用水和MeOH充分洗滌。聚合物對(duì)于用于測(cè)定伯胺含量的茚三酮測(cè)定是陽(yáng)性的。實(shí)施例14中空聚合物球由二氧化硅的包被如實(shí)施例9中所述制備的甲酯功能性中空聚合物球(50cm3)用在MeOH (50cm3)中的3-氨丙基三甲氧基硅烷(10cm3)在室溫處理過(guò)夜。將微粒用在MeOH (l;lv/v)中的水充分洗滌，并且隨后用在含有氫氧化銨(O. 1% v/v)的MeOH中的水(I ；lv/v)處理3小時(shí)，以起始甲氧基硅烷的水解，以形成二氧化硅。將聚合物用丙酮充分洗滌，并且在過(guò)濾和風(fēng)干前，在丙酮中放置I周以固化。實(shí)施例15微粒主體在肽合成中的用途通過(guò)使連接試劑與微粒主體偶聯(lián)，并且隨后順序偶聯(lián)催產(chǎn)素的氨基酸，并且切割合成的肽以產(chǎn)生催產(chǎn)素，使用已知的常規(guī)肽合成法，實(shí)施例6的聚合物用于制備肽催產(chǎn)素。產(chǎn)生肽至與使用常規(guī)肽合成支持物獲得那種可比較或更大的高水平純度，并且以更低成本，因?yàn)楸景l(fā)明的微粒主體比常規(guī)肽合成支持物更低成本地產(chǎn)生。適合于在產(chǎn)生催產(chǎn)素和其他肽中使用的肽合成法包括提供微粒主體，例如將具有胺功能性聚二甲基丙烯酰胺聚合物用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)適當(dāng)?shù)叵礈?，并且?duì)微粒主體實(shí)施已知肽合成法,例如如下所述。連接試劑例如Fmoc-Am-Rink-OH 和 2-( IH-苯并三唑-I-基)-N, N, W，N'-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)可以溶解于DMF中?？梢约尤?-甲基嗎啉(NMM)，并且在加入洗滌的微粒主體前，使混合物預(yù)活化2-3分鐘。偶聯(lián)反應(yīng)優(yōu)選在30分鐘內(nèi)通過(guò)茚三酮測(cè)定適當(dāng)?shù)赝瓿?。將支持物用DMF適當(dāng)?shù)叵礈臁０被酕moc-X-OH的偶聯(lián)，其中X是所需氨基酸使用對(duì)于偶聯(lián)連接試劑所述的程序，F(xiàn)moc-X-OH隨后與微粒主體和連接試劑偶聯(lián)，并且用哌啶/DMF處理。所需肽序列中的每個(gè)氨基酸隨后通過(guò)相同程序加入序列中，直至肽鏈完成。肽切割 例如，將微粒主體用含二氯甲烷和三氟乙酸(TFA)的水適當(dāng)?shù)叵礈?，例如適當(dāng)?shù)丶覣 5% v/vo溶液適當(dāng)?shù)刈兂杉t色,指示切割在進(jìn)行中。在10分鐘后,適當(dāng)?shù)丶尤脒M(jìn)一步TFA，并且使得混合物切割I(lǐng)小時(shí)。將微粒主體在分液漏斗中用TFA適當(dāng)?shù)叵礈?。組合的TFA切割溶液和洗滌希望地減少為例如在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上的油。油用二乙醚研磨，以形成白色固體。通過(guò)傾析適當(dāng)?shù)厝コ眩⑶沂闺娘L(fēng)干過(guò)夜。
肽通過(guò)反相HPLC顯示含有一個(gè)主要組分，并且如通過(guò)MALDI-T0F質(zhì)譜法測(cè)定的具
有預(yù)期分子 量。
權(quán)利要求
1.一種包含中空微粒的微粒主體和任選地放置于所述中空微粒外部上的表面聚合物，所述中空微粒包含聚合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求I的微粒主體，其中所述主體用于在液相中使用并且在所述液相中是有浮力的。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或權(quán)利要求2的微粒主體，其中所述微粒主體具有小于lg/cm3的密度。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的微粒主體，其中所述微粒主體具有的密度在范圍0. 01-0. 05g/cm3 中。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的微粒主體，其中所述聚合物選自聚苯乙烯、聚丙烯腈、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚氯乙烯，和包含選自苯乙烯、丙烯腈、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯和氯乙烯的多種單體的共聚物。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的微粒主體，其中所述聚合物包含腈基和/或衍生的腈基。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的微粒主體，其中所述中空微粒一般是球形或橢圓形的。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的微粒主體，其中所述主體包含在表面聚合物包被中含有多個(gè)中空微粒的球形、橢圓形或其他規(guī)則形狀的凝聚物。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的微粒主體，其中所述中空微粒具有的微粒大小為1—500 u mD
10.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的微粒主體，其包含與所述中空微粒直接或間接共價(jià)結(jié)合的表面聚合物。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的微粒主體，其包含選自聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、纖維素、瓊脂糖、聚丙烯酸酯、聚二甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸酯、聚脲、聚丙烯酰嗎啉、聚乙烯醇、二氧化硅、聚3羥基酯和聚丙烯腈的一種或多種表面聚合物。
12.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的微粒主體，其中所述中空微粒的所述聚合物，或當(dāng)存在時(shí)，所述表面聚合物包含胺官能團(tuán)，其用于在肽合成、寡核苷酸合成或固相合成中使用。
13.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的微粒主體,其中所述主體包含包被所述中空微粒的惰性材料。
14.根據(jù)任何權(quán)利要求13的微粒主體，其包含與所述惰性材料結(jié)合的表面聚合物，或當(dāng)所述惰性材料是多孔的時(shí)，保留在所述惰性材料的孔內(nèi)。
15.根據(jù)權(quán)利要求13或14的微粒主體,其中所述惰性材料選自polyhipe和多孔二氧化硅。
16.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的微粒主體，其進(jìn)一步包含被所述中空微粒聚合物或所述表面聚合物支持或與之反應(yīng)的功能材料。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的微粒主體，其中所述功能材料選自催化劑、用于肽合成的引發(fā)劑物類(lèi)、用于寡核苷酸合成的引發(fā)劑物類(lèi)、用于固相有機(jī)合成的引發(fā)劑物類(lèi)、藥物活性劑、農(nóng)用化學(xué)活性劑、蛋白質(zhì)或其他生物學(xué)大分子。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的微粒主體，其中所述功能材料包含酶。
19.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的微粒主體，多層表面聚合物，第一層包含親水表面聚合物，并且第二層包含疏水表面聚合物。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的微粒主體，其包含藥學(xué)或農(nóng)用化學(xué)活性組分，其中所述多層表面聚合物提供所述活性組分的控制釋放。
21.一種用于檢測(cè)分析物的醫(yī)學(xué)診斷劑，其包含根據(jù)權(quán)利要求1-19中任一項(xiàng)的微粒主體，且包含被能夠與待檢測(cè)的所述分析物相互作用的所述主體結(jié)合或保留的功能材料。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的醫(yī)學(xué)診斷劑，其中所述功能材料包含由所述表面聚合物支持的酶。
23.—種整體,其包含以三維形狀排列優(yōu)選包含在柱中的根據(jù)權(quán)利要求1-19中任一項(xiàng)的多個(gè)微粒主體。
24.一種用于產(chǎn)生微粒主體材料的方法，其包括以下步驟提供中空微粒，使所述微粒與單體或單體溶液接觸，實(shí)現(xiàn)所述單體的聚合作用，由此在一種或多種中空微粒上形成表面聚合物包衣。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中將所述單體或所述單體溶液加入所述中空微粒中，并且在溶劑的存在下執(zhí)行聚合作用，所述溶劑與所述單體或單體溶劑不能混合。
26.根據(jù)權(quán)利要求1-20中任一項(xiàng)的微粒主體在化學(xué)、生物學(xué)或物理方法中的用途。
27.根據(jù)權(quán)利要求26的微粒主體在選自下述的方法中的用途選自肽、寡核苷酸、寡糖的物類(lèi)的固相合成；固相萃取；固相有機(jī)化學(xué)；選自固相試劑、金屬和其他催化劑、生物催化劑、酶、蛋白質(zhì)、抗體包括多克隆和單克隆抗體、全細(xì)胞和聚合物的物類(lèi)的固定化；細(xì)胞培養(yǎng)；用于色譜分離的靜止相的制備；或用于用作吸收劑。
28.有浮力的中空微粒主體在反應(yīng)區(qū)中保留組分或催化劑的用途，所述主體具有與所述主體結(jié)合的反應(yīng)組分或催化劑，其中所述反應(yīng)產(chǎn)生比所述微粒主體和組分或催化劑具有更大密度的重組分，并且從所述反應(yīng)區(qū)中抽取所述重組分，在所述反應(yīng)區(qū)中留下所述微粒主體和組分或催化劑。
29.根據(jù)權(quán)利要求29的用途，其中酶催化劑與所述支持物結(jié)合，并且將植物油補(bǔ)料給所述反應(yīng)區(qū)，并且從所述反應(yīng)區(qū)中抽取甘油。
30.一種用于產(chǎn)生脂肪酸的方法，其包括使植物油與有浮力的中空微粒主體接觸，所述中空微粒主體具有能夠水解與反應(yīng)區(qū)中的所述主體結(jié)合的所述植物油以產(chǎn)生脂肪酸和甘油的酶，從所述反應(yīng)區(qū)中抽取甘油，在所述反應(yīng)區(qū)中留下所述酶。
31.根據(jù)權(quán)利要求30的方法，其進(jìn)一步包括步驟將醇引入所述反應(yīng)區(qū)，在酯化反應(yīng)催化劑的存在下，使所述醇與所述脂肪酸接觸，以產(chǎn)生生物柴油。
32.一種用于合成反應(yīng)產(chǎn)物的方法，其包括用密度D1的液體、具有密度Dt的根據(jù)權(quán)利要求1-20中任一項(xiàng)的微粒主體裝載反應(yīng)區(qū)，其中Dt小于D1，并且其中所述微粒主體的表面包含反應(yīng)位點(diǎn),在一種或多種反應(yīng)物與所述主體上的反應(yīng)位點(diǎn)反應(yīng)的條件下,將一種或多種反應(yīng)物補(bǔ)料給所述反應(yīng)區(qū)，以提供反應(yīng)產(chǎn)物。
33.根據(jù)權(quán)利要求32的方法，其包含至少一個(gè)進(jìn)一步步驟將反應(yīng)物補(bǔ)料給所述反應(yīng)區(qū)，以與所述反應(yīng)產(chǎn)物反應(yīng)，以產(chǎn)生進(jìn)一步的反應(yīng)產(chǎn)物，和任選地用相同或不同反應(yīng)物重復(fù)這個(gè)步驟，以產(chǎn)生大分子。
34.根據(jù)權(quán)利要求33的方法，用于產(chǎn)生選自寡核苷酸、肽的大分子，并且當(dāng)所述大分子是肽，所述反應(yīng)物是氨基酸或能夠提供反應(yīng)產(chǎn)物中氨基酸部分的物類(lèi)，并且當(dāng)所述大分子是核酸序列時(shí)，所述反應(yīng)物是核苷或能夠提供反應(yīng)產(chǎn)物中核酸部分的物類(lèi)。
35.根據(jù)權(quán)利要求32-34中任一項(xiàng)的方法，其中所述表面聚合物選自聚二甲基丙烯酰胺、聚乙二醇和聚苯乙烯。
36.一種用于在單個(gè)反應(yīng)區(qū)中同時(shí)制備2種產(chǎn)物的方法，其包含用密度D1的液體、具有密度Dt且提供主體用于頂部合成反應(yīng)的根據(jù)本發(fā)明的微粒主體、和具有密度Db且提供主體用于底部合成反應(yīng)的實(shí)心體裝載反應(yīng)區(qū)，其中Dt小于D1且^小于Db，在使頂部合成反應(yīng)和底部合成反應(yīng)發(fā)生的條件下，將用于頂部合成反應(yīng)和用于底部合成反應(yīng)的反應(yīng)物補(bǔ)料給所述反應(yīng)區(qū)，以產(chǎn)生頂部合成產(chǎn)物和底部合成產(chǎn)物，和任選地分離所述微粒主體與所述實(shí)心體，由此分離所述頂部合成產(chǎn)物和底部合成產(chǎn)物。
全文摘要
具有中空微粒和放置于中空微粒外部上的表面聚合物且適合于在固相合成特別是在肽和寡核苷酸的產(chǎn)生中使用的微粒主體。微粒主體可以用作色譜靜止相柱，并且主體的浮力允許柱從底部有效地填充，減少對(duì)靜止相的損害的風(fēng)險(xiǎn)。微粒主體的浮力還可以允許物類(lèi)例如催化劑懸浮于液相中，以進(jìn)行反應(yīng)例如植物油的水解和酯化反應(yīng)，以產(chǎn)生生物柴油，伴隨來(lái)自反應(yīng)區(qū)的催化劑喪失的風(fēng)險(xiǎn)減少。
文檔編號(hào)C08J9/224GK102630241SQ201080051729
公開(kāi)日2012年8月8日 申請(qǐng)日期2010年9月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月16日
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