專利名稱：一種微生物發(fā)酵和膜分離技術(shù)耦合生產(chǎn)γ-聚谷氨酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種微生物發(fā)酵和膜分離技術(shù)耦
合生產(chǎn)y—聚谷氨酸的方法。
背景技術(shù)：
1聚谷氨酸(1^>0八)是由多種桿菌(^1"http://| 印ec/^)產(chǎn)生的一種胞外多肽， 它是某些微生物莢膜的主要組分。y-PGA是一種由D-型或L-型谷氨酸通過Y-酰胺鍵連接而成的水溶性和可生物降解物質(zhì)，通常它由5000個左右的谷氨酸 單體組成，相對分子質(zhì)量一般在10萬 100萬。y-PGA的分子鏈上具有大量 活性較高的側(cè)鏈羧基，具有極高的保濕性和吸水性(1:3500， m/v)。微生物合 成的Y-PGA能被土壤細菌分泌的水解酶所分解，故其對環(huán)境無污染，為綠色 生物產(chǎn)品，具有極佳的生物可降解性、成膜性、成纖維性、可塑性、粘結(jié)性、 保濕性等許多獨特的理化和生物學特性。
由于Y-PGA具有優(yōu)良的生物相容性、生物降解性及無毒無污染性，使得 它作為一種理想的體內(nèi)可降解吸收的生物醫(yī)藥用材料，廣泛用作藥物緩/控釋 材料，土壤、沙地的蓄水保濕劑，食品的水凝劑以及高強度纖維。 '
在注重環(huán)保、強調(diào)可持續(xù)發(fā)展的今天，這種由生物合成的可降解型功能材 料受到人們的青睞，正逐漸地被應(yīng)用于醫(yī)藥制造、食品加工及蔬菜、水果、海 產(chǎn)品的防凍和保鮮，也可開發(fā)應(yīng)用于化妝品工業(yè)、煙草、皮革制造業(yè)及植物種 子保護等許多領(lǐng)域，是一種具有極大開發(fā)價值和廣闊前景的多功能新型生物制 品。日本的y-PGA研究開發(fā)位于世界前列，味之素株式會社已成功地開發(fā)了 ，PGA的生物生產(chǎn)方法，產(chǎn)品正逐步應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、化工、醫(yī)藥等領(lǐng)域。
目前，PGA主要有微生物發(fā)酵法得到，主要的生產(chǎn)菌種包括炭疽芽孢桿菌 (Bflcz'〃ws fl涵ra"'s)， 糖化菌(萬acz7/us 膨化"fen'c—， 枯草芽抱桿菌 (5a"'〃肌sw6"7/s)及纟內(nèi)旦桿菌CSac/〃ws "a加)等。
通過微生物發(fā)酵得到高粘度的發(fā)酵液，可用有機溶劑沉淀法、化學沉淀法 和膜分離沉淀法獲得，PGA。有機溶劑沉淀是指利用離心或凝聚菌體的方法除 去發(fā)酵液中的菌體，在上清液中加入低級醇類(如甲醇、乙醇)可沉淀得到 y-PGA，經(jīng)冷凍干燥得到白色結(jié)晶。而化學沉淀是用飽和硫酸銅和氯化鈉溶液 代替低級醇類鹽析沉淀y-PGA。對高粘度的發(fā)酵液還可采取膜分離沉淀法。沉 淀干燥可得到白色y-PGA粗品。將粗品溶解于水中后，離心除去不溶性雜質(zhì)，采用透析或電滲析除鹽的方法得到，PGA的水溶液，經(jīng)冷凍干燥后，可得到 高純度y-PGA。
在對發(fā)酵液沉淀分離聚谷氨酸之前，需要去枯草芽孢桿菌發(fā)酵液中的菌 體。菌體分離不僅是一步影響產(chǎn)品分離效果的關(guān)鍵操作，而且由于發(fā)酵液中菌 體中含有聚谷氨酸的降解酶，如不及時分離，將會對發(fā)酵液中的"PGA產(chǎn)生 降解，從而導致發(fā)酵液黏度的下降，影響產(chǎn)品收率。發(fā)酵液中細胞的分離通常 有重力沉降、離心分離、加壓過濾、膜分離等方法。重力沉降時間過長，會導 致，PGA的大量降解。離心分離中最常見的是差速離心，但？PGA發(fā)酵液黏 度很高，為了達到理想的分離效果，需要很高的離心力，能耗較高，難以用于 工業(yè)化生產(chǎn)。加壓過濾的壓差通常不能超過0.6Mpa,但對于高粘度的發(fā)酵液， 濾餅的阻力導致壓差的劇烈增加，因此在操作之前，要對發(fā)酵液進行預(yù)處理， 如加熱、在料液中加入助濾劑等，在聚谷氨酸發(fā)酵液分離過程中，由于產(chǎn)物聚 谷氨酸具有很強的吸附菌體的能力，導致過濾分離除菌效率有明顯的降低。在 生物產(chǎn)品分離中，微濾(MF)廣泛適用于細胞、細菌和微粒子的分離，目標 物質(zhì)的大小范圍為0.01pm 10,。以靜壓差為推動力，利用膜的"篩分"作用 進行分離，其作用相當于"過濾"。由于孔隙率占總體積的70% 80%，故阻力 很小，過濾速度較快。
微濾過程主要應(yīng)用于分離大分子、膠體粒子、蛋白質(zhì)以及其他微粒，它們 的分離機理是根據(jù)分子或微粒的物理化學性能、所使用膜的物理化學性能和它 們的相互作用(如大小、形狀和電性能)不同而實現(xiàn)分離的。微濾分離的過程 一般經(jīng)歷以下幾個階段①過濾初始階段，比膜孔徑大的粒子被截留在膜的表 面，而比膜孔徑小的粒子進入并通過膜孔，其中一些粒子由于各種力的作用而 被吸附于膜孔內(nèi)，減小了膜孔的有效直徑；②過濾中期階段，微粒開始在膜表 面形成濾餅層，膜孔內(nèi)吸附逐漸趨于飽和時；③過濾后期階段，隨著更多微粒 在膜表面被截留，膜孔內(nèi)吸附也趨于飽和，微粒開始堵塞膜孔，最終使膜通量 趨于穩(wěn)定，繼而不斷下降。
微濾除菌后的，PGA發(fā)酵液將會有一定程度的稀釋，如果直接進行沉淀 分離會消耗大量的沉淀劑，生產(chǎn)成本大幅提高，并且會造成有機溶劑污染。將 除菌后的發(fā)酵液用超濾儀進行濃縮，會減小后續(xù)分離中沉淀劑的使用量，有利 于降低成本，保護環(huán)境。稀釋超濾還可以實現(xiàn)發(fā)酵液的脫色，使目標產(chǎn)物的質(zhì) 量和外觀得到改善。超濾是一種篩孔分離過程，在靜壓差為推動力的作用下， 原料液中溶劑和小溶質(zhì)粒子從高壓的料液側(cè)透過膜到低壓側(cè)， 一般稱為淡液或透過液，而大粒子組分被膜所阻攔，使它們在濾剩液中的濃度增大。按照這樣 的分離機理，超濾膜具有選擇性表面層的主要因素是形成具有一定大小和形狀 的孔。超濾主要用于從液相物質(zhì)中分離大分子化合物(蛋白質(zhì)、核酸聚合物、 淀粉、天然膠、酶等)，膠體分散液(粘土，顏料，礦物料，乳液粒子，微生 物)，乳液(潤滑脂-洗滌劑以及油-水乳液)，從而達到某些含有高分子物質(zhì)(蛋 白質(zhì)、酶、病毒)的溶液的濃縮、分離、提純和凈化。
Y-PGA的生產(chǎn)和開發(fā)目前主要限于實驗室水平和中試水平。實驗室小規(guī)模 制備Y-PGA的主要步驟包括微生物轉(zhuǎn)化，除菌，濃縮，脫色，沉淀，干燥。 干燥后得到白色結(jié)晶僅是，PGA粗產(chǎn)品,還需要進一步純化。先將，PGA粗產(chǎn) 品溶解于蒸餾水中,離心除去不溶解的雜質(zhì),然后采用透析或電透析的方法除 鹽，然后將得到的，PGA水溶液進行真空冷凍干燥,即可得精制，PGA。調(diào)控 微生物發(fā)酵的條件是提高，PGA產(chǎn)量的關(guān)鍵，傳統(tǒng)的生產(chǎn)方法，發(fā)酵液中的 Y-PGA會不斷積累，造成黏度的不斷升高，傳質(zhì)阻力加大，溶氧的急劇下降， 菌體死亡，并且導致，PGA合成酶的活性下降，發(fā)酵液中？PGA的積累出現(xiàn) 停滯甚至下降趨勢，產(chǎn)量很難進一步提高。并且實驗室生產(chǎn)制備過程中各個單 元的操作都是相對獨立的，生產(chǎn)時間延長，生產(chǎn)效率降低，成本增加。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種微生物發(fā)酵和膜分離技術(shù) 耦合生產(chǎn)Y—聚谷氨酸的方法。
微生物發(fā)酵和膜分離技術(shù)耦合生產(chǎn)Y—聚谷氨酸的方法包括如下步驟
(1) 菌種活化從冷凍甘油管中取10微升菌液，稀釋后涂布于分離培養(yǎng)基，
37°C，培養(yǎng)12h;
(2) 種子培養(yǎng)將活化后的菌種接種到含種子培養(yǎng)基的種子瓶中，在37'C 轉(zhuǎn)速200rpm條件下培養(yǎng)12h，枯草芽孢桿菌種子培養(yǎng)基牛肉膏5g/L，蛋白胨10 g/L， NaCl 5g/L， pH6.5;
(3) 發(fā)酵培養(yǎng)生物反應(yīng)器中，枯草芽孢桿菌在發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)得 到富含Y—聚谷氨酸的發(fā)酵液，枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖60g/L，蛋 白胨60g/L，谷氯酸鈉80g/L， NaCl 10g/L， MgS04-7H20 1.0g/L， CaC12 1.0g/L， pH6.5;
(4) 微濾膜過濾枯草芽孢桿菌在生物反應(yīng)器中發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵液黏度和 細胞密度增加至30 40mPa.min時，開啟微濾系統(tǒng)，發(fā)酵液進入微濾裝置進行 過濾，截留液返回生物反應(yīng)器中，濾過液進入濃縮池；(5) 超濾濃縮濃縮池內(nèi)的液體積累到2 2.5L，開啟超濾系統(tǒng)進行濃縮 和脫色，截留液返回濃縮池形成濃縮液，透過液返回到生物反應(yīng)器中。
(6) 補料滅菌培養(yǎng)基以1.0ml/min泵入發(fā)酵罐內(nèi)，維持細胞生長和合成 聚谷氨酸的能力。
所述微濾裝置中使用的微濾膜材料包括有機膜材料，無機膜材料或復合 膜；有機膜材料為聚乙烯，聚丙稀，聚偏氟乙烯或聚四氟乙烯；無機膜材料 為多孔陶瓷，多孔玻璃或氧化鋁；復合膜為無機物填充聚合物膜，聚合物/ 無機支撐復合膜或無機/有機雜聚膜。微濾膜的孔徑為0.8pm、 l.O拜或1.2pm。 微濾膜組件為平板式、管式、巻式或中空纖維式。微濾膜過濾操作條件為溫 度30 40。C， pH6.0 7.0，壓力0.2 0.5MPa。超濾系統(tǒng)中使用的超濾膜材料 包括有機膜材料或無機膜材料；有機膜材料為醋酸纖維素、聚砜、聚砜酰胺、 磺化聚砜、聚丙稀腈、聚氯乙烯、聚偏氟乙烯、聚醚砜或聚醚酮；無機膜材料 為陶瓷、多孔玻璃或氧化鋁。超濾膜截流分子量為1-10萬。超濾膜組件為 平板式、管式、巻式或中空纖維式。超濾濃縮操作條件為溫度30 40°C， pH6.0 7.0，壓力0.2 0.5MPa。 、
本發(fā)明與現(xiàn)有聚谷氨酸發(fā)酵技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點和突出效果本發(fā)明 針對聚谷氨酸的高黏度性質(zhì)，在枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)聚谷氨酸的同時，利用 膜分離技術(shù)將發(fā)酵液中的聚谷氨酸及時分離濃縮，使發(fā)酵液的黏度維持在較低 水平，有利于增加發(fā)酵罐中的溶氧，降低高黏度的發(fā)酵液對菌體生長的抑制作
用，使枯草芽孢桿菌Y —聚谷氨酸合成酶系的活性始終維持在較高水平，進一 步提高Y一聚谷氨酸的產(chǎn)量。并且，本發(fā)明基于微生物發(fā)酵和膜分離技術(shù)相耦 合，實現(xiàn)了微生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)Y —聚谷氨酸的連續(xù)操作，有利于發(fā)酵液的后處 理和目標產(chǎn)物的精制，提高了生產(chǎn)效率，降低了生產(chǎn)成本。該方法操作條件溫 和，穩(wěn)定性好，快速高效，設(shè)備簡單，能耗低，能夠應(yīng)用于聚谷氨酸的工業(yè)化 生產(chǎn)，對微生物發(fā)酵制備高黏度的產(chǎn)物具有普遍的指導意義。 -


附圖為微生物發(fā)酵和膜分離技術(shù)耦合生產(chǎn)Y —聚谷氨酸的裝置結(jié)構(gòu)示意 圖，其中l(wèi)-l， 1-2， l-3為蠕動泵；2-1為可滅菌的玻璃容器；2-2為濃縮池；3 為生物反應(yīng)器；4為微濾過濾系統(tǒng)；5為超濾系統(tǒng)。
具體實施例方式
1.微濾膜過濾除菌過程條件優(yōu)化
(1)微濾膜過濾除菌過程操作溫度的優(yōu)化富含Y-PGA的發(fā)酵液黏度隨溫度的升高而降低，因此可適當提高溫度以 降低發(fā)酵液黏度，從而提高滲透通量。但溫度過高會造成？PGA的分解，.導 致產(chǎn)物收率下降，同時還要考慮微濾膜溫度耐受范圍。綜合以上情況，考察 30~60 °C溫度范圍內(nèi)各個溫度對滲透通量和除菌率的影響。
(2)微濾膜過濾除菌過程操作壓差的優(yōu)化
微濾膜過濾是以壓差為推動力的，所以壓差的選擇對過濾除菌過程有顯著 的影響，本文考察了在壓差范圍內(nèi)(0.2 0.5MPa)內(nèi)不同壓差對滲透通量和除 菌率的影響。
優(yōu)化結(jié)果表明，隨著溫度的增加，滲透通量同時提高，但在4(TC出現(xiàn)了轉(zhuǎn) 折，即溫度高于40'C時，滲透通量隨溫度的增加提高的不明顯。隨著溫度的上 升，除菌率也不斷提高，但在4(TC處出現(xiàn)轉(zhuǎn)折點，當溫度高于4(TC，隨著溫 度的升高除菌率提高不明顯。而操作壓差對除菌率幾乎沒有影響。綜合考慮滲 透通量、除菌率和濃縮液流速等上述參數(shù)，我們確定操作溫度范圍為30 40。C， 操作壓差在范圍為0.2 0.5MPa，除菌率最高可達97%以上。
2.超濾濃縮和脫色過程條件優(yōu)化
(1) 超濾濃縮和脫色過程操作溫度的優(yōu)化
采用與微濾膜過濾類似的方法，選擇不同溫度(30°C， 37°C， 40°C， 50°C， 60°C)下對滲透通量的影響。
(2) 超濾濃縮和脫色過程操作壓差的優(yōu)化
采用與微濾膜過濾類似的方法，選擇幾個不同的壓力差(0.2MPa， 0.3 MPa， 0.4MPa， 0.5MPa)對滲透通量的影響。
優(yōu)化結(jié)果表明，滲透通量隨壓差的升高先增加而后進入一個平臺期，即壓 差大于0.3MPa時，滲透通量幾乎不隨壓差而變化。隨著溫度升高，滲透通量 增加的趨勢減弱，當溫度大于4(TC時，再提高溫度滲透通量增加的不明顯。綜 合考慮以上因素，超濾儀操作條件如下溫度30 40。C，壓差0.2 0.5MPa。 實施例1:
結(jié)合圖1所示，利用枯草芽孢桿菌(^cz7/w w^'fc ZJU-7，菌種保藏號CGMCC No. 1250，在200410010509.0的專利文獻中公開)發(fā)酵和膜分離技術(shù)耦合生產(chǎn) 制備Y-PGA的步驟具體如下
(1)菌種活化從冷凍甘油管中取IO pl菌液，稀釋后涂布于分離培養(yǎng)基， 37"C培養(yǎng)12h。分離培養(yǎng)基牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L， NaCl 5 g/L,瓊脂 15g/L， pH7.0。(2) 種子培養(yǎng)將活化后的菌種接種到裝有30mL/250mL種子培養(yǎng)基的 250mL/1000mL搖瓶中，于200rpm， 37"c培養(yǎng)12h。種子培養(yǎng)基具體為枯草芽 孢桿菌種子培養(yǎng)基牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L， NaCl 5 g/L， pH6.5。
(3) 發(fā)酵罐培養(yǎng)發(fā)酵罐3裝液量70%，自動控制溫度和pH， 115"滅菌 30min，接種量5%(v/v)，發(fā)酵過程中用25°/。的濃氨水和4mol/L的鹽酸控制 pH=6.50±0.02，發(fā)酵溫度為37'c。發(fā)酵培養(yǎng)基具體為枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基 葡萄糖60 g/L，蛋白胨60 g/L,谷氨酸鈉80 g/L， NaCl 10 g/L， MgS04'7H20 1.0g/L， CaC12 1.0g/L， pH6.5，轉(zhuǎn)速為400 600rpm，通氣量為0.3 0.6vvm。
(4) 微濾膜過濾發(fā)酵開始以后，y-PGA不斷積累，發(fā)酵液黏度不斷增加。 當黏度達到30mPa.min時，開啟泵1-2，泵流速為10ml/min，將部分發(fā)酵培養(yǎng) 液泵入微濾膜過濾系統(tǒng)4，微濾膜為醋酸纖維膜，孔徑為1.2]im，膜包為板式 平面膜，操作溫度37'c，壓力(UMPa， pH6.5。截留液返回發(fā)酵罐中，濾過液 進入濃縮池2-2。除菌率達到97%。
(5) 超濾儀濃縮和脫色當濃縮池內(nèi)的除菌濾過液體積達到2L,開啟泵 1-3，泵流速為10ml/min，將濾過液泵入超濾儀5，進行濃縮和脫色。超濾膜為 聚偏氟乙烯膜，截留分子量為IOOKD，膜包為巻式膜，操作溫度37°C，壓力 0.3MPa， pH6.5。截留液返回濃縮池2-2，不含大分子的濾過液返回發(fā)酵罐3 中。發(fā)酵罐中發(fā)酵液的黏度始終維持在30 40mPa.min，含，PGA的發(fā)酵液濃 縮比為5。
(6) 容器2-l裝有滅菌的新鮮培養(yǎng)基，通過泵1-1以1.0ml/min的速度泵 入發(fā)酵罐內(nèi)，為細胞的生長和代謝提供必要的營養(yǎng)。新鮮培養(yǎng)基葡萄糖60 g/L，蛋白胨60g/L，谷氨酸鈉80g/L， NaCl 10g/L， MgS04*7H20 1.0g/L， CaC12 1.0g/L， pH6.5， 115。C滅菌30min。
微濾膜系統(tǒng)、超濾儀和膜組件SF-SA購自杭州賽菲膜分離技術(shù)有限公司。 利用此方法生產(chǎn)y-PGA,發(fā)酵結(jié)束后，y-PGA的積累量達到90g/L，與未
采用分離耦合的批次發(fā)酵相比，產(chǎn)量提高了 55%。
實施例2:
結(jié)合圖1所示，利用枯草芽孢桿菌(5a^7/船wZ^7&ZJU-7，菌種保藏號 CGMCCNo. 1250)發(fā)酵和膜分離技術(shù)耦合生產(chǎn)制備Y-PGA的步驟具體如下
(1) 菌種活化同實施事例l。
(2) 種子培養(yǎng)同實施事例l。
(3) 發(fā)酵罐培養(yǎng)同實施事例l。(4) 微濾膜過濾發(fā)酵開始以后，Y-PGA不斷積累，發(fā)酵液黏度不斷增加。 當黏度達到30mPa.min時，開啟泵1-2，泵流速為10ml/min，將部分發(fā)酵哮養(yǎng) 液泵入微濾膜過濾系統(tǒng)4，微濾膜為聚醚砜，孔徑為l.Opm，膜包為板式平面 膜，操作溫度37。C，壓力0.5MPa， pH6.5。截留液返回發(fā)酵罐中，濾過液進入 濃縮池2-2。除菌率達到99%。
(5) 同實施事例1。
(6) 同實施事例1。
微濾膜系統(tǒng)、超濾儀和膜組件SF-SA購自杭州賽菲膜分離技術(shù)有限公司。 利用此方法生產(chǎn)？PGA，發(fā)酵結(jié)束后，，PGA的積累量達到92g/L，與未
采用分離耦合的批次發(fā)酵相比，產(chǎn)量提高了59%。
實施例3:
結(jié)合圖1所示，利用枯草芽孢桿菌(&c///m^6"/&ZJU-7，菌種保藏號 CGMCCNo. 1250)發(fā)酵和膜分離技術(shù)耦合生產(chǎn)制備^PGA的步驟具體如下
(1) 菌種活化同實施事例l。
(2) 種子培養(yǎng)同實施事例1。
(3) 發(fā)酵罐培養(yǎng)同實施事例l。
(4) 微濾膜過濾同實施事例2。
(5) 超濾儀濃縮和脫色當濃縮池內(nèi)的除菌濾過液體積達到2L，開啟泵 1-3，泵流速為10ml/min，將濾過液泵入超濾儀5，進行濃縮和脫色。超濾膜為 中空纖維膜，截留分子量為150KD，膜包為巻式膜，操作溫度37°C，壓力 0.5MPa， pH6.5。截留液返回濃縮池2-2,不含大分子的濾過液返回發(fā)酵罐3 中。發(fā)酵罐中發(fā)酵液的黏度始終維持在30 40mPa.min，含，PGA的發(fā)酵液濃 縮比為6。 '
(6)同實施事例1。 微濾膜系統(tǒng)，超濾儀和膜組件SF-SA購自杭州賽菲膜分離技術(shù)有限公司。 禾[J用此方法生產(chǎn)？PGA，發(fā)酵結(jié)束后，？PGA的積累量達到87g/L，與未
采用分離耦合的批次發(fā)酵相比，產(chǎn)量提高了50%。
實施例4:
結(jié)合圖1所示，利用枯草芽孢桿菌(^c///wsw^z7&ZJU-7，菌種保藏號 CGMCCNo. 1250)發(fā)酵和膜分離技術(shù)耦合生產(chǎn)制備？PGA的步驟具體如下
(1) 菌種活化同實施事例l。
(2) 種子培養(yǎng)同實施事例1。(3) 發(fā)酵罐培養(yǎng)同實施事例l。
(4) 微濾膜過濾發(fā)酵開始以后，"PGA不斷積累，發(fā)酵液黏度不斷增加。 當黏度達到30mPa.min時，開啟泵1-2，泵流速為10ml/min,將部分發(fā)酵培養(yǎng) 液泵入微濾膜過濾系統(tǒng)4，微濾膜為陶瓷膜，孔徑為0.8|im，膜組件為巻式， 操作溫度37"C，壓力0.4MPa， pH6.5。截留液返回發(fā)酵罐中，濾過液進入濃縮 池2-2。陶瓷膜的滲透通量遠高于有機膜，除菌率達到95%，略低于有機膜。
(5) 超濾儀濃縮和脫色當濃縮池內(nèi)的除菌濾過液體積達到2.5L，開啟泵 1-3，泵流速為10ml/min，將濾過液泵入超濾儀5，進行濃縮和脫色。超濾膜為 中空纖維膜，截留分子量為150KD，膜包為巻式膜，操作溫度37°C，壓力 0.3MPa， pH6.5。截留液返回濃縮池2-2，不含大分子的濾過液返回發(fā)酵罐3 中。發(fā)酵罐中發(fā)酵液的黏度始終維持在30~40mPa.min，含，PGA的發(fā)酵液濃 縮比為6。
(6)同實施事例1。
微濾膜系統(tǒng)購自南京久吾膜科技有限公司，超濾儀和膜組件SF-SA購自杭 州賽菲膜分離技術(shù)有限公司。
利用此方法生產(chǎn)，PGA，發(fā)酵結(jié)束后，，PGA的積累量達到90g/L，與未 采用分離耦合的批次發(fā)酵相比，產(chǎn)量提高了55%。 實施例5:
結(jié)合圖1所示，利用枯草芽孢桿菌(5a"7/wss"^'feZJU-7，菌種保藏號 CGMCCNo. 1250)發(fā)酵和膜分離技術(shù)耦合生產(chǎn)制備y-PGA的步驟具體如下
(1) 菌種活化同實施事例l。
(2) 種子培養(yǎng)同實施事例l。
(3) 發(fā)酵罐培養(yǎng)同實施事例l。
(4) 微濾膜過濾同實施事例4。
(5) 超濾儀濃縮和脫色當濃縮池內(nèi)的除菌濾過液體積達到2L，開啟泵 1-3，泵流速為10ml/min，將濾過液泵入超濾儀5，進行濃縮和脫色。超濾膜為 中空纖維膜，截留分子量為500KD,膜包為巻式膜，操作溫度37°C，壓力 0.3MPa， pH6.5。截留液返回濃縮池2-2，不含大分子的濾過液返回發(fā)酵罐3 中。發(fā)酵罐中發(fā)酵液的黏度始終維持在30 40mPa.min，含？PGA的發(fā)酵液濃 縮比為7。
(6)同實施事例1。
微濾膜系統(tǒng)購自南京久吾膜科技有限公司，超濾儀和膜組件SF-SA購自杭州賽菲膜分離技術(shù)有限公司。
利用此方法生產(chǎn)y-PGA，發(fā)酵結(jié)束后，y-PGA的積累量達到84g/L，與未 采用分離耦合的批次發(fā)酵相比，產(chǎn)量提高了43%。 '
本發(fā)明將，PGA生產(chǎn)工藝中的微生物發(fā)酵和膜分離技術(shù)相耦合，實現(xiàn)了 微生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)y一聚谷氨酸的連續(xù)操作，有利于發(fā)酵液的后處理和目標產(chǎn) 物的精制，提高了生產(chǎn)效率，降低了生產(chǎn)成本。該方法操作條件溫和，穩(wěn)定性 好，快速高效，設(shè)備簡單，投入低，對微生物發(fā)酵制備高黏度的產(chǎn)物具有普遍 的指導意義，在工業(yè)界具有廣闊的應(yīng)用前景。
權(quán)利要求
1、一種微生物發(fā)酵和膜分離技術(shù)耦合生產(chǎn)γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于包括如下步驟(1)菌種活化從冷凍甘油管中取10微升菌液，稀釋后涂布于分離培養(yǎng)基，37℃，培養(yǎng)12h；(2)種子培養(yǎng)將活化后的菌種接種到含種子培養(yǎng)基的種子瓶中，在37℃轉(zhuǎn)速200rpm條件下培養(yǎng)12h，枯草芽孢桿菌種子培養(yǎng)基牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，pH6.5；(3)發(fā)酵培養(yǎng)生物反應(yīng)器中，枯草芽孢桿菌在發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)得到富含γ-聚谷氨酸的發(fā)酵液，枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖60g/L，蛋白胨60g/L，谷氨酸鈉80g/L，NaCl 10g/L，MgSO4·7H2O 1.0g/L，CaCl21.0g/L，pH6.5；(4)微濾膜過濾枯草芽孢桿菌在生物反應(yīng)器中發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵液黏度和細胞密度增加至30～40mPa.min時，開啟微濾系統(tǒng)，發(fā)酵液進入微濾裝置進行過濾，截留液返回生物反應(yīng)器中，濾過液進入濃縮池；(5)超濾濃縮濃縮池內(nèi)的液體積累到2～2.5L，開啟超濾系統(tǒng)進行濃縮和脫色，截留液返回濃縮池形成濃縮液，透過液返回到生物反應(yīng)器中。(6)補料滅菌培養(yǎng)基以1.0ml/min的速度泵入發(fā)酵罐內(nèi)，維持細胞生長和合成聚谷氨酸的能力。
2、 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述微濾裝置中使用的微濾膜 材料包括有機膜材料，無機膜材料或復合膜；有機膜材料為聚乙烯，聚丙稀， 聚偏氟乙烯或聚四氟乙烯；無機膜材料為多孔陶瓷，多孔玻璃或氧化鋁r復 合膜為無機物填充聚合物膜，聚合物/無機支撐復合膜或無機/有機雜聚膜。
3、 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述的微濾膜的孔徑為0.8(im、 l.Onm或1.2[jm。
4、 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述微濾裝置中使用的微濾膜 組件為平板式、管式、巻式或中空纖維式。
5、 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于所述的微濾膜過濾操作條件為-溫度30 40。C， pH6.0 7.0，壓力0.2 0,5MPa。
6、 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的超濾系統(tǒng)中使用的超濾 膜材料包括有機膜材料或無機膜材料；有機膜材料為醋酸纖維素、聚砜、聚 砜酰胺、磺化聚砜、聚丙稀腈、聚氯乙烯、聚偏氟乙烯、聚醚砜或聚醚酮；無機膜材料為陶瓷、多孔玻璃或氧化鋁。
7、 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所使用的超濾膜截流分子量為1國10萬。
8、 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的超濾系統(tǒng)中使用的超濾 膜組件為平板式、管式、巻式或中空纖維式。
9、 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于超濾濃縮操作條件為溫度30 40°C， pH6.0 7.0，壓力0.2 0.5MPa。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種微生物發(fā)酵和膜分離技術(shù)耦合生產(chǎn)γ-聚谷氨酸的方法。本發(fā)明針對發(fā)酵過程中由于產(chǎn)物聚谷氨酸導致發(fā)酵液的粘度不斷升高，嚴重影響發(fā)酵過程中的菌體生長和溶氧供應(yīng)等難題，提出發(fā)酵與分離相耦合的方法，其步驟包括菌種活化，種子培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)，微濾膜過濾，超濾濃縮和補料。采用此方法可以使發(fā)酵液黏度維持在較低水平，從而有利于增加發(fā)酵罐中的溶氧，降低產(chǎn)物的高黏度對菌體生長的抑制作用，提高γ-PGA的產(chǎn)量和發(fā)酵產(chǎn)率，降低了生產(chǎn)成本，并有利于發(fā)酵液的后處理和產(chǎn)物的精制。該方法操作條件溫和，穩(wěn)定性好，快速高效，設(shè)備簡單，投入低，對微生物發(fā)酵制備高黏度生物聚合物的生產(chǎn)具有普遍的指導意義，在工業(yè)界具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號C08G69/00GK101538593SQ20091009763
公開日2009年9月23日 申請日期2009年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月13日
發(fā)明者呂忠良, 斌 張, 徐志南, 杜銀明, 謹 蔡 申請人:浙江大學