專利名稱：：黃芪多糖的提取和分子修飾方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明為黃芪多糖(Astragaluspolydsaccharide，APS)的提取和分子修飾方法，屬于提高中藥多糖結(jié)構(gòu)改造研究領(lǐng)域。二
背景技術(shù)：
：多糖是生物體內(nèi)除蛋白質(zhì)和核酸外又一類重要的生物大分子物質(zhì)，具有抵抗感染、增強(qiáng)免疫、防治腫瘤和病毒性肝炎、類風(fēng)濕癥、艾滋病等免疫損傷或免疫缺損癥和抗氧化等多方面的功能和生物活性。隨著化學(xué)和生物學(xué)的快速發(fā)展和分離技術(shù)的提高，多糖的生物學(xué)功能，特別是作為生命物質(zhì)參與生命的全部時(shí)間和空間功能，突破了多糖作為支持組織和能量來源的傳統(tǒng)觀念，發(fā)現(xiàn)其具有更廣泛的生物學(xué)功效，特別是具有免疫增強(qiáng)、抗病毒等功效使得多糖物質(zhì)成為人類及動(dòng)植物醫(yī)療、保健、病蟲害防治領(lǐng)域的重要成員。多糖的研究已成為天然藥物研究和生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。在對多糖的結(jié)構(gòu)及其活性的研究中，科技人員注意到以下問題①自然界中存在的多糖并不都具有活性。②有些多糖由于結(jié)構(gòu)或理化性質(zhì)等障礙而不利于其生物學(xué)活性的發(fā)揮。③也有些多糖盡管藥效良好，但同時(shí)也會(huì)產(chǎn)生一些不良反應(yīng)，甚至毒副作用。④有些從天然生物體內(nèi)分離的多糖活性較弱，有待進(jìn)一步提高。因此，采取一定的方法對多糖結(jié)構(gòu)進(jìn)行適當(dāng)修飾是解決以上問題的根本途徑，通過結(jié)構(gòu)修飾能提高或賦予多糖活性、降低某些多糖的毒副作用。黃芪是補(bǔ)腎壯陽中藥，其有效成分黃芪多糖具有顯著的抗病毒和增強(qiáng)免疫作用。本研究室前期以黃芪為主藥研制成功中藥芪藍(lán)抗毒飲。為進(jìn)一步提高中藥芪藍(lán)抗毒飲的功效，本發(fā)明首次對黃芪多糖進(jìn)行分子修飾，發(fā)現(xiàn)硫酸化修飾能進(jìn)一步黃芪多糖的抗病毒和增強(qiáng)免疫活性；以篩選出硫酸化黃芪多糖替代芪藍(lán)抗毒飲中的黃芪或加味后，方劑的抗病毒效果進(jìn)一步增強(qiáng)。三
發(fā)明內(nèi)容技術(shù)問題本發(fā)明針對中藥多糖生物活性低的問題，提供黃貧多糖的提取和分子修飾方法，達(dá)到尋找活性最強(qiáng)的黃芪多糖和進(jìn)一步提高黃芪多糖的生物活性的目的。技術(shù)方案黃芪多糖的分子修飾方法，其特征在于，用氯磺酸一吡啶法對黃芪多糖進(jìn)行硫酸化分子修飾，其修飾條件為反應(yīng)溫度95°C、氯磺酸與吡啶的質(zhì)量配比為1:6、反應(yīng)時(shí)間1h。所用黃芪多糖的提取方法為分步醇沉法，取黃芪煎液第一次緩慢加入乙醇使終濃度達(dá)50%，去沉淀；上清液再加入乙醇使終濃度達(dá)60%，取沉淀得到粗多糖，純化而得。以篩選出的硫酸化黃芪多糖替代芪藍(lán)抗毒飲中的黃芪或加味后，比較方劑的抗病毒和增強(qiáng)免疫效果。有益效果1、建立了黃芪多糖的硫酸化分子修飾方法，以產(chǎn)物量和硫酸根取代度為指標(biāo)，以反應(yīng)溫度、試劑配比、反應(yīng)時(shí)間為因素，通過正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了黃芪多糖硫酸化修飾的條件為反應(yīng)溫度95°C、氯磺酸與吡啶的配比1:6、反應(yīng)時(shí)間1h。2、比較了黃芪多糖硫酸化分子修飾前后的生物活性變化，證明硫酸化修飾能進(jìn)一步提高后黃芪多糖的抗病毒和增強(qiáng)免疫活性。3、比較了一步醇沉和分步醇沉法所得黃芪多糖經(jīng)硫酸化分子修飾以后的活性變化，證明分步醇沉中以醇沉濃度為60%的效果最好，所得黃芪多糖經(jīng)硫酸化修飾后其抗病毒和增強(qiáng)免疫活性最強(qiáng)。4、以篩選出的硫酸化黃芪多糖sAPS6o替代芪藍(lán)抗毒飲中的黃芪或加味后，方劑的抗病毒和增強(qiáng)免疫效果進(jìn)一步增強(qiáng)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)如下1、首次建立了黃芪多糖的硫酸化分子修飾方法，優(yōu)化了黃芪多糖硫酸化分子修飾的條件。2、首次比較了黃芪多糖硫酸化分子修飾前后的生物活性變化，證明硫酸化修飾能進(jìn)一步提高后黃芪多糖的抗病毒和增強(qiáng)免疫活性。3、首次比較了一步醇沉和分步醇沉法所得黃芪多糖經(jīng)分子修飾后的活性變化，證明分步醇沉中醇沉濃度為60%時(shí)的效果最好，所得黃芪多糖經(jīng)純化和修飾后其抗病毒和增強(qiáng)免疫活性最強(qiáng)。4、以篩選出的硫酸化黃芪多糖替代芪藍(lán)抗毒飲中的黃芪或加味后，進(jìn)一步提高了方劑的抗病毒效果。具體實(shí)施例方式1.黃芪多糖的提取取內(nèi)蒙古黃芪4kg按l:8的比例加入水，用武火煮至沸騰后，再用文火煮1.0h，濾出藥渣，藥渣再按l:6的比例加入水，按同法再煎煮2次，合并3次濾液，加熱濃縮至4kg(lg生藥/mL)。(l)一步醇沉法取lkg藥液一次緩慢加入乙醇使終濃度達(dá)70X，攪拌，靜置沉淀24h，抽濾。取沉淀加入5倍體積的蒸餾水溶解，靜置5h，3000r/min離心10min除去沉淀。上清液重復(fù)沉淀l次，取沉淀6(TC干燥3d，得粗總黃芪多糖(APSt)。(2)分步醇沉法取3kg藥液第一次緩慢加入乙醇使終濃度達(dá)30X，取沉淀；上清液再加入乙醇使終濃度達(dá)40%，取沉淀；上清液再加入乙醇使終濃度達(dá)50%，取沉淀；上清液再加入乙醇使終濃度達(dá)60%，取沉淀；上清液再加入乙醇使終濃度達(dá)70%,取沉淀；上清液再加入乙醇使終濃度達(dá)80%，取沉淀。分別得到各級分粗多糖，標(biāo)記為APS,APS40、APS50、APS60、APS7o和APS80。2.黃芪多糖的純化(1)三氯乙酸法去蛋白稱取各粗多糖14g，溶解于140mL蒸餾水中，60。C水浴加熱使溶解完全。加入10%NaOH調(diào)pH至7，加入3%三氯乙酸，使占藥液體積的7.5%，4。C靜置4h，3000r/min離心20min，取上清液。(2)去色素去蛋白所得多糖溶液加入1%活性炭，文火煮沸10min，冷卻，抽濾去除沉淀，4。C過夜，3000r/min離心20min，除去沉淀。(3)柱層析將上一步多糖溶液濃縮至50mL上D1Q1柱(2.6x30cm)，用蒸餾水洗脫，至加乙醇無沉淀；收集洗脫液濃縮至小體積，上ADS-7柱(2.6x30cm)，用蒸餾水洗脫，至加乙醇無沉淀；收集洗脫液濃縮至小體積，上DEAEA-25柱，0.1MNaCl梯度洗脫，9min/管，蒽酮-濃硫酸法檢測多糖；合并含糖管液，自來水透析48h，去離子水透析24h;濃縮，上SephadexG-75柱，O.lMNaCl洗脫，流速1920mL/h，分部收集，4ml/管，蒽酮一濃硫酸法檢測多糖；合并含糖管溶液，濃縮，蒸餾水透析過夜，濃縮，加入95%乙醇，沉淀置6(TC真空干燥，得各純黃芪多糖。3.黃芪多糖的硫酸化修飾(1)修飾條件的優(yōu)化將帶有攪拌和冷凝裝置的三頸燒瓶置冰鹽水浴中，加入25mL無水吡啶，快速攪拌，充分冷卻后，按表1設(shè)定的氯磺酸-吡啶體積比逐滴加入氯磺酸，于40min內(nèi)加完。反應(yīng)結(jié)束后，撤去冰鹽水浴。共制備9種酯化試劑。表1L9(3,正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>精確稱取黃芪多糖400mg，分別加入到9種酯化試劑中，按表l設(shè)定的水浴溫度和反應(yīng)時(shí)間分別在水浴中攪拌反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，反應(yīng)液加入預(yù)冷的100mL冰水中，用飽和的NaOH溶液中和至pH7.5。加入3倍體積的無水乙醇，靜置24h，取沉淀用自來水透析2d、蒸餾水透析1d，透析液冷凍干燥得硫酸化黃芪多糖(sulfatedAPS,sAPS)。共得到9種sAPS(表2)。用氯磺酸一吡啶法進(jìn)行硫酸化修飾，以產(chǎn)物量和硫酸基取代度為指標(biāo)，以反應(yīng)溫度、試劑配比和反應(yīng)時(shí)間為因素，按L9(3,正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化修飾條件。結(jié)果，最高硫酸基取代度的組合是A3B!C3，為0.898;產(chǎn)物量較大的組合分別是A2B"2、A3B《3、A3B3d，分別為271、252、245mg(表2)。綜合考慮最佳條件為反應(yīng)溫度95°C、氯磺酸與吡啶的配比為1:6、反應(yīng)時(shí)間1h。表2L9(3"正交試驗(yàn)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>產(chǎn)物量<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>(2)黃芪多糖的硫酸化修飾鑒于APS3。的主要成分為淀粉，APS7。和APS8Q的得率太低，這3種在進(jìn)一步的研究中被舍棄。用優(yōu)化的修飾條件分別對APSt、APS4Q、APS5o和APS6o進(jìn)行硫酸化修飾，得4種硫酸化黃芪多糖(SulfatedAPSs)sAPSt、sAPS40、sAPSso和sAPS60。各修飾多糖的硫酸基取代度和產(chǎn)物量見表3。表3各修飾多糖的硫酸基取代度和產(chǎn)物量<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>(3)硫酸化黃芪多糖的紅外光譜鑒定經(jīng)溴化鉀壓片，用NicoletFT-IR360型傅立葉變換紅外光譜儀記錄紅外光譜。結(jié)果，在sAPS的光譜圖上除了有多糖的吸收特征外，在1733cm"處出現(xiàn)一個(gè)由于C二0的伸縮振動(dòng)新的吸收峰，而且還有2個(gè)特征性的吸收峰一個(gè)在1235cm—1處，為不對稱8=0伸縮振動(dòng)吸收峰；另一個(gè)在812cm"處，為與C-0-S03基團(tuán)有關(guān)的對稱性C-O-S吸收峰。這兩個(gè)特征性吸收峰證明了硫酸基已經(jīng)和多糖結(jié)合成酯。4.硫酸化黃芪多糖的生物活性比較(1)sAPSs對IBDV感染CEF能力的影響首先測定4種硫酸化黃芪多糖(sAPSt、sAPS4。、sAPS5。、sAPSe。和未修飾的黃茛多糖(APSt)對雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)最大安全濃度，在此基礎(chǔ)上，將安全濃度范圍內(nèi)的各多糖分別與雞傳染性法氏囊病毒(IBDV)加入到CEF的培養(yǎng)體系中，用MTT法比較各多糖對IBDV感染CEF能力的影響C4，值的變化，當(dāng)多糖組的X訓(xùn)值顯著大于病毒對照組時(shí)，表明多糖有顯著的抗病毒作用)。結(jié)果，未修飾的APSt只有最大濃度4.883ug/mL時(shí)的A570值顯著大于病毒對照組(P<0.05)，修飾的sAPS60的5個(gè)濃度組、sAPSso的前4個(gè)濃度組、sAPS50在2.4410.61ug/mL和sAPSt在4.8832.441ug/mL濃度范圍內(nèi)各組的X，值顯著大于病毒對照組(P<0.05)(表4)。表明它們在這些濃度顯著促進(jìn)CEF抵抗IBDV感染，且修飾的sAPS較未修飾的APS抗病毒活性顯著增強(qiáng)。表4sAPSs對IBDV感染CEF能力的影晌(Aw值)組別多糖濃度(ug/mL-l)4.8832.4411,2210.6100.305APSt0.345±0.026a0.232±0.051c0.228±0.018c0.172±0.019e0.083±0.028dsAPSt0.323±0.049ab0.300±0.071ab0.237±0.043c0.201±0.037c0.134±0.026csAPS400.218±0.020be0.280±0.011ab0.270±0.022b0.248±0.033b0.232士0馬bsAPS5。0.270±0.044ab0.293±0.022ab0.293±0.052a0.338±0.048a0.220±0.031bsAPS600.443±0.035a0.312±0.023ab0.293±0.033a0.282±0.038a0.270±0.021a病毒對照0.207±0.034c0.207±0.034c0.207±0.034c0.207±0.034c0.207±0.034b細(xì)胞對照0.318±0.044ab0.318±0.044ab0.318±0.044a0.318±0.044a0.318±0.044a注同列數(shù)據(jù)標(biāo)注不同字母者差異顯著(P<0.05)。(2)sAPSs對NDV感染CEF能力的影響將安全濃度范圍內(nèi)的各多糖分別與雞新城疫病毒(NDV)加入到CEF的培養(yǎng)體系中，用MTT法比較各多糖對NDV感染CEF能力的影響。結(jié)果，未修飾的APSt的前4個(gè)濃度組的J57C值與病毒對照組的差異不顯著，修飾的SAPS6Q的5個(gè)濃度組、sAPS5Q的前4個(gè)濃度組的Aw值顯著大于病毒對照組(PO.05)(表5)。表明它們在這些濃度顯著促進(jìn)CEF抵抗NDV感染，且修飾的sAPS較未修飾的APS抗病毒活性顯著增強(qiáng)。表5sAPSs對NDV感染CEF能力的影響C4訓(xùn)值)多糖濃度(ug/mL)4.8832.4411.2210.6100.305APSt0.127±0.029c0.195±0.031b0.255±0.048bcd0.308±0.068bcde0.235±0.063absAPSt0.240±0.045bc0.218±0.039b0.210±0.053c0.120±0.02e0.113±0.015dsAPS4Q0.172±0.066c0.113±0.015b(U73士0.043^0.278±0.038bcde0.204±0.022esAPS5。0.307±0.060ab0.383±0.028a0.360士0.0373110.368±0.030abc0.173±0.027csAPS600.307±0.045ab0.415±0.060a0.368±0.060ab0.428±0.057ab0.293±0.012b病毒對照0.184i0.033e0.184±0.033b0.184士0.033"10.184±0.033de0.184±0.033c細(xì)胞對照_0.505±0.045a0.505±0.045a0.505±0.045a0.505±0.045a0.505±0.045a(3)sAPSs對雛雞人工感染ND的療效比較18日齡蛋公雞150只，隨機(jī)均分為6組，每組25只。第14組為4個(gè)多糖治療組，第5組為病毒對照組(攻毒不治療)，第6組為空白對照組(不攻毒，不治療)，隔離伺養(yǎng)。各多糖組、病毒對照組每只肌肉注射ND病毒0.5mL，攻毒6h后多糖治療組開始分別飲水給藥，lmL/只，每天1次，連續(xù)3d。每天記錄各組死亡數(shù)，至攻毒后停止死亡時(shí)(D14)計(jì)算死亡率。結(jié)果，APSt、sAPS40、sAPS5o、sAPS6o組的死亡率均低于病毒對照組，其中sAPS6o組的死亡率顯著低于病毒對照組(尸<0.05)(表6)。說明sAPS6o治療ND有明顯的效果，sAPS4()和sAPSso也有一定的效果。表6各組死亡數(shù)和死亡率<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>*與病毒對照組相比差異顯著(i30.05)。(4)sAPSs對新城疫疫苗免疫雛雞血清抗體效價(jià)的影響14日齡雛雞200只隨機(jī)均分為10組，在用新城疫弱毒苗免疫的同時(shí)，6個(gè)試驗(yàn)組分別肌肉注射高、低劑量的3種修飾的硫酸化黃芪多糖(sAPSs)sAPS4。、sAPSs。和sAPS6Q，2個(gè)多糖對照組注射高、低劑量的未修飾的黃芪多糖(APSt)，無佐劑對照組注射等量生理鹽水，每天1次，連續(xù)3d，空白對照隔離飼養(yǎng)。分別于免疫后第7、14、21、28d翼靜脈采血測定血清抗體效價(jià)的變化；于免疫后第14、21、28和35d心臟采血，用MTT法測定T淋巴細(xì)胞增殖。結(jié)果，免疫后14d，sAPS4GH、sAPS5附和sAPS50L組的ND-HI抗體效價(jià)顯著大于無佐劑對照組和APSt的高、低劑量組CPO.05);免疫后21d，sAPS墨、sAPSsoh、sAPS5ol、sAPS細(xì)、sAPS亂、APStH和APStL組的ND-HI抗體效價(jià)顯著大于無佐劑對照組CPO.05),sAPS60H組顯著大于APStL組；免疫后28d，sAPS肌和sAPS亂組的ND-HI抗體效價(jià)顯著大于無佐劑對照組和APSt的高、低劑量組(P0.05)(表7)。表明3個(gè)修飾多糖在一定的劑量均能提高顯著血清的NDV抗體效價(jià)，在一定的時(shí)間點(diǎn)的作用強(qiáng)于APSt。表7各組血清ND-HI抗體效價(jià)的動(dòng)態(tài)變化<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注同列數(shù)據(jù)標(biāo)注不同字母者差異顯著(f0.05)，H高劑量，L低劑量，下表同。(5)sAPSs對新城疫疫苗免疫雛雞外周血淋巴細(xì)胞增殖的影響試驗(yàn)設(shè)計(jì)同上，分別于免疫后第14、21、28和35d心臟采血，用MTT法測定T淋巴細(xì)胞增殖。結(jié)果，免疫后14d，sAPS4附、sAPS亂、sAPS肌、sAPS60H、sAPS亂和APS仏組的^570值顯著大于無佐劑對照組(P<0.05)，sAPS4ql和sAPS60L組顯著大于APSt的高、低劑量組CPO.05);免疫后21d，SAPS肌、SAPS50L和SAPS60L組的爿570值顯著大于無佐劑對照組和APStH組(P<O.05);免疫后28d，各多糖組的J57o值均顯著大于無佐劑對照組(P<0.05)，sAPS亂組顯著大于APSt的高、低劑量組CPO.05);免疫后35d，sAPS50H和APStH組的A570值顯著大于無佐劑對照組(P<0.05)，sAPSsoH組顯著大于APS&組(P<0.05)(表8)。表明3個(gè)修飾多糖在一定的時(shí)間點(diǎn)均能顯著促進(jìn)雛雞外周血T淋巴細(xì)胞增殖，作用強(qiáng)于APSt。表8外周血T淋巴細(xì)胞增殖的動(dòng)態(tài)變化04570)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>complextableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>以上結(jié)果表明，3種修飾多糖均能顯著提高新城疫血清抗體效價(jià)、促進(jìn)T淋巴細(xì)胞增殖，作用強(qiáng)于未修飾多糖，并有一定的量效和時(shí)效關(guān)系，高劑量提高血清抗體效價(jià)、低劑量促進(jìn)T淋巴細(xì)胞增殖的效果較好，綜合評價(jià)以sAPSe。最好。(6)sAPSs對法氏囊疫苗免疫雛雞血清抗體效價(jià)的影響14日齡雛雞200只，隨機(jī)均分為10組，6個(gè)試驗(yàn)組分別肌肉注射高、低劑量的3種修飾的硫酸化黃萬多糖(sAPSs)sAPS4。、sAPSs。和sAPS6。，2個(gè)多糖對照組注射高、低劑量的未修飾的黃芪多糖(APSt)，無佐劑對照組注射等量生理鹽水，每天1次，連續(xù)3d，在給藥后4d用法氏囊苗免疫，兩周后進(jìn)行法氏囊苗二免。分別于一免后第7、14、21、28d翼靜脈采血測定血清抗體效價(jià)。結(jié)果，一免后第7、14d，用瓊脂擴(kuò)散法測不出血清中IBD抗體效價(jià)。一免后21d(二免后7d)，sAPS亂和sAPS亂組的IBD抗體效價(jià)顯著大于無佐劑對照組(尸<0.05)，sAPS6QL的IBD抗體效價(jià)顯著大于APSt的高、低劑量組CPO.05);—免后28d(二免后14d)，所有硫酸化黃芪多糖高、低劑量組和APSt高劑量組的IBD抗體效價(jià)均顯著大于無佐劑對照組和APSt低劑量組(尸0.05)(表9)。表明3個(gè)修飾多糖在一定的劑量均能顯著提高血清的IBD抗體效價(jià)，在一定的時(shí)間點(diǎn)的作用強(qiáng)于APSt。表9各組血清IBD抗體效價(jià)的動(dòng)態(tài)變化<table>complextableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>無佐劑對照1.7±0.577e2.0±0.408d_空白對照_2.0±0.245e_2.0±0.000d注同列數(shù)據(jù)標(biāo)注不同字母者差異顯著(P0.05)，H高劑量，L低劑量。(7)sAPSs對法氏囊疫苗免疫雛雞外周血淋巴細(xì)胞增殖的影響試驗(yàn)設(shè)計(jì)同上，分別于一免后第7、14、21、28d心臟采血測定T淋巴細(xì)胞增殖。結(jié)果，一免后7d，sAPS柳、sAPS孤、sAPS弧、sAPS,、sAPS亂和APSa組的4。值顯著大于無佐劑對照組(P<0.05)，sAPS艦和sAPS亂組顯著大于APSt的高、低劑量組(尸<0.05);免疫后14d，sAPS肌、sAPS弧和sAPS亂組的庵。值顯著大于無佐劑對照組和APStH組(代O.05);免疫后21d，各多糖組的1。值均顯著大于無佐劑對照組CP0.05)，sAPS亂組顯著大于APSt的高、低劑量組(PO.05);免疫后28d,sAPS,和APS幼組的戽。值顯著大于無佐劑對照組(代O.05)，sAPS5。H組顯著大于APStL組(代O.05)(表10)。表明3個(gè)修飾多糖在一定的時(shí)間點(diǎn)均能顯著促進(jìn)雛雞外周血T淋巴細(xì)胞增殖，作用強(qiáng)于APSt。表10外周血T淋巴細(xì)胞增殖的動(dòng)態(tài)變化(j570)組別D7D14D21D28sAPS鵬0.316±0.076cd0.214±0.081cd0.331±0.084c0.183±0.084besAPS40L0.626±0.096a0.448±0.028ab0.444±0.063bc0.141±0.049csAPS測0.167±0.057ef0.178±0.065cd0.501±0.011ab0.262±0.017asAPS50L0.263±0.067cd0.548±0.030a0.394±0.013e0.153±0.045bcsAPS60H0.218±0.052de0.132±0.019d0.488±0.098b0.195±0.081bcsAPS60L0.434±0.018b0.342±0.015b0.592±0.018a0,184±0.048beAPStH0.161±0.038ef0.194±0.035cd0.377±0.078bc0.208±0.019abAPStL0.266±0.012ed0.27±0.093bc0.292±0.042e0.145±0.028e無佐劑對照0.111±0.017f0.21±0.033cd0.185±0.055d0.163±0.071c空白對照0.149±0.043f0.123±0.035d0.151±0.010d0.152±0.045c以上結(jié)果表明，3種修飾多糖均能顯著提高法氏囊血清抗體效價(jià)、促進(jìn)T淋巴細(xì)胞增殖，作用強(qiáng)于未修飾多糖，并有一定的量效和時(shí)效關(guān)系，高劑量提高血清抗體效價(jià)、低劑量促進(jìn)T淋巴細(xì)胞增殖的效果較好，綜合評價(jià)以sAPSe。最好。(8)sAPS6。替代茛藍(lán)抗毒飲中黃茛或加味對雛雞人工感染ND的療效比較22日齡蛋公雞228只，隨機(jī)分為5組，每組47只。第13組為芪藍(lán)抗毒飲加味方(簡稱加味方)、芪藍(lán)抗毒飲替代方(簡稱替代方)和芪藍(lán)抗毒飲(簡稱原方)組，第4組為病毒對照組(攻毒不治療)，第5組為空白對照組40只(不攻毒，不給藥)，隔離飼養(yǎng)。各方劑組、病毒對照組每只肌肉注射0.5mLND病毒攻毒，攻毒6h后各方劑組開始飲水給藥，lmL/只，每天1次，連續(xù)4天。每天觀察死亡數(shù)，連續(xù)觀察14天，計(jì)算死亡率。結(jié)果，加味方組的死亡率最低，其次為替代方組，兩組均顯著低于病毒對照組(尸O.Ol)，明顯低于原方組；病毒對照組的死亡率最高(表ll)。說明加味方和替代方能提高芪藍(lán)抗毒飲治療ND的效果，加味方優(yōu)于替代方。表11各組的死亡數(shù)和死亡率<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>權(quán)利要求1.黃芪多糖的分子修飾方法，其特征在于，用氯磺酸—吡啶法對黃芪多糖進(jìn)行硫酸化分子修飾，其修飾條件為反應(yīng)溫度95℃、氯磺酸與吡啶的質(zhì)量配比為1:6、反應(yīng)時(shí)間1h。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述黃芪多糖的分子修飾方法，其特征在于，所用黃芪多糖的提取方法為分步醇沉法，取黃芪煎液第一次緩慢加入乙醇使終濃度達(dá)50%，去沉淀；上清液再加入乙醇使終濃度達(dá)60%，取沉淀得到粗多糖，純化而得。全文摘要本發(fā)明為黃芪多糖的提取和分子修飾方法，屬于中藥多糖的制備和結(jié)構(gòu)改造
技術(shù)領(lǐng)域：
。用氯磺酸一吡啶法進(jìn)行硫酸化分子修飾，以產(chǎn)物量和硫酸根取代度為指標(biāo)，以反應(yīng)溫度、試劑配比和反應(yīng)時(shí)間為因素，用正交試驗(yàn)優(yōu)選出黃芪多糖氯磺酸一吡啶法修飾的最佳條件為反應(yīng)溫度95℃、氯磺酸與吡啶的配比1∶6、反應(yīng)1h。取黃芪煎液第一次緩慢加入乙醇使終濃度達(dá)50％，去沉淀；上清液再加入乙醇使終濃度達(dá)60％，取沉淀得到粗多糖，黃芪多糖純化后用優(yōu)化的條件修飾，通過系列抗病毒和增強(qiáng)免疫活性比較，所得黃芪多糖經(jīng)純化和硫酸化修飾后其抗病毒和增強(qiáng)免疫活性最強(qiáng)。文檔編號C08B37/00GK101362805SQ200810156178公開日2009年2月11日申請日期2008年9月24日優(yōu)先權(quán)日2008年9月24日發(fā)明者劉家國,張寶康,王德云,胡元亮,黃小燕申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)