專利名稱：：一種硫酸軟骨素的提取方法一種硫酸軟骨k的提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種生化制品，特別是直接從動(dòng)物軟骨中提取硫酸軟骨素的生產(chǎn)工藝。
背景技術(shù)：
：硫酸軟骨素系自動(dòng)物軟骨中提取的酸性黏多糖類物質(zhì)，多存在于動(dòng)物的軟骨、喉骨、鼻中骨、氣管等軟組織中，由粘多糖分子鏈組成，屬葡萄糖胺聚糖，化學(xué)組成為D-葡萄糖醛酸和乙酰氨基己糖(葡萄糖和半乳糖)通過i，3-e-苷鍵相連的高聚物，具有清除體內(nèi)血液中的脂質(zhì)和脂蛋白、清除心臟周圍血管的膽固醇、防治動(dòng)脈粥樣硬化、促進(jìn)細(xì)胞代謝、抗凝血、抗炎、加速傷口愈合和抗腫瘤等多種藥理作用。臨床主要用于治療高脂血癥、動(dòng)脈硬化、祌經(jīng)性頭痛、祌經(jīng)痛、關(guān)節(jié)痛，也可用于因鏈霉素引起的聽覺障礙、慢性腎炎、肝臟功能受損、角膜炎以及角膜潰瘍的輔助治療，以及運(yùn)用于化妝品、外傷傷口的愈合劑等的制造。目前普遍采用的硫酸軟骨素提取方法主要有鹽解、堿解、酶解法，其分離純化有乙醇沉淀法、離子交換色譜法、季銨鹽配合法、吸附法和纖維素分離法等。國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局于2004年11月10日公開的，專利申請(qǐng)?zhí)枮?00310115383.9號(hào)，名稱為《雙酶法生產(chǎn)硫酸軟骨素》的發(fā)明專利申請(qǐng)采用了堿性復(fù)合酶和胰酶兩步酶解法及超濾膜過濾，收率在16~22%之間，氨基葡萄糖含量為2430%，但該工藝兩步酶解耗時(shí)1617小時(shí)，并在兩次酶解過程中還要用酸調(diào)節(jié)一次pH值，且須在70%乙醇中粗潔晶方能進(jìn)入二次酶解，工藝流程復(fù)雜，酸及乙醇的消耗大;而該工藝選取的超濾膜孔徑為6X1()3分子量，雜質(zhì)蛋白濾過不充分，導(dǎo)致純度不高。雖有文獻(xiàn)報(bào)道熊雙麗(硫酸軟骨素肽的分離純化和鑒定.江南大學(xué)食品科學(xué)研究技術(shù)學(xué)院，2006，27(4):6770)等用木瓜蛋白酶提取硫酸軟骨素肽，其純度達(dá)到99.09%，但由于其硫酸軟骨素肽的純化方法為DEAE-S印harosefastflow離子交換層析分離純化，工藝成本高，不適合產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。而高華(硫酸軟骨素生產(chǎn)新工藝研究，青島大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，18(4):5558)等采用濃堿-復(fù)合酶酶解法，收率可達(dá)32.69%，但稀堿酶解工藝中用的稀堿溶液量太大，大于6倍軟骨重，并且反復(fù)乙醇沉淀，乙醇用量大，如濃縮原液，十分耗能。綜上所述，目前的生產(chǎn)工藝存在的問題有生產(chǎn)步驟繁瑣、用堿、酸、乙醇量大、耗能高、硫酸軟骨素?fù)p傷破壞大、活性差，以及收率、純度較低等。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是克服以上現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，提供一種新的硫酸軟骨素的提取方法，利用本方法可顯著地簡(jiǎn)化工藝、節(jié)省試劑、縮短生產(chǎn)時(shí)間、降低耗能、提高產(chǎn)品活性、收率、純度。本發(fā)明的具體提取方法，包括以下步驟(1)泡料將動(dòng)物軟骨塊放入反應(yīng)罐內(nèi)，加入適量水浸泡3—5小時(shí)；(2)酶解升溫至55—62。C，調(diào)整pH在8.0—8.5，然后向反應(yīng)罐中加入水解蛋白酶，酶解7—9小時(shí)后，將pH調(diào)節(jié)至6.0—6.5之間，升溫至85—95'C，沉降2—4小時(shí)；(3)過濾、超濾酶解液冷卻后加1%硅藻土進(jìn)行過濾，將濾液打入超濾罐，通過超濾膜超濾；(4)沉淀濃縮液調(diào)至pH5.5—6.0，待冷卻至3(TC以下，加酶解液體積的3—4倍的90%乙醇，靜置沉淀7—9小時(shí)。沉淀物用乙醇洗滌2—3遍，脫水干燥后即得所述之硫酸軟骨素。上述硫酸軟骨素的提取方法中，在(2)步中加入的水解蛋白酶為堿性內(nèi)切蛋白酶，其酶濃度為3%—5%;在(3)步中所述的超濾膜為2X10"分子量孔徑規(guī)格中空纖維超濾膜；在(3)步中加入0.9%NaCl溶液，濃縮液打入沉淀罐，加入與濃縮液重量比為線NaCl，以保持一定的離子濃度，增強(qiáng)硫酸軟骨鈉溶解度，并穩(wěn)定其活性；在(4)步沉淀前調(diào)整pH至10.5—11.5，加入與濃縮液重量比為5—10%的20%11202溶液，在55—60。C下靜置8小時(shí)，其目的是脫色，使最終產(chǎn)品為白色。與現(xiàn)有技術(shù)相比較，本發(fā)明具有以下突出的有益效果1、簡(jiǎn)化了生產(chǎn)工藝流程，用單一酶解離糖肽共價(jià)鍵；用超濾膜過濾代替反復(fù)醇沉、結(jié)晶；2、節(jié)約成本，上述該法較之現(xiàn)有工藝由于避開了堿解及反復(fù)醇沉，因而節(jié)省了堿、酸、乙醇用量，在降低成本的同時(shí)，減輕對(duì)環(huán)境的污染，減少了下游提純的難度及能源消耗；3、由于避開傳統(tǒng)工藝中易造成損害的堿解工序，加之所述之堿性內(nèi)切蛋白酶單一性強(qiáng)，硫酸軟骨素性能集團(tuán)損傷破壞小，結(jié)構(gòu)完整，分子量能夠保持在2X104以上，據(jù)此選擇孔徑規(guī)格為2乂104分子量的超濾膜進(jìn)行濾過，保證了硫酸軟骨素與雜質(zhì)蛋白的有效分離、去除，對(duì)與軟骨的收率達(dá)37%以上，純度達(dá)99.5%以上；4、所述之硫酸軟骨素性能集團(tuán)損傷破壞小，加之在超濾過程之中依次加入NaCl，以保持一定的離子濃度，確保了硫酸軟骨素結(jié)構(gòu)與活性。具體實(shí)施方式實(shí)施例1:(1)將潔白干凈的軟骨塊放入反應(yīng)罐內(nèi)，并加入適量水浸泡4小時(shí)；(2)升溫至58。C，保持pH在8.0—8.5，向反應(yīng)罐中加入4%堿性內(nèi)切蛋白酶，酶解8小時(shí)；將pH調(diào)節(jié)至6.0—6.5之間，升溫至9(TC，沉降3小時(shí)；(3)酶解液冷卻后加1%硅藻土進(jìn)行過濾，壓濾后的濾液打入超濾罐，通過分子孔徑為2X104的超濾膜超濾，超濾過程中加入0.9。/。的NaCl，濃縮液打入沉淀罐，加入與濃縮液重量比為l%NaCl;(4)濃縮液調(diào)整pH至10.5—11.5，加入與濃縮液重量比為5—10%的20%H202溶液，在55—60'C下靜置8小時(shí)，然后調(diào)PH至5.5—6.0，待冷卻至30。C以下，加濃縮液體積3.6倍的90%乙醇，靜置沉淀8小時(shí)。沉淀物用乙醇洗滌3遍，脫水干燥后即得所述之硫酸軟骨素。將上述方法生產(chǎn)的硫酸軟骨素進(jìn)行分析，結(jié)果如下性狀白色或幾乎白色粉末干燥失重7.1%氯化物<0.50%無機(jī)硫酸鹽(以S04計(jì))〈0.24%重金屬(以Pb計(jì))〈0.002%蛋白質(zhì)限度(以干品計(jì))0.18%純度(以干品計(jì))99.8%收率(對(duì)于軟骨)37.6%其他實(shí)施例參考數(shù)值(按實(shí)施例l反應(yīng)順序依次為)，見下表:<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>權(quán)利要求1、一種硫酸軟骨素的提取方法，其特征在于該方法包括以下步驟(1)泡料將動(dòng)物軟骨塊放入反應(yīng)罐內(nèi)，加入適量水浸泡3-5小時(shí)；(2)酶解升溫至55-62℃，調(diào)整pH在8.0-8.5，然后向反應(yīng)罐中加入水解蛋白酶，酶解7-9小時(shí)后，將pH調(diào)節(jié)至6.0-6.5之間，升溫至85-95℃，沉降2-4小時(shí)后得酶解液；(3)過濾、超濾酶解液冷卻后加1％硅藻土進(jìn)行過濾，將濾液打入超濾罐，通過超濾膜超濾后得到濃縮液；(4)沉淀濃縮液調(diào)至pH為5.5-6.0，待冷卻至30℃以下，加酶解液體積的3-4倍的90％乙醇，靜置沉淀7-9小時(shí)。沉淀物用乙醇洗滌2-3遍，脫水干燥后即可。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的硫酸軟骨素的提取方法，其特征是在(2)步中加入的水解蛋白酶為堿性內(nèi)切蛋白酶。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的硫酸軟骨素的提取方法，其特征是所述的堿性內(nèi)切蛋白酶酶濃度為3°/。一5%。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的硫酸軟骨素的提取方法，其特征是在(3)步中所述的超濾膜孔徑為2X104分子量規(guī)格中空纖維超濾膜。5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的硫酸軟骨素的提取方法，其特征是在(3)步中濾液打入超濾罐之前加入0.99GNaCl溶液，在濃縮液打入沉淀罐后，再加入與濃縮液重量比為1。/。的NaCl。6、根據(jù)權(quán)利要求1所述的硫酸軟骨素的提取方法，其特征是在(4)步沉淀前進(jìn)行脫色處理。7、根據(jù)權(quán)利要求6所述的硫酸軟骨素的提取方法，其特征是所述的脫色處理方式為調(diào)整pH至10.5—11.5，加入與濃縮液重量比為5—10%的20%&02溶液，在55—60'C下靜置8小時(shí)。全文摘要本發(fā)明公開了一種硫酸軟骨素的提取方法，屬于生化制品領(lǐng)域，該方法利用單一酶解技術(shù)代替了傳統(tǒng)的堿解過程，利用超濾膜過濾代替了反復(fù)醇沉，簡(jiǎn)化了生產(chǎn)工藝流程，保證了硫酸軟骨素的完整性，提高了收率以及純度，其收率在37％以上，純度在99.5％以上。文檔編號(hào)C08B37/00GK101280027SQ200710113240公開日2008年10月8日申請(qǐng)日期2007年10月18日優(yōu)先權(quán)日2007年10月18日發(fā)明者盧言松,鄭扶桑申請(qǐng)人:日照眾山生物科技有限公司