專利名稱：帶有陽離子識別基團(tuán)的蛋白質(zhì)印跡樹脂的制備方法及應(yīng)用的制作方法
帶有陽離子i朋瞎團(tuán)的蛋白質(zhì)印跡樹脂的制備方法鵬用
M領(lǐng)域本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)印跡樹脂的合成及其自技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及以克隆蛋白 質(zhì)為豐鎌用帶有陽離子識另瞎團(tuán)的輔助識另啲限長聚合物鏈(輔助識別聚溯鏈)合成蛋白質(zhì)印 跡聚，，具體i鵬用預(yù)然微量蛋白質(zhì)的分離、富集。
背景駄好印跡技術(shù)是聚^/艦'記憶"印跡肝的立體空間而具有的好水平上的 專一性識別能力。由于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的 ,生物活性的要求，近年來印跡蛋白質(zhì)成為^F印跡領(lǐng) 域研究的熱點。利用非共價作用是印跡蛋白質(zhì)最簡單方法。常用的弱肝間作用力有氫鍵、靜電 力、電荷轉(zhuǎn)移、敵K作用以及范德華力等。
印跡蛋白質(zhì)的方法主^W包埋法、表面印跡法、抗原決定基的方法。早期采用最多的聚合方
法是包埋法，印跡的蛋白質(zhì)通過蛋白酶的降解去除，印跡聚合物可以重新吸附印跡分子。Hj&ten 等(HjdrtenJ， LiaoJL， Nakazato Ketal.， Chromatography, 1997， 44:227-234)采用該法，以丙烯 翻安為單體合成了低交，的凝膠，對血紅蛋白、生長激素、紅細(xì)胞色素、肌紅蛋白和核糖核酸酶 等進(jìn)行了印跡。洗脫印跡肝后得到了具有良好選擇性的肝印跡聚^tl，不同的印跡肝能被相 應(yīng)的凝l^^吸附。
表面印跡法制得的介質(zhì)使印跡識別位點處ffl粒的表面(戯層)，克月艮了包埋法印跡肝利用
率低、印跡肝、M困難、介質(zhì)內(nèi)部擴(kuò)散阻力大、介質(zhì)形態(tài)不規(guī)則等缺點。從蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和特性 來看，表面印跡法 §合印跡蛋白質(zhì)分子。其優(yōu)點是可利用粒子的機(jī)械穩(wěn)定'li&調(diào)節(jié)粒子本身性能
以鵬不同的印跡需要。表面印跡法印跡蛋白質(zhì)的載體w^^粒子、云母、聚^r微球等。賺作 載體的優(yōu)點是在聚紐程中硅膠表面的《,基團(tuán)艦綱巨離控制，只有相應(yīng)底物有強(qiáng)烈識另怖
用，可大大斷婦瞎異吸附對選擇性的影響。f細(xì)聚合方法制備的'麟作載體(YeL，CormackPAQ Mosbach K. Anal Chim Acta 2001,435:187—196)可ffi3l^初始聚合階gX藝^f牛的控制，得到尺寸 均一，有良好機(jī)械性能的聚^t/顆粒，不用粉碎和篩分，倉巨保證得到的印跡聚，的物理和化學(xué)性 能。表面印跡法一般是在微球Jnit行印a^涂層印跡聚激，^J^將蛋白質(zhì)首先吸附到琉上(Shi H， TsaiWB， FeirariS， RalnerBD.， Nature, 1999， 398:593-597)，然后將一薄層的二糖^H^被
在吸附的蛋白質(zhì)上，糖層與蛋白質(zhì)aa氫皿合。接著在糖^^ffim合上一層光滑的熒光聚^ti 薄層。最后除去云母并溶解掉印跡蛋白質(zhì)，即^了具有蛋白質(zhì)微空穴的聚^M^面印跡聚合物。
Sergey等(BossiAPiletskyS A PiletskaEV, etal. Anal. Chem.，2001,73:5281~5286)提出表面接枝印 M"法是在，乙烯樹脂表面涂一薄層穩(wěn)定的可鍵合的物質(zhì)，該物質(zhì)在蛋白質(zhì)^^，下可聚合。 抗原決定基的方法根據(jù)抗原和抗體僅僅是通過一小部分即抗原決定基來相互作用的原理而建 立的一種方法，戶/iH胃的抗原決定基是由三到六個氨基^S組成的表面區(qū)域(Rachkov A MinoumN. Biochi etBiophy AcA 2001,1544:255—266)。如果f頓代表蛋白質(zhì)或多肽結(jié)構(gòu)的小部分裸露片段的短 肽作為模板，就會產(chǎn)生與該短肽相匹配的空間大 L，從而M印跡聚^t/就^i只別含有該鄉(xiāng)太部分 的旨蛋白質(zhì)W?？乖瓫Q定基方法的缺點是不僅可以識別豐嫩分子，還可以識別其他的具有與模 板針相同序列的氨基酸和蛋白質(zhì)。
±^目前普遍{頓的印跡蛋白 法都具有明顯的缺點單條合發(fā)生在有機(jī)輸U(kuò)中，用以印 跡的蛋白質(zhì)種類少且均為常見的、在生物體內(nèi)含量很大或很容易得到的蛋白質(zhì)，這限制了蛋白質(zhì)印 跡聚，的自的實卩^義。
ZhaoZ等發(fā)明了一種新的表面印跡蛋白質(zhì)的方法(專利申i轉(zhuǎn)200610013329.7，公開 號CN1844174， Zhao Z， Wang CH Guo MJ, Shi LQ， Fan YG， Long Y, Mi HR FEBS Letters 2006; 580: 2750~2754.)，利用限制長度的聚激短鏈(輔助識別鏈)Ma祉隨機(jī)分布的識別基團(tuán)與克隆蛋白 質(zhì)a^靜電結(jié)合，并利用短祉的雙激每蛋白質(zhì)與輔助識別鏈的復(fù)^/固定到樹脂微球上，用高鹽 溶液將t離蛋白質(zhì)冼脫后就可以對目的蛋白質(zhì)進(jìn)衍只別了。這種^4對部分微S^然蛋白的富集效 剩艮好，但由于這種方法所f頓的輔助i鄉(xiāng)幌與樹脂微鵬帶有大量的負(fù)電荷，對堿性非目的蛋白 質(zhì)的吸附也會很強(qiáng)。為了克月^S種缺陷并增加最終的蛋白質(zhì)印跡聚，的生物相容性，必須對這種 方腿行大量鵬。
發(fā)明內(nèi)容l本發(fā)明目的是劃艮現(xiàn)有技術(shù)存在的±^不足，皿一種帶有陽離子識別基團(tuán)的蛋白
質(zhì)印跡樹脂的制備方法及在蛋白質(zhì)分離中的應(yīng)用。
本發(fā)明為了良好的生物相容性^>對堿性蛋白的輛寺異性吸附，我們采用聚乙烯醇作為輔
助識別鏈的骨架，識另瞎團(tuán)確定為氨基，而用于負(fù)載輔助識別鏈的載體選用進(jìn)行3dm衝,的80
-100目的聚乙烯醇樹脂微球。同時為了增加蛋白質(zhì)印跡聚合物的特異性，將識別基團(tuán)在短^l^f
占的比例,定為10%。模版蛋白質(zhì)我們使用克隆的,環(huán)素18蛋白質(zhì)。
本發(fā)明麟的棘陽離子識另瞎團(tuán)的蛋白質(zhì)印跡樹脂的制備方法，其制備步驟如下
第一、合成輔助識別聚合物鏈以二甲基亞砜為、凝!J，以N，N-二異丙基碳二M!安及1-羥基苯
并三唑為縮合劑，使得聚合度在40—50的短 乙烯醇上10%—8X的羥基與芴甲氧羰mSW
的甘氨Ma行接枝反應(yīng)，聚乙烯醇與兩種縮合劑以及荷甲Mm^w的甘氨酸的比例為每克聚
乙烯醇，{頓lmLN,N-二異丙基碳二則安，2gl-羥基苯并三唑，8g荷甲氧羰S^W的甘氨酸。 之后，加入^f只比為1: 1的吡啶與丙烯酰氯的混合物，使得聚乙烯醇上另外10%—8%的羥基與 丙烯酰誠生接枝反應(yīng)，然后加入哌啶脫去甘氨祉的微，用乙,淀，離心，千燥，即得到輔 助識別聚^t/能
第二自體進(jìn)行修飾取80—100目在二甲基亞砜中溶脹后的聚乙烯醇微球10g，加入10ml 吡啶及10ml丙烯酰氯，3(TC下破4h，傲fW上的P逮接肚丙烯鵬，之后用乙辭先滌并過
渡到水相中，即得雙鍵修飾后的聚乙烯醇微球載體；
第三、合成蛋白質(zhì)印跡樹脂在磷麟緩沖溶液中，摩爾比為300: 1的輔助識別聚合物瞎
克隆的線環(huán)素18蛋白質(zhì)于4'C進(jìn)行自組裝8小時，之后往溶液中加入微顯的^m衝斷布的聚 乙烯,脂微球吸附16小時，濕的^1^衝,的聚乙烯M脂微球與克隆的線環(huán)素18蛋白質(zhì) 的質(zhì)量比為1000: 3。隨后力口入質(zhì)量比為29: 1的丙烯翻扱N^-亞甲基雙丙烯翻安混合溶液、過 二硫麟溶液，室溫通氮P線lh，然后加入N凡N^-四甲基二乙胺,交聯(lián)聚合反應(yīng)2小時，用500mM KC1溶液洗滌樹脂球至電泳檢測無 環(huán)素18蛋白質(zhì)條帶，得到蛋白質(zhì)印跡樹脂。
本發(fā)明方法制備的蛋白質(zhì)印跡樹脂在蛋白質(zhì)分離中的鵬，i^ffl方跑括下述步驟 第一、4t:下，將itt的權(quán)利要求1制備的蛋白質(zhì)印跡樹脂直接^A豬肝細(xì)胞提取物中，吸 附1小時；
第二上步吸附蛋白后的蛋白質(zhì)印跡樹脂依次用0.02M磷酸二氫鈉和磷,二鈉組成的緩沖 液洗滌6次、2mL0.薩氯化鉀溶液洗滌2次、2mL0.15M氯化鉀溶液洗滌1次、0纖氯化鉀溶 液洗滌2次，0.50M氯化鉀溶液洗滌l次，得妾腕滌液；
第三、應(yīng)用Bradford法檢測上步得到的氯化鉀緩沖溶液的洗滌液，得出總蛋白含量；再取部 分洗滌液，用三氯乙敏脫 旦酸 法沉淀蛋白，蛋白液制樣后恒流走十二烷基磺M-聚丙烯酰 胺; 電泳，用 環(huán)素18的抗體對其做免疫印跡檢測，吸附蛋白中 環(huán)素18的含量，從而 得出在所吸附蛋白質(zhì)中，素18與總蛋白質(zhì)含量的比值。
本發(fā)明的優(yōu)點和積極鄉(xiāng)
本發(fā)明不同于其他印跡蛋白質(zhì)的方法是，其一弓l入了用以輔助識別的輔助識別聚^t;鏈，本發(fā) 明中的輔助識別聚^/鏈具有多識別位點，且這些識別位點是隨機(jī)分布的，這種方法克月艮了通常由 單純的單體制備的識別體系識別位點單一、結(jié)構(gòu)緊密蛋白質(zhì)不易繊的弊齬。同時這種方制吏得成
球與印跡可以分微行，j^^在有機(jī)相中進(jìn)行，印跡^7K相中進(jìn)行，避免了對t鎌蛋白質(zhì)的破壞，
實用性強(qiáng)。其二是本發(fā)明所用至啲輔助識別聚^t/鏈的識別位點是帶有正電荷的。其三是本發(fā)明所 4頓的載體是不帶電荷的聚乙烯醇微球，極大的M^了輛寺異蛋白質(zhì)的吸附。其四是本發(fā)明《頓克 隆的蛋白質(zhì)作為禾嫩，克服了印跡天然驢蛋白質(zhì)0^fe無法得至啲ffi5頁，而這一點正是蛋白質(zhì)印 跡技術(shù)無法取得更多的自價值的主要困xtt—。
本發(fā)明可4賊i式劑盒，即包括輔助識別聚^tl鏈、丙烯翻安單體及引發(fā)體系和ISi^衝,
的大孔維
本發(fā)明得至啲蛋白質(zhì)印跡樹脂在天然的細(xì)鵬取物中，軎,極;tt也富集目標(biāo)蛋白質(zhì)，目標(biāo)蛋白 質(zhì)在總蛋白質(zhì)中的含量提高了 ioo倍以上。


圖1是蛋白質(zhì)印跡樹脂對目標(biāo)蛋白質(zhì)吸附效果的測定，A圖為十二烷基磺酸鈉-聚丙烯, 凝膠電泳并以硝酸銀染色的電泳結(jié)果；B圖為用豬親環(huán)素18的抗體對相同樣品做免疫印跡得 到的結(jié)果。
圖2是蛋白質(zhì)印跡樹脂再生性的測定。
具體實M^1
實施例i.蛋白質(zhì)印跡樹脂的制備
第一、合繊助識vM條聚合度為40左右的聚乙烯醇4g,芴甲氧羰?；Ｗo(hù)的甘氨酸8g， 縮合劑為N,N-二異丙基碳二亞胺4mL及1-羥基苯并三唑8g，所有反應(yīng)物溶于50mL 二甲基亞 砜中，反應(yīng)在3(TC下攪拌進(jìn)行16小時。之后，2CrC下補(bǔ)加丙烯酰氯4mL及吡啶4mL，將溫度 升高至40'C繼續(xù)攪拌反應(yīng)4小時。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)溶液用10倍體積的乙醇沉淀，離心， 并用乙醚洗去乙醇，真空干燥24小時。然后將前述產(chǎn)物溶于50mL體積比為1: 1的二甲基亞 砜與二甲基甲酰胺的混合溶劑中，并加入哌啶10mL，室溫下攪拌30射中，以脫去芴甲氧羰酰 基的保護(hù)，用10倍體積的乙醇沉淀，離心，用乙醚洗去乙醇，真空干燥24小時，所得產(chǎn)物即 為輔助識別聚合物鏈。產(chǎn)物通過元素分析及核磁測定其兩種基團(tuán)的接枝率，結(jié)果證實聚合度為 40的聚乙烯醇鏈上7.1%的結(jié)構(gòu)單元接枝上了甘氨酸，9.1%的結(jié)構(gòu)單元接枝上了丙烯?；?br> 第二、合成蛋白質(zhì)印跡樹脂取輔助識別聚合物鏈0.32g， 21mg克隆的豬親環(huán)素18蛋白質(zhì) 溶于35mL20mM磷Mfe緩沖溶液(pH7.1)中，于4'C旋轉(zhuǎn)8小時，然后向溶液中加入7g經(jīng)am 鍵修飾的聚乙烯醇大孔微球吸附16h，接著加入1.4mL丙烯酰胺及N，N-亞甲基雙丙烯酰胺混合 溶液、350pL過二硫酸銨溶液，室廳氮P織lh，然后力口入14^LN凡N^-四甲基二乙胺，交聯(lián) 聚合反應(yīng)2小時用2mol丄—1氯化鉀溶液洗滌樹脂球至電泳檢測無 環(huán)素18蛋白質(zhì)條帶，得到 分子印跡樹脂。所述的丙烯酰胺及N，N-亞甲基雙丙烯,混合溶液的質(zhì)量體積比為丙烯翻安29 %， N,N-亞甲基雙丙烯酰胺1X;所述的過二硫酸銨溶液的質(zhì)量體積比為10%。
實施例2、蛋白質(zhì)印跡樹脂在蛋白質(zhì)分離中的應(yīng)用
4'C下，將上述2g分子印跡樹脂與80(^L豬肝細(xì)胞提取物混合，吸附l小時；吸附蛋白后 的樹脂依次用2mL 0.02M磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉組成的緩沖液洗滌6次、2mL 0.10M氯化鉀 溶液洗滌2次、2mL 0.15M氯化鉀溶液洗滌1次、2mL 0.30M氯化鉀溶液洗滌2次，0.50M氯化 鉀溶液洗滌1次，得到洗滌液；應(yīng)用Bradford法檢測氯化鉀溶液的洗滌液以及豬肝細(xì)胞提取物 溶液，得出總蛋白含量；再取100nL洗滌液，用三氯乙敏脫氧膽酸納方法沉淀蛋白，蛋白液 制樣后恒流走十二烷基磺酸鈉-聚丙烯mi安凝膠電泳，用豬親環(huán)素18的抗體對其做免疫印跡檢 測吸附蛋白中親環(huán)素18的含量，從而得出在所吸附蛋白質(zhì)中親環(huán)素18與總蛋白質(zhì)含量的比值， 同樣的方法亦可測得豬白細(xì)胞提取物溶液中親環(huán)素18的含量。結(jié)果如圖1所示，在0.003pL 豬白細(xì)胞提取物中總共含蛋白質(zhì)240ng，在其中檢測不至除環(huán)素18 (第一泳道)；在0,3nL豬白 細(xì)胞提取物中總共含蛋白質(zhì)24嗎，其中有24ng親環(huán)素18 (第二泳道)；而在lOO^iL的洗滌液總 共含有蛋白質(zhì)230ng，其中有20ng親環(huán)素18 (第三泳道)，所以在lmL豬白細(xì)胞提取物中親環(huán) 素18在總蛋白質(zhì)中所占比例為64ng/80mg (即0.08%)，而在lmL洗脫液中親環(huán)素18在總蛋 白質(zhì)中所占比例為200ng/23嗎(即8.7%)，目標(biāo)蛋白質(zhì)在總蛋白質(zhì)中的含量提高了 110倍。
實施例3、克隆蛋白質(zhì)豬親環(huán)素18的制備方法 1.目的基因的克隆
本實驗采用豬肝臟mRNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR (RT-PCR)，并將PCR產(chǎn)物與質(zhì)粒載 體pGEX-5Xl進(jìn)行限制性內(nèi)切酶修飾，待連接后轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5中并進(jìn)行質(zhì)粒鑒定。
(1) 在200mL的薄壁PCR管中，按下列i^7効口入所需各組艦行PCR反應(yīng)RNA抑 劑lpL，豬肝細(xì)胞RNA100ng，反應(yīng)緩沖液25nL，正向弓物10pmo1。反向引物10pmo1， Taq混合 酶1^L，雙蒸7jC2叫。
(2) 稱取0.75g瓊脂糖，加入50mLlxTAE，混勻后加熱至沸騰，取出后待稍冷時加入2nL 溴化乙錠(EB)溶液(10 mg/mL)，將膠液倒入電泳槽的膠臺上，并插入梳子；從lOO^L 的反應(yīng)體系中，取出16^L樣品，加4nL5x加樣緩沖液；將20(oL樣品全部加入電泳膠的齒孔 中，倒入lxTAE直至沒過膠面，在80V下進(jìn)行電泳，結(jié)束后于紫外燈下觀察結(jié)果。
(3) 在PCR產(chǎn)物中加入1/10體積的NaAc溶液(3 M， pH 5.2)，混勻后加入2.5倍體積 的無水乙醇，-20°。沉淀20111111;于4。C、 12,000 rpm離心15 min;棄去上清，用lmL70。/o乙 醇洗滌；再次于4。C、 12,000 rpm離心15 min;棄去上清，真空干燥沉淀30min， DNA量多 時在管壁上呈無色透明的膜狀物；加14ML滅菌水，使之溶解，然后按照下列配比向管中依次 加入兩種限制性內(nèi)切酶，建立酶切體系；取2ML濃度為450ng/mL的pGEX-5Xl質(zhì)粒，也加 入同樣的兩種限制性內(nèi)切酶，建立酶切體系。
(5)在20^iL酶切產(chǎn)物中加5pL5x加樣緩沖液，混勻、離心。灌制濃度為1.5%的瓊脂糖凝膠， 上樣，80V下進(jìn)行電泳。等染料前沿走至膠的一半時，在紫外燈下觀察，迅速將目的條帶切下； 將凝膠i央放入充滿lxTAE電泳緩沖液的透析袋內(nèi)一側(cè)，放入電泳槽使凝膠一側(cè)靠近負(fù)極，80V 電泳，使DNA在電場的作用下從凝膠遷移到緩沖液中。電泳lh后，加反向電壓100V，反洗 脫60 sec;將透析袋中的液體吸入一滅菌的1.5mL離心管中(約500pL)，加等體積的三合一酚， 劇烈振蕩10 sec，室溫離心15 sec，將上層含DNA的水相轉(zhuǎn)入另一新管中；加入等體積的氯仿，
劇烈振蕩10 sec，離心15 sec，將上層含DNA的水相轉(zhuǎn)入另一新管中；加入1/10體積的NaAC (3M， pH5,2)溶液，稍振蕩后加入2.5倍體積的無水乙醇，-2(TC沉淀20 min;于4。C、 12,000 rpm離心15min;棄去上清，加入lmL70。/。無水乙醇，洗滌沉淀；再次于4'C、 12,000 rpm離 心15 min;棄去上清，真空干燥DNA沉淀30 min;將干燥的沉淀溶于實驗所需量的水中； pGEX-5Xl質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物也做相同處理；取待插入的DNA和質(zhì)粒DNA，建立連接體系。
(6) 挑取￡.0^.0115原菌的單克隆菌落于2mLLB培養(yǎng)基中，37'C過夜培養(yǎng)；次日將菌 液1:100稀釋到50mL新鮮的LB培養(yǎng)基中，37'C繼續(xù)振蕩培養(yǎng)至菌液的OD600值為0.3 (約 4-6小時)；將50mL菌液分裝至兩個滅菌的離心管中，在冰上放置10min，于4°C、 4,000 rpm 離心10 min;棄上清用10mL冰預(yù)冷的10mM NaCl重懸細(xì)菌沉淀；于4°C、 4,000 rpm離心 10 min;棄上清，用10 mL冰預(yù)冷的50 mM CaC12重懸細(xì)菌并冰上放置20 min;于4°C、 4,000 rpm離心10 min;棄上清，加1 mL冰預(yù)冷的50 mM CaC12重懸細(xì)胞，即為感受態(tài)細(xì)胞?？?將制得的感受態(tài)細(xì)胞以200mL (含15%甘油)分裝，-8(TC凍存；
(7) 取200^L感受態(tài)細(xì)胞，加5ML連接產(chǎn)物，輕旋混勻；同時另取200pL感受態(tài)細(xì)胞，完 全不加DNA作為負(fù)對照，于冰上放置l hr; 42'C水浴加熱90 sec后迅速轉(zhuǎn)移至冰水中冷卻 l-2min;每管補(bǔ)加800mL的LB培養(yǎng)基，37'C溫育45 min使細(xì)菌復(fù)蘇并表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗 生素標(biāo)記基因；取含目的DNA的菌液200ML涂于AMP (50Mg/mL)固體培養(yǎng)基平皿上，剩 余800^L涂于另一平皿上，而不加DNA的菌液取500pL涂于一平皿上作為對照；將平皿 置于無菌潔凈工作臺中至液體完全被吸收，然后倒置平皿，于恒溫培養(yǎng)箱中37'C培養(yǎng)12~16 hr。
(8) 挑取平板上某一單克隆，加入液體LB培養(yǎng)基2mL,過夜培養(yǎng)。將菌液在一新的平板 上畫線過夜培養(yǎng)后貯存于4°C 。其余菌液取10pL Glutathione SepharoseTM 4B珠子混合后電泳 進(jìn)行小樣蛋白檢測。
2.目的蛋白的誘導(dǎo)^ii^撥屯
(1) 挑取單菌落于20mLLB/AMP (5p(ig/mL)培養(yǎng)基中，37。C過夜培養(yǎng)。
(2) 次日按1:100稀釋到2L新鮮的LB/AMP (5png/mL)培養(yǎng)基中，37。C繼續(xù)培養(yǎng)至OD600 值為0.4~0.6 (約7 8h)。
(3) 達(dá)到確定的OD600值后，將培養(yǎng)溫度調(diào)至20。C，繼續(xù)培養(yǎng)30min。
(4) 加IPTG至終濃度為O.lmM， 2(TC誘導(dǎo)1~2 h。
(5) 將培養(yǎng)物于4。C、 5,000 rpm離心15 min，棄上清并倒置數(shù)分鐘使殘留液體流盡，用少量 冰預(yù)冷的MTPBS洗滌細(xì)胞1~2次，離心去除洗滌液。
(6) 用相當(dāng)于1/50~1/100培養(yǎng)體積的MTPBS重懸細(xì)胞，加PMSF至終濃度為O.lmM并挑 加少量溶菌酶，于液氮及37'C水浴中反復(fù)凍融3次以破碎細(xì)胞。(7) 挑加DNase，反復(fù)顛倒幾次，以解離雙鏈DNA，使細(xì)菌裂解液的粘度明顯降低。
(8) 按1:100 (v/v)的比例加入TritonX-100， 4'C旋轉(zhuǎn)混合30 min，以促進(jìn)蛋白溶解性。
(9) 4"C,10，000rpm離心10min (可適當(dāng)加大離心,和時間，這有利于細(xì)胞的破碎)。
(10) 收集上清，沉淀和上清分別取樣待做電泳檢測。
(1 l)上清中加入預(yù)溶脹過的親和層析珠Glutathione SepharoseTM 4b 10(K20PmL (珠體積)， 4'C旋轉(zhuǎn)結(jié)合4(^60 min。
(12) 自然沉降或稍做離心，去上清，珠子用預(yù)冷的MTPBS洗滌34次。
(13) 珠子用預(yù)冷的50mMTris'Cl (pH8.0)平衡1~2次。
(14) 將珠子小心地轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，定容后取樣作蛋白含量測定。
(15) 珠子用凝血因子Xa的緩沖液洗滌34次。
(16) 根據(jù)電泳圖估算珠子上融合蛋白的含量，加入5ppL (0.5u/mL)凝血因子Xa和45PnL 凝血因子Xa緩沖液，4'C酶切16h。
(17) 將珠子稍離心，上清轉(zhuǎn)移至一干凈離心管中；再離心，上清轉(zhuǎn)移至另一干凈管中；再 一次離心，上清即為所要的蛋白溶液。這樣反復(fù)離心是為了徹底除去蛋白溶液中殘留的珠子。
(18) 在珠子中加入50PnL凝血因子Xa緩沖液，溫和振蕩洗滌珠子。如步驟3取上清。
(19) 洗滌珠子6次，得到六個蛋白樣品。從每個樣品中各取出1P^iL加lpML2xSDS樣品緩 沖液，電泳檢測切下的目的蛋白含量。
三氯乙敏脫割旦酸納沉淀蛋白M^法
材料5%脫氧膽酸鈉溶液 . 30%三氯乙酸溶液
3. 2M氫氧化鈉溶液
4. 十二烷基磺酸鈉(lxSDS)樣品緩沖液組成 Tris.Cl (pH6.8) 50 mM
DTT (二硫蘇糖醇) 100 mM
SDS 2% 溴酚藍(lán) 0.1% 甘油 10% 步驟1.向lmL上述各蛋白液中加入10nL5n/。脫氧膽酸鈉溶液后混勻，然后加480pL 30%三氯乙酸，混勻后于4'C放置2 h或冰浴中放置30 min。
2. 4'C、 10，000rpm離心25min，去上清。
3. 10,000 rpm離心25 min ，去盡殘留液體。 4. 沉積物中加入50nL —倍樣品液重懸，如果呈黃色或有沉淀，則加1~2^L 2M氫 氧化鈉溶液將顏色調(diào)至藍(lán)色并使之完全溶解。
5. 99。C煮沸5 min， 3000rpm離心10s后即可直接上樣走電泳。
作為對照，我們還做了無模板蛋白質(zhì)的印跡(即識別分子不與克隆蛋白質(zhì)自組裝而直接交 聯(lián)聚合錨定到大孔微球表面)和無識別分子的印跡(即克隆蛋白質(zhì)不與識別分子自組裝而直接 被大 L微球吸附，然后引發(fā)聚合)，結(jié)果如圖1中第四、第五泳道所示，無明顯的富集效果。
圖1:蛋白質(zhì)印跡樹脂的對目標(biāo)蛋白質(zhì)吸附效果的測定。其中A圖為十二烷基磺酸鈉-聚 丙烯酰胺凝膠電泳并以硝酸銀染色的電泳結(jié)果；B圖為用豬親環(huán)素18的抗體對相同樣品做免 疫印跡得到的結(jié)果；第一泳道樣品為0.003ML豬白細(xì)胞提取物；第二泳道樣品為0.3pL豬白細(xì) 胞提取物；第三泳道樣品為100&分子印跡樹脂洗滌液。
實施例4 、
上例中使用過的分子印跡樹脂用2mol丄—1氯化鉀溶液洗滌樹脂球至電泳檢測無條帶。加入 800nL豬白細(xì)胞提取物，用同樣的方法吸附、洗脫和檢測，然后再重復(fù)一次。結(jié)果兩次再生重 復(fù)使用的吸附效果如圖2所示，與第一次吸附效果基本無差別。
圖2:分子印跡樹脂再生性的測定。第一泳道樣品為100ML分子印跡樹脂洗滌液；第二泳 道樣品為IOOML分子印跡樹脂再生后重復(fù)使用的洗滌液;第三泳道樣品為100&分子印跡樹脂 又一次再生后重復(fù)使用的洗滌液。
權(quán)利要求
1、一種帶有陽離子識別基團(tuán)的蛋白質(zhì)印跡樹脂的制備方法，其特征是該方法的制備步驟如下第一、合成輔助識別聚合物鏈以二甲基亞砜為溶劑，以N，N-二異丙基碳二亞胺及1-羥基苯并三唑為縮合劑，使得聚合度在40-50的短鏈聚乙烯醇上10％-8％的羥基與芴甲氧羰?；Ｗo(hù)的甘氨酸進(jìn)行接枝反應(yīng)，聚乙烯醇與兩種縮合劑以及芴甲氧羰?；Ｗo(hù)的甘氨酸的比例為每克聚乙烯醇，使用1mLN，N-二異丙基碳二亞胺，2g 1-羥基苯并三唑，8g芴甲氧羰?；Ｗo(hù)的甘氨酸；之后，加入體積比為1∶1的吡啶與丙烯酰氯的混合物，使得聚乙烯醇上另外10％-8％的羥基與丙烯酰氯發(fā)生接枝反應(yīng)，然后加入哌啶脫去甘氨酸上的保護(hù)，用乙醇沉淀，離心，干燥，即得到輔助識別聚合物鏈；第二、對載體進(jìn)行修飾取80-100目在二甲基亞砜中溶脹后的聚乙烯醇微球10g，加入10ml吡啶及10ml丙烯酰氯，30℃下反應(yīng)4h，使得微球上的羥基接枝上丙烯?；?，之后用乙醇洗滌并過渡到水相中，即得雙鍵修飾后的聚乙烯醇微球載體；第三、合成蛋白質(zhì)印跡樹脂在磷酸鹽緩沖溶液中，摩爾比為300∶1的輔助識別聚合物鏈與克隆的豬親環(huán)素18蛋白質(zhì)于4℃進(jìn)行自組裝8小時，之后往溶液中加入的濕的經(jīng)過雙鍵修飾的聚乙烯醇樹脂微球吸附16小時，濕的經(jīng)過雙鍵修飾的聚乙烯醇樹脂微球與克隆的豬親環(huán)素18蛋白質(zhì)的質(zhì)量比為1000∶3；隨后加入質(zhì)量比為29∶1的丙烯酰胺及N，N-亞甲基雙丙烯酰胺混合溶液、過二硫酸銨溶液，室溫通氮除氧1h，然后加入N，N，N′N′-四甲基二乙胺，交聯(lián)聚合反應(yīng)2小時，用500mMKCl溶液洗滌樹脂球至電泳檢測無豬親環(huán)素18蛋白質(zhì)條帶，得到蛋白質(zhì)印跡樹脂。
2、權(quán)利要求1所述方法合成的蛋白質(zhì)印跡樹脂在蛋白質(zhì)分離中的應(yīng)用，其特征在于，該應(yīng)用方法包括下述步驟第一、4℃下，將計量的權(quán)利要求1制備的蛋白質(zhì)印跡樹脂直接放入豬肝細(xì)胞提取物中，吸附1小時；第二、上步吸附蛋白后的蛋白質(zhì)印跡樹脂依次用0．02M磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉組成的緩沖燃6次、2ml, 0.10M氯化鉀溶燃2次、2mL,0.15M氯化鉀溶液洗滌1次、0．30M氯化鉀溶液洗滌2次，0．50M氯化鉀溶液洗滌1次，得到洗滌液；第三、應(yīng)用Bradford法檢測上步得到的氯化鉀緩沖溶液的洗滌液，得出總蛋白含量；再取部分洗滌液，用三氯乙酸僦氧膽酸納方法沉淀蛋白，蛋白液制樣后叵流走十二垸基磺酸鈉．聚丙烯酰胺凝膠電泳，用豬親環(huán)素18的抗體對其做免疫印跡檢測，吸附蛋白中豬親環(huán)素18的含量，從而得出在所吸附蛋白質(zhì)中親環(huán)素18與總蛋白質(zhì)含量的比值。
全文摘要
帶有陽離子識別基團(tuán)的蛋白質(zhì)印跡樹脂制備方法及在蛋白質(zhì)分離中的應(yīng)用。蛋白質(zhì)印跡樹脂制備包括，合成輔助識別鏈、對載體進(jìn)行修飾、合成蛋白質(zhì)印跡樹脂。采用聚乙烯醇作為輔助識別鏈的骨架，識別基團(tuán)確定為氨基，而用于負(fù)載輔助識別鏈的載體選用進(jìn)行對雙鍵修飾的80-100目的聚乙烯醇樹脂微球。為了增加蛋白質(zhì)印跡聚合物的特異性，將識別基團(tuán)在短鏈上所占的比例定為10％-8％。模版蛋白質(zhì)使用克隆的豬親環(huán)素18蛋白質(zhì)。本發(fā)明克服了通常由單體制備的識別體系識別位點單一、結(jié)構(gòu)緊密蛋白質(zhì)不易洗脫的弊端。同時成球與印跡分步進(jìn)行，避免了對模板蛋白質(zhì)的破壞，實用性強(qiáng)。使用克隆的蛋白質(zhì)作為模板，克服了印跡天然微量蛋白質(zhì)時模板無法得到的瓶頸。
文檔編號C08F261/00GK101173028SQ20071005983
公開日2008年5月7日 申請日期2007年10月12日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月12日
發(fā)明者旸 孫, 宓懷風(fēng), 毅 龍 申請人:南開大學(xué)