專利名稱：：低聚葡萄糖硫酸酯及其制備方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及糖類衍生物的生產(chǎn)，具體地說是涉及低聚葡萄糖的硫酸酯化衍生物及其制備方法。
背景技術：
：多糖碌u酸酯(polysaccharidessulfated,PSS)是指含有碌b酸基團的天然及其半合成的酸性多糖，多糖大分子鏈中單糖分子上的某些羥基被硫酸根所取代而形成的一類化學結構復雜、生物活性多樣、構效關系鮮明的多糖衍生物。硫酸酯化多糖的制備包括從天然原材料中分離純化和人工合成兩條途徑。天然多糖硫酸酯主要通過從陸地、海洋動植物的組織和微生物中提取獲得，主要有肝素、軟骨素、褐藻多糖硫酸酯、硫酸酯化半乳聚糖；人工合成的疏酸酯化多糖主要是通過人工化學修飾的方法使多糖含硫酸基團，主要包括硫酸化右旋糖酐、硫酸化香菇多糖、硫酸化裂褶多糖(硫酸化戊聚糖、硫酸化木聚糖、硫酸化地衣多糖等。通過對天然硫酸多糖的研究表明，多糖硫酸酯具有抗凝、增強機體免疫功能、抗腫瘤、抗病毒(如艾滋病毒HIV、巨噬細胞病毒、流感病毒)等一系列生物活性。早在1964年Nahmias等就報道肝素對單純皰滲有抑制作用；1987年又發(fā)現(xiàn)硫酸酯化葡聚糖具有抑制艾滋病毒HIV活性；德國已研制出治療艾滋病的木聚糖硫酸酯，臨床上已試用，獲得良好的效果。多糖硫酸酯種類繁多，其活性大小總的來說受其分子量的大小、硫酸基團的取代度和支鏈結構的影響。譬如，一些硫酸葡聚糖因分子量大，無法跨越細胞膜障礙，而無法發(fā)揮生物學活性；另外有些多糖硫酸化衍生物，由于硫酸根基團過多，甚至表現(xiàn)出一定的毒副作用。因此，采取一定的方法調(diào)節(jié)多糖的聚合度和取代度是獲得目標活性多糖分子的有效方法。近年來，對于直接提取各種天然多糖硫酸酯的研究較多。而對于利用自然界中大量存在的纖維素、淀粉來制備低聚葡萄糖硫酸酯的研究尚未見報導
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種利用纖維素、淀粉制備的可調(diào)節(jié)分子量和硫酸根取代度的低聚葡萄糖硫酸酯。本發(fā)明的另一目的是提供一種利用纖維素、淀粉來制備具有可調(diào)節(jié)分子量和硫酸根取代度的低聚葡萄糖硫酸酯的方法。本發(fā)明的技術方案如下低聚葡萄糖硫酸酯，其特征在于糖鏈中僅含P-D-葡萄糖，并通過a-1，4-糖苷鍵或P-1,4-糖苦鍵連接而成，部分葡萄糖上羥基被硫酸根基團取代，其重均分子量為5x102Da~1xl(TDa，硫酸根取代度為0.1~0.5。上述低聚葡萄糖硫酸酯的制備方法，具體由下列步驟實現(xiàn)步驟l:將容器置于-l(TC(TC恒溫環(huán)境中，/磁力攪拌，向碌u酸中滴加正丙醇，按正丙醇硫酸摩爾比為1:1~1:2.5配置混合反應液；步驟2:將淀粉或纖維素50g加入0.5L~3L上述反應液中，保持溫度-10。C~(TC,反應lh~10h;步驟3:將步驟二反應完成的反應液抽濾，并用乙醇或丙醇洗滌，直到洗滌液中不再顯酸性；步驟4:將抽濾后的殘渣溶于1L~3L水中，維持溫度在60°C~90°C，攪拌使均勻；步驟5:常溫抽濾，濾液即為不同聚合度的葡萄糖硫酸酯水溶液，向上述水溶液中加入1~50倍體積乙醇，將所得溶液3000rpm高速離心機離心10min15min,可得分級沉淀的低聚葡萄糖硫酸酯；沉淀的低聚葡萄糖硫酸酯干燥粉碎后得低聚葡萄糖硫酸酯粉末。上述步驟4中同時滴加NaOH或KOH溶液，調(diào)節(jié)其pH值到7~9,攪拌反應2h-5h。還包括步驟6:以每升溶液中加入100-300克粉末的比例將得到的低聚葡萄糖硫酸酯粉末加入濃度為10%~20%的稀硫酸或濃度為5%-15%的纖維素酶溶液中，低聚葡萄糖疏酸酯粉末溶解于此稀硫酸或纖維素酶溶液，進一步降低低聚葡萄糖疏酸酯的聚合度，將此溶有低聚葡萄糖硫酸酯粉末的溶液通過液相色譜并通過折光示差檢測器可分離得到具有不同聚合度的低聚葡萄糖硫酸酯。采用上述方案后，通過有機溶劑^t濃辟u酸，進而利用其進行酯化和分解反應同步進行，得到分子量較大的低聚葡萄糖疏酸酯，進一步水解或酶解可降低其分子量。本發(fā)明利用纖維素、淀粉所制備的低聚葡萄糖硫酸酯結構可控，可調(diào)節(jié)分子量和硫酸根取代度，從而獲得不同聚合度和取代度的低聚葡萄糖硫酸酯，所制得的低聚葡萄糖硫酸酯具有免疫調(diào)節(jié)和抗癌活性的作用。且本發(fā)明方法工藝筒單，原料來源豐富。具體實施方式本發(fā)明低聚葡萄糖硫酸酯，糖鏈中僅含P-D-葡萄糖，并通過a-l，4-糖苷鍵或P-1，4-糖苷鍵連接而成，部分葡萄糖上羥基被硫酸根基團取代，其重均分子量為5xl02Da~1xl04Da，疏酸根取代度為0.1~0.5。本發(fā)明低聚葡萄糖硫酸酯的制備方法實施例l:低聚葡萄糖硫酸酯的制備方法量取800ml濃碌u酸(98%)倒入燒杯，將燒杯置于-5。C的低溫恒溫槽中，加入正丙醇600ml。稱取干棉花40g加入上述配置好的反應液中，保持溫度0°C,反應5h。用^P少芯漏斗抽濾除去反應液，用5L丙醇洗滌，直至洗滌液中不再顯酸性。將抽濾后的殘渣溶于2L水中，維持溫度在60。C，攪拌使均勻。常溫抽濾，濾液即為葡萄糖硫酸酯水溶液，向上述水溶液中加入10倍體積乙醇，將所得溶液3000rpm高速離心機離心1Omin,可得低聚葡萄糖硫酸酯沉淀。沉淀干燥粉碎后得低聚葡萄糖疏酸酯粉末。實施例2:低聚葡萄糖硫酸鉀的制備方法量取800ml濃石充酸(98%)倒入燒杯，將燒杯置于-5。C的低溫恒溫槽中，加入正丙醇600ml。稱取干棉花40g加入上述配置好的反應液中，保持溫度0°C，反應5h。用砂芯漏斗抽濾除去反應液，用5L丙醇洗滌，直至洗滌液中不再顯酸性。將抽濾后的殘渣溶于2L水中，維持溫度在6(TC，攪拌使均勻，并同時滴加KOH溶液，調(diào)節(jié)其pH到9，攪拌反應2h。常溫抽濾，濾液即為葡萄糖硫酸鈉水溶液，向上述水溶液中加入10倍體積乙醇，將所得溶液3000rpm高速離心機離心10min，可得低聚葡萄糖硫酸鉀沉淀。可得低聚葡萄糖硫酸鉀沉淀。沉淀干燥粉碎后得低聚葡萄糖硫酸鉀粉末。實施例3:低聚葡萄糖硫酸鉀的制備方法%)倒入燒杯，將燒杯置于-5。C的低溫恒溫槽中，加入正丙醇400ml。稱取干棉花40g加入上述配置好的反應液中，保持溫度0°C,反應10h。用砂芯漏斗抽濾除去反應液，用5L丙醇洗滌，直至洗滌液中不再顯酸性。將抽濾后的殘渣溶于2L水中，維持溫度在90。C,攪拌使均勻，并同時滴加KOH溶液，調(diào)節(jié)其pH到9，攪拌反應4h。常溫抽濾，濾液即為葡萄糖硫酸鈉水溶液，向上述水溶液中加入50倍體積乙醇，將所得溶液3000rpm高速離心機離心15min，可得低聚葡萄糖碌u酸鉀沉淀?？傻玫途燮咸烟橇蛩徕洺恋?。沉淀干燥粉碎后得低聚葡萄糖硫酸鉀粉末。本發(fā)明低聚葡萄糖硫酸酯在制備藥物中的應用應用1:低聚葡萄糖硫酸酯的抗凝血活性作用取多份健康人的血液混合，3.8%的檸檬酸鈉與血漿體積比1:9混合抗凝，迅速于3000rpm離心20min，取上清液為貧血小板血漿(PPP),分裝至塑料離心管內(nèi)，-2(TC冷凍儲存，臨用時用37。C恒溫水浴融化，5h內(nèi)測量相應指標。分別取濃度為5|ig/mL、10|ag/mL、20|ag/mL的低聚葡萄糖疏酸鈉溶液0.5mL,加入血漿0.5mL,混勻后方文入凝血4義"義器自動吸取血漿混合液0.lmL和凝血活酶試劑0.lmL,37。C下保溫3min，再自動加入0.lmL濃度為0.025mol/L的CaCl2溶液，混合后自動記錄血漿凝固時間，即為APTT。按照上述取樣，儀器自動吸取0.2mL血漿混合液，37。C下保溫2min,再加入已保溫的凝血酶0.2mL，混合后自動記錄血漿凝固時間，即為TT。按照上述取樣，儀器自動吸取O.lmL血漿混合液，37。C下保溫2min,再加入已保溫好的含釣凝血活酶0.2mL，混合后自動記錄血漿凝固時間，即為PT。所得結果如表l。表l低聚葡萄糖硫酸鈉的抗凝血活性<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>應用2:低聚葡萄糖硫酸酯的病毒空斑抑制作用Vero細胞在24孔板上培養(yǎng)至單層分組備用，4%小牛血清2倍1M0培養(yǎng)基和融化的1.2%瓊脂糖溶液于43~4rC等體積混合，得到2%小牛血清、0.6%瓊脂糖營養(yǎng)覆蓋培養(yǎng)基。低聚葡萄糖硫酸鈉用營養(yǎng)覆蓋培養(yǎng)基稀釋至相應濃度(20jag/mL、40|ag/mL、60jng/mL、80jng/mL、100jug/mL、)。HSV-2病毒稀釋到約3050PFU/孔，加入含糖營養(yǎng)覆蓋培養(yǎng)基，混勾后立即加入對應孔內(nèi)。細胞對照組只加營養(yǎng)培養(yǎng)基，病毒對照組加含HSV-2病毒覆蓋培養(yǎng)基，實驗組加含HSV-2病毒和相應濃度低聚葡萄糖硫酸鈉營養(yǎng)覆蓋培養(yǎng)基。待營養(yǎng)覆蓋培養(yǎng)基凝固后倒置培養(yǎng)2d,加入含1:"00D中性紅的0.6%瓊脂糖上層培養(yǎng)基，凝固后倒置培養(yǎng)ld。觀察病斑形成情況，結果如表2。表2低聚葡萄糖硫酸鈉對HSV-2空斑形成的抑制<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>應用3:低聚葡萄糖硫酸酯對小鼠的免疫調(diào)節(jié)和抗癌活性作用用本發(fā)明的產(chǎn)品按現(xiàn)有方法對小鼠作抗癌活性實驗，結果如表3。從表中可看出，本發(fā)明產(chǎn)品能提高荷瘤小鼠的胸腺指數(shù)和脾指數(shù)，抑瘤率達到32%，具有一定的免疫和抗癌活性。表3低聚葡萄糖硫酸鈉對小鼠的免疫活性和抗癌活性<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>權利要求1、低聚葡萄糖硫酸酯，其特征在于糖鏈中僅含β-D-葡萄糖，并通過α-1，4-糖苷鍵或β-1，4-糖苷鍵連接而成，部分葡萄糖上羥基被硫酸根基團取代，其重均分子量為5×102Da～1×104Da，硫酸根取代度為0.1～0.5。2、低聚葡萄糖硫酸酯的制備方法，其特征在于，具體由下列步驟實現(xiàn)步驟l:將容器置于-10。C(TC恒溫環(huán)境中，^磁力攪拌，向石危酸中滴加正丙醇，按正丙醇碌u酸摩爾比為1:1~1:2.5配置混合反應液；步驟2:將淀粉或纖維素50g加入0.5L~3L上述反應液中，保持溫度-10°C~(TC,反應lh~10h;步驟3:將步驟二反應完成的反應液抽濾，并用乙醇或丙醇洗滌，直到洗滌液中不再顯酸性；步驟4:將抽濾后的殘渣溶于1L3L水中，維持溫度在60°C~90°C，攪拌使均勻，并同時滴加NaOH或KOH溶液，調(diào)節(jié)其pH到79，攪拌反應2h~5h;步驟5:常溫抽濾，濾液即為不同聚合度的葡萄糖疏酸酯水溶液，向上述水溶液中加入1~50倍體積乙醇，將所得溶液3000rpm高速離心機離心10min~15min，可得分級沉淀的低聚葡萄糖碌u酸酯；沉淀的低聚葡萄糖硫酸酯干燥粉碎后得低聚葡萄糖硫酸酯粉末。3、根據(jù)權利要求2所述的低聚葡萄糖硫酸酯的制備方法，其特征在于上述步驟4中同時滴加NaOH或KOH溶液，調(diào)節(jié)其pH值到79,攪拌反應2h~5h。4、根據(jù)權利要求2所述的低聚葡萄糖硫酸酯的制備方法，其特征在于，還包括步驟6:以每升溶液中加入100-300克粉末的比例將得到的低聚葡萄糖硫酸酯粉末加入濃度為10°/。~20%的稀硫酸或濃度為5°/。-15%的纖維素酶溶液中，低聚葡萄糖硫酸酯粉末溶解于此稀硫酸或纖維素酶溶液，進一步降低低聚葡萄糖硫酸酯的聚合度，將此溶有低聚葡萄糖硫酸酯粉末的溶液通過液相色i瞽并通過折光示差檢測器可分離得到具有不同聚合度的低聚葡萄糖硫酸酯。全文摘要本發(fā)明公開了一種低聚葡萄糖硫酸酯及其制備方法，通過有機溶劑分散濃硫酸，進而利用其進行酯化和分解反應同步進行，得到分子量較大的低聚葡萄糖硫酸酯，進一步水解或酶解可降低其分子量。本發(fā)明利用纖維素、淀粉所制備的低聚葡萄糖硫酸酯結構可控，可調(diào)節(jié)分子量和硫酸根取代度，從而獲得不同聚合度和取代度的低聚葡萄糖硫酸酯，所制得的低聚葡萄糖硫酸酯具有免疫調(diào)節(jié)和抗癌活性的作用。且本發(fā)明方法工藝簡單，原料來源豐富。文檔編號C08B37/02GK101148481SQ20071000975公開日2008年3月26日申請日期2007年11月1日優(yōu)先權日2007年11月1日發(fā)明者國陳申請人:華僑大學