專利名稱：：醛結(jié)合的類黃酮制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明一般涉及類黃酮的制劑，并且特別涉及遞送試劑結(jié)合的類黃酮和/或遞送試劑結(jié)合的類黃酮寡聚體。
背景技術(shù)：
：類黃酮是植物多酚的最多的和研究最充分的類別之一。類黃酮由一大類天然存在于水果和蔬菜中的低分子量多酚物質(zhì)組成，并且是人飲食的組成部分。干燥的綠茶葉可以含有多達(dá)30重量％的類黃酮，包括高百分比的被稱為兒茶素(黃烷-3-醇衍生物或兒茶素基的類黃酮)的類黃酮，包括(-)-表兒茶素、(-)-表焙兒茶素(epigallocatechin)、(+)-兒茶素、(-)-表兒茶素掊酸酯(epicatechingallate)和(-)-表焙兒茶素掊酸酯(epicatechingallate)。近年來，這些綠茶兒茶素吸引了許多注意，因?yàn)橐呀?jīng)認(rèn)識(shí)到它們具有生物學(xué)和藥理學(xué)性質(zhì)，包括抗菌的、抗腫瘤的、抗血栓形成的、血管擴(kuò)張的、抗氧化的、抗誘變的、抗致癌的、高膽固醇血癥的(hypercholesterolemic)、抗病毒的和抗炎的性質(zhì)，所述性質(zhì)已經(jīng)在許多的人、動(dòng)物和體外研究中證明(JankunJ.,等.Nature387,561(1997);BodoniA.等.J.Nutr.Biochem.13,103-111(2002);NakagawaK.etal.J.Agric.FoodChem.47，3967-3973(1999))。這些生物學(xué)和藥理學(xué)性質(zhì)在預(yù)防疾病和保護(hù)基因組穩(wěn)定性中是潛在有益的。認(rèn)為兒茶素的許多有益效果與所述兒茶素的抗氧化作用有關(guān)系(TeraoJ.,等.Arch.Biochem.Biophys.308,278-284(1994))。在兒茶素之中，作為綠茶主要組分的(-)-表焙兒茶素掊酸酯(EGCG)被認(rèn)為具有最高的活性，可能由于C3位的三羥基B環(huán)和掊酸酯部分(IsemuraM.,等.Biofactors13,81-85(2000);IkedaI,等.J.Nutr.135,155(2005);LillG"等.FEBSLetters546,265-270(2003);SakanakaS.和OkadaY.J.Agric.FoodChem.52,1688-1692(2004);YokozawaT"等，J.Agric.FoodChem.48,5068-5073(2000))。通常，類黃酮的活性半衰期在身體內(nèi)部限于數(shù)小時(shí)；這些化合物的代謝還沒有確定。盡管包括EGCG的兒茶素的有利的抗氧化和抗癌性質(zhì)，由于固有的體積限制，通過直接攝取大量綠茶在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)該化合物的治療水平是不切實(shí)際的。目卩，為了單獨(dú)通過飲食獲得來自類黃酮的治療的或藥理學(xué)的益處，將需要攝取大于實(shí)際消耗的食品和飲料的量。而且，對(duì)于包括EGCG的數(shù)種類黃酮已經(jīng)報(bào)道了助氧化劑活性，使直接攝取天然綠茶成為不太有效的遞送EGCG的方法(YenG.C，等.J.Agric.FoodChem.45,30-34(1997);YamanakaN,等.FEBSLett.401,230-234(1997);Roedig-Pe腿anA.禾卩GordonM.H.J.Agric.FoodChem.1997,45,4267-4270)。另一方面，已經(jīng)報(bào)道了相對(duì)高分子級(jí)分的萃取植物多酚(矢車菊苷配基)和合成寡聚的(+)-兒茶素和蕓香苷與低分子量類黃酮相比顯示增強(qiáng)的生理學(xué)性質(zhì)諸如抗氧化劑和抗致癌活性，(ZhaoJ.,等.Carcinogenesis,1999,20，1737-1745;ArigaT.禾卩HamanoM.Agric.Biol.Chem.54，2499-2504(1990);ChungJ.E.,等.Biomacromolecules5,113-118(2004);KurisawaM.，等.Biomacromolecules4,1394-1399(2003);HagermanA.E.,等.J.Agric.FoodChem.46，1887(1998))并且無助氧化劑作用(HagermanA.E.,等.J.Agric.FoodChem.46，1887(1998);LiC.和XieB.J.Agric.FoodChem.48，6362(2000))。然而，預(yù)期天然產(chǎn)生的和合成的高分子量類黃酮都不能在攝取以后吸收并輸送至其它組織，因?yàn)檫@些化合物一般是大的，與蛋白質(zhì)形成強(qiáng)絡(luò)合物并且是耐降解的(ZhaoJ.,等.Carcinogenesis,1999.20,1737-1745)。在經(jīng)由口服攝入食物和飲料消耗類黃酮的情況下，類黃酮可以作為抗氧化劑起作用而在消化期間保護(hù)消化道免受氧化性損傷。然而，可以預(yù)期類黃酮僅保持在消化道中，并且因而它們的有益生理活性不可能利用至其它組織。而且，它們的強(qiáng)疏水性以及它們與蛋白質(zhì)形成絡(luò)合物的趨勢(shì)使得這些化合物遞送困難。提供這些化合物的有益屬性，合乎需要的是發(fā)現(xiàn)將允許消耗更大量的遞送方法，或者將在上下文中提供兒茶素基類黃酮的用途，其中通常沒有發(fā)現(xiàn)它們，潛在提供增加的消耗和/或?qū)τ趦翰杷鼗慄S酮的暴露，因此增加得到這些化合物藥理學(xué)益處的潛力。發(fā)明概述在一個(gè)方面中，提供含有游離醛遞送劑和類黃酮的結(jié)合物，所述遞送劑結(jié)合在類黃酮A環(huán)的C6和/或C8位。在另一個(gè)方面中，提供包含描述于此的結(jié)合物的遞送載體。[OOll]在另外的方面中，提供將具有游離醛基的遞送劑在酸存在下結(jié)合至類黃酮的方法，所述方法包含將遞送劑與類黃酮在酸催化劑存在下反應(yīng)。在更另外的方面中，將兒茶素基類黃酮遞送至受試者的方法包含將描述于此的結(jié)合物或遞送載體施用至所述受試者。在閱讀本發(fā)明具體實(shí)施方案的下列描述，結(jié)合附圖的基礎(chǔ)上，本發(fā)明的其它方面和特征對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將變得顯而易見。附圖簡(jiǎn)述在圖中，僅經(jīng)由實(shí)施例說明本發(fā)明的實(shí)施方案，圖1A是(-)-表焙兒茶素掊酸酯(EGCG)的寡聚反應(yīng)以產(chǎn)生寡聚(-)-表焙兒茶素掊酸酯(OEGCG)的示意性描述；圖1B是聚(乙二醇)(PEG)和EGCG的結(jié)合以產(chǎn)生PEG-表焙兒茶素掊酸酯結(jié)合物(PEG-EGCG)的示意性描述；圖1C是PEG和OEGCG的結(jié)合以產(chǎn)生聚(乙二醇)-寡聚表焙兒茶素掊酸酯結(jié)合物(PEG-OEGCG)的示意性描述；圖2A是包含由PEG-EGCG圍繞的自組裝OEGCG蛋白質(zhì)絡(luò)合物的膠束納米絡(luò)合物體系的示意性描述；圖2B是PEG-OEGCG/蛋白質(zhì)絡(luò)合物的膠束納米絡(luò)合物的示意性描述；圖3是水溶液中的EGCG、OEGCG、PEG-EGCG、和PEG-OEGCG的紫外-可見光譜；圖4是EGCG、OEGCG、PEG-EGCG、PEG-OEGCG、禾卩PEG的DSC熱圖；圖5是磷酸鹽緩沖液(PBS)中的PEG、EGCG、PEG-EGCG、OEGCG、和PEG-OEGCG的；-電勢(shì)的圖；圖6是在519nm測(cè)量的用EGCG、OEGCG、PEG-EGCG、和PEG-OEGCG處理的DPPH溶液的紫外-可見光譜；圖7是描述EGCG、OEGCG、PEG-EGCG、PEG-OEGCG、和別嘌呤醇(11=8)的XO抑制活性的曲線圖；圖8是描述EGCG、OEGCG、PEG-EGCG、和PEG-OEGCG(n=8)的UPA抑制活性的曲線圖；圖9是顯示OEGCG和蛋白質(zhì)濃度對(duì)于膠束納米絡(luò)合物尺寸的影響的曲線圖；圖10是顯示在不同濃度PEG加入PEG-EGCG時(shí)對(duì)于膠束納米絡(luò)合物尺寸的影響的圖；圖ll顯示PBS中多種組分的；-電勢(shì)；圖12是表示存在或沒有OEGCG中形成的膠束納米絡(luò)合物尺寸的曲線圖[a:BSA;b:BSA+PEG;c:BSA+PEG-EGCG;d:(BSA+PEG-EGCG)+BSA;e:PEG-EGCG;f:PEG-EGCG+BSA;g:DMSO中的PEG-EGCG;h:(BSA+OEGCG)+PEG-EGCG;i:((BSA+OEGCG)+PEG-EGCG)+BSA];圖BA是OEGCG/蛋白質(zhì)、PEG-EGCG膠束納米絡(luò)合物的TEM圖像；圖13B顯示用光散射測(cè)量的OEGCG/蛋白質(zhì)、PEG-EGCG膠束納米絡(luò)合物的尺寸分布；圖14是表示用DNA形成的絡(luò)合物的尺寸的圖[o:OEGCG+DNA;EGCG+DNA];圖15是顯示多種樣品中形成的絡(luò)合物尺寸的曲線圖[a:(BSA+OEGCG)+PEG-EGCG;b:OEGCG+PEG-EGCG;c:(OEGCG+PEG-EGCG)+BSA;d:OEGCG+PEG;e:(OEGCG+PEG)+BSA];圖16是顯示多種樣品中形成的絡(luò)合物尺寸的圖[a:BSA;b:BSA+PEG-OEGCG;c:在超聲破碎以后的b;d:BSA+OEGCG;e:(BSA+OEGCG)+PEG-OEGCG;f:在超聲破碎以后的e];圖17是顯示pH對(duì)于PEG-OEGCG絡(luò)合作用的影響的圖；圖18是顯示多種樣品中形成的絡(luò)合物尺寸的曲線圖[a:蒸餾水中的PEG-OEGCG;b:蒸餾水中的EGCG+PEG-OEGCG;c:蒸餾水中的OEGCG+PEG-OEGCG;d:蒸餾水中的BSA+PEG-OEGCG;e:蒸餾水中的(BSA+EGCG)+PEG-OEGCG;f:蒸餾水中的(BSA+OEGCG)+PEG-OEGCG;g:在PBS中取代以后的f];圖19是透明質(zhì)酸-氨基乙酰基醛二乙基縮醛結(jié)合物的合成法的表述；圖20是透明質(zhì)酸-EGCG結(jié)合物的合成法的表述；圖21是透明質(zhì)酸-酪胺-EGCG(HA-Tyr-EGCG)水凝膠合成的示意性描述；圖22A是顯示從多種HA-Tyr-EGCG水凝膠釋放的FITC-BSA量的曲線圖；圖22B是顯示從多種HA-Tyr-兒茶素水凝膠釋放的FITC-BSA的量的曲線圖；圖23A是顯示多種透明質(zhì)酸-EGCG(HA-EGCG)結(jié)合物的超氧化物清除活性的曲線圖；圖23B是顯示多種HA-EGCG結(jié)合物的黃嘌呤氧化酶抑制活性的曲線圖；禾口圖24是顯示HA-EGCG結(jié)合物的尿激酶抑制活性的曲線圖。詳細(xì)說明—般合乎需要的是尋找在體內(nèi)容易增加類黃酮濃度并且改善這種類黃酮有效遞送至體內(nèi)的多種組織的方法。為了增加有益的類黃酮化合物的可用性，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)通過遞送劑上的游離醛基到類黃酮A環(huán)而將類黃酮結(jié)合至多種遞送劑，容許在不破壞類黃酮多酚結(jié)構(gòu)的情況下修飾類黃酮的物理性質(zhì)，而增加類黃酮的生物學(xué)和藥理學(xué)性質(zhì)。即，醛介導(dǎo)的遞送劑對(duì)于類黃酮的結(jié)合導(dǎo)致所述遞送劑附在類黃酮A環(huán)的C6和/或C8位，并且不破壞或影響類黃酮的B和C環(huán)或者類黃酮上的多種羥基。遞送劑對(duì)于類黃酮的結(jié)合可以提供通過將類黃酮結(jié)合到用遞送劑形成的特定載體中而適于施用至受試者的組合物，并且可以允許施用比通過飲食獲得的更高濃度的類黃酮。所述遞送劑可以對(duì)于組合物提供穩(wěn)定性，產(chǎn)生代謝或降解更慢的組合物，并且因而可以在體內(nèi)具有比單獨(dú)的未結(jié)合類黃酮更長(zhǎng)的半衰期。例如，所述遞送劑可以具有類黃酮結(jié)合到組合物中這樣一種屬性以便增強(qiáng)類黃酮的水溶解度，其可以避免由網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)攝取以及隨后被腎清除，在體內(nèi)產(chǎn)生更長(zhǎng)的半衰期。其它遞送劑的結(jié)合可以保護(hù)類黃酮免受酶降解。因而，目前提供將遞送劑結(jié)合至類黃酮的方法，所述方法包含將遞送劑與類黃酮在酸催化劑存在下反應(yīng)，所述遞送劑具有游離醛基，或在酸存在下能轉(zhuǎn)化成游離醛基的基團(tuán)。所述類黃酮可以是來自從核心苯基芐基吡喃酮結(jié)構(gòu)獲得的通常類別分子的任何類黃酮，并且包括黃酮、異黃酮、黃酮醇、黃烷酮、黃院-3-醇、兒茶素、花色素和查耳酮。在具體實(shí)施方案中，所述類黃酮是兒茶素或兒茶素基的類黃酮。兒茶素，或兒茶素基的類黃酮是屬于一般稱為兒茶素(或黃烷-3-醇衍生物)類別的任何類黃酮，并且包括兒茶素和兒茶素衍生物，包括表兒茶素、表焙兒茶素、兒茶素、表兒茶素掊酸酯和表焙兒茶素掊酸酯，并且包括兒茶素或兒茶素基類黃酮的全部可能的立體異構(gòu)體。在具體實(shí)施方案中，所述兒茶素基類黃酮是(+)-兒茶素或(-)-表焙兒茶素格酸酯。認(rèn)為在所述兒茶素基類黃酮之中，(-)-表焙兒茶素掊酸酯(EGCG)具有最高活性，可能由于三羥基B環(huán)和該類黃酮C3位的掊酸酯酯部分。所述遞送劑是任何化學(xué)基團(tuán)或部分，其含有游離醛或基團(tuán)，或者可以在酸存在下轉(zhuǎn)化成游離醛基的官能團(tuán)，例如縮醛基。所述遞送劑能夠形成遞送載體，因而允許結(jié)合的類黃酮結(jié)合到所述遞送載體中，而不損害類黃酮的生物學(xué)或藥理學(xué)性質(zhì)。同樣，所述遞送劑應(yīng)該是生物相容的，并且在一些實(shí)施方案中可以是生物可降解的。下列討論指的是類黃酮是兒茶素基類黃酮并且遞送劑是聚合物的實(shí)施方案。然而，應(yīng)當(dāng)理解，含有醛的化學(xué)基團(tuán)和類黃酮之間的醛縮作用適用于具有游離醛基的任何遞送劑，包括將遞送劑隨后酸處理，結(jié)合至任何類黃酮，如上所述。因而，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法涉及在酸存在下將含有游離醛基或能轉(zhuǎn)化成游離醛基的基團(tuán)的聚合物結(jié)合至兒茶素基類黃酮。所述兒茶素基類黃酮可以是兒茶素基類黃酮的單一單體單元或者它可以是一個(gè)或多個(gè)兒茶素基類黃酮的寡聚體。兒茶素基類黃酮的寡聚體趨于具有增強(qiáng)水平的與兒茶素基類黃酮有關(guān)的生物學(xué)和藥理學(xué)性質(zhì)，并且甚至可以具有減少的有時(shí)與單體兒茶素基類黃酮有關(guān)的助氧化劑效果。兒茶素基類黃酮的寡聚體是已知的，包括通過酶催化氧化偶合和通過醛介導(dǎo)的寡聚反應(yīng)制備的寡聚體。醛介導(dǎo)的寡聚反應(yīng)過程產(chǎn)生具有限定鍵的無支鏈的寡聚體，例如通過從一個(gè)單體的A環(huán)上的C6或C8位連接至下一個(gè)單體A環(huán)上的C6或C8位的CH-CH3橋，包括以任何一個(gè)可能的立體異構(gòu)，在可應(yīng)用的情況下。例如，圖1A描述了從醛介導(dǎo)的寡聚反應(yīng)法產(chǎn)生的寡聚的(-)-表焙兒茶素掊酸酯(OEGCG)，其通過(-)-表焙兒茶素掊酸酯單體的C6-C8鍵連接。兒茶素基類黃酮的寡聚體可以是連接在一起的2個(gè)或多個(gè)單體單元。在某些實(shí)施方案中，所述兒茶素基類黃酮寡聚體具有2至100個(gè)類黃酮單體單元，從IO至IOO，從2至80，從10至80，從2至50，從10至50，從2至30，從10至30，從20至100，從30至100或從50至100個(gè)單體單元。所述聚合物可以是在與兒茶素基類黃酮結(jié)合之前具有游離醛基的任何聚合物，或具有在酸存在下轉(zhuǎn)化成醛基的基團(tuán)，例如縮醛基。而且，應(yīng)當(dāng)理解所述聚合物應(yīng)當(dāng)是非毒性的、生物相容的并且適于藥理學(xué)應(yīng)用。所述聚合物也可以具有其它合乎要求的性質(zhì)，例如，所述聚合物可以具有低免疫原性，并且它可以是生物可降解的或不可生物降解的，取決于所述組合物所需的生物學(xué)應(yīng)用，例如，用于體內(nèi)特定部位的兒茶素基類黃酮或其它生物活性劑的控釋。所述聚合物可以基于它的特定特征和它形成某些類型遞送載體的能力而選擇。例如，所述聚合物可以是醛封端的聚(乙二醇)，或它可以是用醛基衍生化的透明質(zhì)酸，或這種聚合物的衍生物。備選地，所述聚合物可以是苯氧甲基(甲基亞肼基)樹狀聚體(PMMH)，例如，環(huán)三磷腈核心的PMMH或硫代磷酰核心的PMMH。所述聚合物也可以是任何生物聚合物，改性成含有游離醛基或在酸存在下可轉(zhuǎn)化成醛的基團(tuán)，例如醛改性的蛋白質(zhì)、肽或核酸。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述聚合物是醛封端的聚(乙二醇)(PEG-CHO)。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述聚合物是醛衍生化的透明質(zhì)酸，與氨基乙?；┒一s醛結(jié)合的透明質(zhì)酸，或者上述用酪胺衍生化的透明質(zhì)酸聚合物的任何一種。所述聚合物上的游離醛基便于以受控方式將聚合物結(jié)合至類黃酮結(jié)構(gòu)的A環(huán)的C6或C8位或兩者上，因而防止類黃酮結(jié)構(gòu)破裂，特別是所述類黃酮的B和C環(huán)，并且因而保留類黃酮有益的生物學(xué)和藥理學(xué)性質(zhì)。經(jīng)由聚合物的醛基與兒茶素基類黃酮A環(huán)的C6和/或C8位的反應(yīng)而將所述聚合物結(jié)合至兒茶素基類黃酮，如圖1B和圖1C中所示。利用所述聚合物的醛基與兒茶素基類黃酮縮合的酸催化，或者利用酸將所述聚合物上的官能團(tuán)轉(zhuǎn)化成游離醛之后是醛基與兒茶素基類黃酮的縮合，合成所述結(jié)合物。為了結(jié)合所述聚合物和兒茶素基類黃酮，可以將所述聚合物和兒茶素基類黃酮分別溶解在適合的溶劑中。在酸存在下，將具有游離醛的聚合物例如通過逐滴加入而添加至含有兒茶素基類黃酮的溶液。允許所述反應(yīng)進(jìn)行完全。在所述結(jié)合反應(yīng)之后，可以從結(jié)合的組合物除去過量的未反應(yīng)聚合物或兒茶素基類黃酮，例如通過滲析或者通過分子篩分離。可以改變兒茶素基類黃酮對(duì)于聚合物的比例，以便僅有一個(gè)聚合物部分附于所述聚合物的兒茶素基類黃酮部分，或者以便兒茶素基類黃酮部分附于所述聚合物上一個(gè)以上的位置，或者以便兒茶素基類黃酮部分具有兩個(gè)聚合物部分，一個(gè)附于兒茶素基類黃酮的C6和C8位的任何一個(gè)。最終組合物中的聚合物對(duì)于兒茶素基類黃酮的比例可以通過起始試劑的比例控制。例如，當(dāng)聚合物部分對(duì)于兒茶素基類黃酮部分的摩爾比約為1時(shí)，單一的聚合物部分將附于單一的兒茶素基類黃酮部分(可以使用單體的或寡聚的任何一種)。然而，在更高濃度的聚合物，例如在聚合物對(duì)于兒茶素基類黃酮的10:1摩爾比，可以獲得具有聚合物-類黃酮-聚合物的三-嵌段結(jié)構(gòu)的組合物。也預(yù)期含有游離醛的聚合物和兒茶素基類黃酮的結(jié)合物，所述結(jié)合物具有在類黃酮A環(huán)的C6和/或C8位結(jié)合的聚合物。所述聚合物的結(jié)合也容許兒茶素基的類黃酮結(jié)合到多種組合物或載體中。通過基于所述聚合物的物理性質(zhì)選擇含有游離醛基的特定聚合物，可以將類黃酮結(jié)合到不同的載體類型中，在不同上下文中容許將高濃度類黃酮遞送至身體的多種靶向區(qū)域。因而，根據(jù)結(jié)合物的聚合物部分的屬性，從上述方法產(chǎn)生的本結(jié)合物可以形成遞送載體。根據(jù)遞送載體的屬性，所述遞送載體可以用于將兒茶素基的類黃酮遞送至身體，包括身體中特定的靶向部位。任選地，在遞送載體中可以包括生物活性劑，其隨后可以同時(shí)遞送到身體內(nèi)的部位。因而，提供包含組合物的遞送載體，所述組合物包含通過聚合物上的游離醛基結(jié)合至聚合物的兒茶素基類黃酮，所述遞送載體任選另外包含生物活性劑。所述生物活性劑可以是在身體內(nèi)具有生物學(xué)、藥理學(xué)或治療效果的任何試劑，并且包括蛋白質(zhì)、核酸、小分子或藥物。作為蛋白質(zhì)的生物活性劑可以是肽、抗體、激素、酶、生長(zhǎng)因子、或細(xì)胞因子。作為核酸的生物活性劑可以是單鏈或雙鏈DNA或RNA、短的發(fā)夾式RNA、siRNA，或者可以包含編碼治療產(chǎn)物的基因?？股?、化療劑和抗高血壓劑也包括在生物活性劑范圍內(nèi)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述遞送載體是膠束納米絡(luò)合物，其適于將兒茶素基類黃酮，和任選生物活性劑胃腸外遞送至身體內(nèi)的特定部位。選擇所述聚合物具有容許它與所述組合物的兒茶素基類黃酮部分組裝的性質(zhì)，保護(hù)類黃酮免受溶液環(huán)境影響。如果選擇適合的溶劑，其中所述結(jié)合物的聚合物部分是可溶的并且比兒茶素基類黃酮更可溶，則所述結(jié)合物將自組裝，從類黃酮核心排除溶液，因而容許膠束絡(luò)合物的組裝。在膠束納米絡(luò)合物遞送載體的具體實(shí)施方案中，選擇的聚合物是醛封端的PEG，或其衍生物。PEG是廣泛用作藥理學(xué)成分的聚合物，并且擁有良好的親水的、非毒性的、非免疫性的和生物相容性特征，具有低生物降解性。通過將PEG-CHO結(jié)合至兒茶素基類黃酮，形成具有強(qiáng)自組裝趨勢(shì)的結(jié)合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，將PEG結(jié)合至兒茶素基類黃酮單體，以形成PEG-類黃酮。所述遞送載體與非結(jié)合的兒茶素基類黃酮并且任選生物活性劑一起形成。因而，中心核心含有相對(duì)高濃度的類黃酮并且膠束納米絡(luò)合物的外殼包含結(jié)合的PEG-單體類黃酮，并且以兩步過程組裝。在具體實(shí)施方案中，寡聚EGCG的中心核心和外部核心由結(jié)合的PEG-EGCG組成。所述遞送載體的該實(shí)施方案非常適合于遞送生物活性劑。因?yàn)樗鰞翰杷鼗慄S酮具有剛性的、多環(huán)核心的結(jié)構(gòu)，所以這些分子與生物活性劑諸如蛋白質(zhì)和核酸以及含有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的其它分子充分締合，很可能通過兒茶素環(huán)與生物活性劑上的一個(gè)或多個(gè)環(huán)堆疊。因而，寡聚兒茶素基類黃酮可用于與生物活性劑締合，之后在膠束納米絡(luò)合物中組裝，如圖2A中所示。根據(jù)遞送到身體中特定部位的生物活性劑的總量，并且根據(jù)不動(dòng)搖膠束結(jié)構(gòu)的情況下包括在膠束納米絡(luò)合物中的生物活性劑的量，選擇生物活性劑的濃度。在某些實(shí)施方案中，高達(dá)50重量％，或高達(dá)40重量%的膠束絡(luò)合物可以包含所述生物活性劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將PEG結(jié)合至寡聚的兒茶素基的類黃酮。所述遞送劑的該實(shí)施方案具有強(qiáng)自組裝性質(zhì)并且可以在--步過程中自組裝。隨著上面的兩步組裝的膠束納米絡(luò)合物，單步自組裝的膠束納米絡(luò)合物可以任選包括生物活性劑。圖2B描述包含PEG-OEGCG和蛋白質(zhì)的納米絡(luò)合物。以上膠束納米絡(luò)合物具有納米級(jí)的尺寸，并且直徑可以為約1nm至約10000nm，或者直徑為約20nm至約4000nm，或者直徑為約20nm至約100nm。通過改變寡聚兒茶素基類黃酮的長(zhǎng)度、所述聚合物的長(zhǎng)度、未結(jié)合的寡聚兒茶素基類黃酮的濃度，可以改變膠束納米絡(luò)合物的尺寸。膠束納米絡(luò)合物的尺寸可以是pH依賴的，取決于使用的聚合物。例如，在結(jié)合的聚合物是PEG的膠束納米絡(luò)合物中，膠束的直徑趨于隨著增加的pH而減小。—般地，所述膠束納米絡(luò)合物進(jìn)行自組裝并且因而需要很少的合成。對(duì)于兩步的過程，將形成核心的組分溶解在適合的溶劑中，例如溶解在稀釋的DMSO或甲醇中，并且容許組裝。所述溶劑是核心組分可溶性的溶劑，并且其可以在水中可互溶，或者其可以是易揮發(fā)的，或者可以從其另外離析或萃取組裝的膠束。如上所示，例如所述核心組分可以是生物活性劑和兒茶素基類黃酮，例如寡聚的兒茶素基類黃酮。然后將形成外殼的聚合物-兒茶素基類黃酮的結(jié)合物加入到溶液并且容許形成所述膠束絡(luò)合物。該膠束納米絡(luò)合物體系提供實(shí)現(xiàn)兒茶素基類黃酮的受控生物分布和延長(zhǎng)的血流中循環(huán)半衰期的能力，原因在于PEG外殼，并且提供增強(qiáng)的兒茶素基類黃酮化合物的病理學(xué)活性，具有附加的益處，這樣的化合物可以伴有裝載在所述膠束內(nèi)核中的另外生物活性劑的治療效果。當(dāng)所述生物活性劑是敏感分子諸如蛋白質(zhì)時(shí)，納米級(jí)膠束提供方便的具有溫和優(yōu)點(diǎn)的遞送載體，不涉及與當(dāng)前使用的常規(guī)膠囊化技術(shù)有關(guān)的機(jī)械的、熱的和化學(xué)應(yīng)力的自組裝方法，所述常規(guī)技術(shù)可以產(chǎn)生敏感生物活性劑諸如蛋白質(zhì)的變性。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述遞送載體是水凝膠，所述水凝膠可以用作緩釋遞送生物活性劑的傷口或燒傷敷料，用作組織再生、治療關(guān)節(jié)炎，或者用于化妝品應(yīng)用諸如美容面具的支撐物。選擇所述聚合物具有良好的溶脹性特征并且具有可用于交聯(lián)聚合物部分的適當(dāng)基團(tuán)，并且是非毒性的和生物相容性的，并且在一些實(shí)施方案中是生物可降解的。在所述水凝膠的具體實(shí)施方案中，所述聚合物是醛衍生化的透明質(zhì)酸，或者是透明質(zhì)酸的衍生物，諸如透明質(zhì)酸氨基乙?；┒一s醛結(jié)合物，或醛衍生化的透明質(zhì)酸或透明質(zhì)酸氨基乙酰基醛二乙基縮醛結(jié)合物的酪胺衍生物。包含透明質(zhì)酸-兒茶素基類黃酮的結(jié)合物可以容易地交聯(lián)以形成水凝膠，而不破壞類黃酮的生物學(xué)或藥理學(xué)性質(zhì)。這樣的水凝膠也可以任選包含如上所述的生物活性劑，用于在涂敷水凝膠的部位釋放生物活性劑。通過將透明質(zhì)酸與兒茶素基類黃酮在例如pH約為1的酸性條件下反應(yīng)而合成所述透明質(zhì)酸-類黃酮結(jié)合物。然后例如通過透析純化結(jié)合的聚合物-類黃酮，并且然后與生物活性劑和交聯(lián)劑諸如過氧化氫混合。加入交聯(lián)的催化劑例如辣根過氧化酶，并且然后可以將水凝膠快速傾入到模型中而形成所需形狀，之后完成所述交聯(lián)反應(yīng)。例如，所述水凝膠可以形成適于作為傷口敷料涂敷的厚片。也可以注入所述水凝膠的組分并反應(yīng)而在體內(nèi)形成水凝膠，例如通過與交聯(lián)劑諸如過氧化氫和交聯(lián)催化劑例如辣根過氧化酶一起，任選含有生物活性劑，注入未交聯(lián)的結(jié)合物進(jìn)行。這樣一種水凝膠用于遞送藥物至身體內(nèi)特定部位，或者用于組織工程。因?yàn)橥该髻|(zhì)酸具有可以在結(jié)合反應(yīng)期間與類黃酮反應(yīng)的多個(gè)位點(diǎn)，通過改變起始反應(yīng)中的兒茶素基類黃酮的濃度，所以可以改變透明質(zhì)酸聚合物和兒茶素基類黃酮之間的結(jié)合程度。例如，可以調(diào)節(jié)反應(yīng)物的比例，以便產(chǎn)生的結(jié)合物具有約1%至約10%的聚合物上的與類黃酮結(jié)合的位點(diǎn)。備選地，可以將另外的未結(jié)合透明質(zhì)酸加入到所述混合物，之后交聯(lián)所述水凝膠，以便水凝膠中的一些聚合物分子不會(huì)結(jié)合至類黃酮。上述組合物和遞送載體非常適于將兒茶素基類黃酮受控并耙向遞送至體內(nèi)的特定部位。所述類黃酮可以在靶向部位提供抗菌的、抗腫瘤的、抗血栓形成的、血管擴(kuò)張的、抗氧化劑的(antioxidant)、抗誘變的、抗致癌的、高膽固醇血癥的(hypercholesterolemic)、抗病毒的和抗炎的活性。因而，以上結(jié)合物和遞送載體用于多種治療應(yīng)用。另外，遞送載體可以包括另外的生物活性劑，使遞送載體在治療廣泛的病癥和疾病中有用。例如，包括細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的免疫調(diào)節(jié)肽和蛋白質(zhì)己經(jīng)作為治療癌癥、myelodepresssion和傳染病的重要藥物類別而出現(xiàn)。因而，目前提供將兒茶素基類黃酮遞送至受試者的方法，所述方法包含施用含有游離醛和兒茶素基類黃酮的聚合物結(jié)合物，具有結(jié)合在類黃酮A環(huán)的C6和/或C8位的聚合物也是預(yù)期的，如上所述。在某些實(shí)施方案中，所述結(jié)合物形成遞送載體，諸如膠束納米絡(luò)合物或水凝膠，如上所述。所述受試者是需要兒茶素基類黃酮并且可以還需要另外生物活性劑的任何動(dòng)物，包括人。將根據(jù)所述結(jié)合物的形式，可以利用己知方法施用所述結(jié)合物。優(yōu)選非口服的路線，特別是生物活性劑正在以和所述結(jié)合物的相同形式施用。如果將所述結(jié)合物配成溶液，或者是膠束納米顆粒的形式，所述結(jié)合物可以是胃腸外遞送的，包括靜脈內(nèi)的、肌肉內(nèi)的，或者通過直接注射入耙向的組織或器官。如果將所述結(jié)合物配制成水凝膠，則可以將結(jié)合物局部施用或通過外科插入在損傷部位?？梢詫⒔Y(jié)合物與生物活性劑組合使用，特別是如上所述將所述結(jié)合物配制成遞送載體的情況。當(dāng)施用至患者時(shí)，以有效量和劑量將所述結(jié)合物施用充分的時(shí)期以實(shí)現(xiàn)所需結(jié)果。例如，可以以遞送兒茶素基類黃酮所需的數(shù)量和劑量使用所述結(jié)合物，其可以對(duì)于感染、疾病或病癥起緩和、改善、減輕、改良、穩(wěn)定、預(yù)防其傳播，減少或削弱其進(jìn)展或治愈其，或抑制、減輕或修復(fù)疾病相關(guān)酶的活性的作用。疾病相關(guān)的酶是涉及代謝或生物化學(xué)途徑的酶，當(dāng)阻斷所述途徑時(shí)，或者當(dāng)阻斷或抑制所述酶或途徑的調(diào)節(jié)控制時(shí)，所述酶的活性涉及疾病或病癥的發(fā)作或進(jìn)行。施用至受試者的結(jié)合物的有效量可以根據(jù)許多因素而改變，所述因素諸如結(jié)合物的藥效性質(zhì)，包括聚合物部分和兒茶素基類黃酮部分，施用方式，受試者的年齡、健康和重量，病癥或疾病狀態(tài)的屬性和程度，治療的頻率和，如果有的話，共同作用的治療類型，和結(jié)合物的濃度和形式。16本領(lǐng)域技術(shù)人員可以基于上述因素確定適當(dāng)?shù)牧?。根?jù)受試者的臨床反應(yīng)，可以以根據(jù)需要調(diào)節(jié)的合適量最初施用所述結(jié)合物。可以實(shí)驗(yàn)確定所述結(jié)合物的有效量并且可以取決于可以安全施用的結(jié)合物的最大量。然而，施用的結(jié)合物的量應(yīng)當(dāng)是產(chǎn)生所需結(jié)果的最小量。通過下列非限制性實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。實(shí)施例(+表焙兒茶素掊酸酯(EGCG)，綠茶的主要成分，顯示許多生物學(xué)和藥理學(xué)效果。在下列實(shí)施例中，利用通過酸催化劑的醛-介導(dǎo)縮合而合成聚(乙二醇)與EGCG或寡聚EGCG(OEGCG)的結(jié)合物。用分子量、NMR光譜、酚分析、紫外-可見光譜、DSC熱分析圖、和；-電勢(shì)表征合成的化合物。實(shí)施例1:聚乙二醇與(-)-表焙兒茶素掊酸酯或與寡聚(-)-表焙兒茶素掊酸酯的結(jié)合在該研究中，本發(fā)明人合成聚(乙二醇)(PEG)與(-)-表焙兒茶素掊酸酯(EGCG)或寡聚EGCG(OEGCG)的結(jié)合物。利用醛封端的PEG(PEG-CHO)的PEG-EGCG或PEG-OEGCG結(jié)合是通過PEG鏈末端的醛部分和EGCG部分的親核間苯三酚環(huán)之間的Baeyer酸催化的縮合進(jìn)行的(圖1)。材料(-)-表焙兒茶素掊酸酯(EGCG)購(gòu)自KURITALTD.,日本。醛封端的聚乙二醇(PEG-CHO)購(gòu)自NOFCo.，日本。乙酸、乙醛、PURPALD,Folin-Ciocalteau酚試劑、碳酸鈉、香草醛和二甲基亞砜-d(,購(gòu)自Sigma-Aldrich。IN的氫氧化鈉購(gòu)自WakoPureChemicalIndustries,日本。其它試劑和溶劑是市場(chǎng)上可買到的并且原樣使用。PEG-表焙兒茶素掊酸酯結(jié)合物的合成將PEG-CHO和EGCG分別溶解在乙酸/水/乙醇或乙酸/水/DMSO的混合物中。過量于PEG-CHO而改變EGCG的摩爾比。將所述反應(yīng)通過逐滴加入PEG-CHO溶液而啟動(dòng)并且在空氣或氮?dú)鈿夥赵?0。C(pH2.9)進(jìn)行各種反應(yīng)時(shí)間。在室溫下將得到的產(chǎn)物對(duì)于IOOO倍體積的甲醇透析(分子量截止值3.5xlO"兩天。將滲析物替換至蒸餾水六次并凍干殘留溶液而產(chǎn)生PEG和(-)-表焙兒茶素掊酸酯、或PEG-EGCG的結(jié)合物。'HNMR(畫S0-4):S2.6-3.0(C環(huán)的H-4),3.2-3.7(PEG的CH30和CH2CH20),4.9-5.0(C環(huán)的H-2),5.5(C環(huán)的H-3),5.8-6.0(A環(huán)的H-6和8),6.3-6.5(3，4,5-三羥苯甲酰部分的H-2"和6"),6.7-6.9(B環(huán)的H-2'和6')。13CNMR(DMSO-^5):S31.5(C環(huán)的C-4)，47.8-49(PEG的CH2CHO),58.9(PEG的CH30),70.7-72.1(PEG的CH2CH20)，106.3-106.4(B環(huán)的C-2'和6'),109.5(3，4,5-三羥苯甲酰部分的C-2"和6")，146.2-146.4(B環(huán)的C陽(yáng)3'和5'和3,4,5-三羥苯rp酰部分的C-3"和5")。寡聚表焙兒茶素掊酸酯的合成將EGCG溶解在乙酸/水/DMSO或乙酸/水/乙醇的混合物中。通過添加乙醛啟動(dòng)所述反應(yīng)并且在20。C(pH2.3)在空氣或氮?dú)鈿夥障逻M(jìn)行各種反應(yīng)時(shí)間。將得到的產(chǎn)物以上述同樣方式透析(分子量截止值lxl03)。將殘留溶液凍干以產(chǎn)生寡聚的表焙兒茶素掊酸酯(OEGCG)。'HNMR(DMS0-4;):51.1-1.9(CHCH3),2.6-3.1(C環(huán)的H-4).3.0-3.5(C環(huán)的H-3),4.9-5.1(C環(huán)的H-2)，5.1-5.4(CHCH3),6.4-6.5(3,4,5-三羥苯甲酰部分的H-2"和6"),6.8-6.9(B環(huán)的H-2'禾卩6')。13C函R(DMSO-40:S15.6-19(CHCH3),19-24(CHCH;),26.6-27.4(C環(huán)的C-4)，68.5-68.6(C環(huán)的C-3),77.3-77.4(C環(huán)的C-2),106.2-106.3(B環(huán)的C-2'和6'),109.5-109.6(3,4,5-三羥苯甲酰部分的C-2"和6"),120.0-120.1(3，4,5-三羥苯甲酰部分的C-l"),129.3-129.5(A環(huán)的C-4c),133.1-133.2(B環(huán)的C-l'),139.4(B環(huán)的C-4'和3,4,5-三羥苯甲酰部分的C-4"),]46.2-146.5(B環(huán)的C-3'禾Q5'和3,4,5-三羥苯甲酰部分的C-3"和5").,150-158(A環(huán)的C-5，7和8b),166(3,4，5-三羥苯甲酰部分的C-a)。PEG-寡聚表焙兒茶素掊酸酯的合成將PEG-CHO溶解在乙酸/水/乙醇或乙酸/水/DMSO的混合物中。將OEGCG溶解在對(duì)于PEG-CHO的那些具有多種摩爾比(0.1-1)的相同溶劑中。逐滴加入PEG-CHO的溶液并且在空氣或氮?dú)鈿夥障略?0-5(TC(pH2.3-3.0)進(jìn)行所述反應(yīng)不同的反應(yīng)時(shí)間。以上述的相同方式透析(分子量截止值5000)得到的不透明產(chǎn)物。在離心(rpm-3.5xl0"以后，收集沉淀并一式三份用蒸餾水洗滌，接著是凍干以產(chǎn)生PEG和寡聚(-)-表焙兒茶素掊酸酯(PEG-OEGCG)的結(jié)合物。'HNMR(DMSO隱^):S1.1-1.5(CHCH3)，2.6-3.1(C環(huán)的H-4),3.2-3.7(PEG的CH30和CH2CH20)，4.9-5.0(C環(huán)的H-2)，5.1-5.4(CHCH3),6.4-6.5(3，4,5-三羥苯甲酰部分的H-2"和6")，6.8-6.9(B環(huán)的H-2'和6')。13CNMR(DMSO誦^):570.7-72.2(PEG的CH2CH20),77.3-77.4(C環(huán)的C-2)，106.2-106.4(B環(huán)的C國(guó)2'和6')，109.5-109.6(3，4，5畫三羥苯甲酰部分的C-2"和6"),120.0-120.1(3,4，5-三羥苯甲酰部分的C-l")，129.3-129.5(A環(huán)的C-4c)，133.1-133.2(B環(huán)的C-l'),139.4(B環(huán)的C-4'和3，4，5-三羥苯甲酰部分的C-4")，146.2-146.5(B環(huán)的C-3'和5'和三羥苯甲酰部分的C-3"和5")，150-158(A環(huán)的C-5,7和8b),166(三羥苯甲酰部分的C-a)。測(cè)量在乙?；院?，用具有WatersStyragelHR4E/HR5E柱的尺寸排阻色譜法(SEC)(裝有RI-2410檢測(cè)器的Waters26卯，聚苯乙烯標(biāo)準(zhǔn)物)在40'C利用流速為1ml/min的THF作為洗脫劑估計(jì)分子量。將'H和13CNMR記錄在Bruker400-MHz核磁共振(NMR)光譜儀上。利用對(duì)于醛類非常特異性的和敏感的并且產(chǎn)生紫色至紫紅色顯色的6-mercatriazolo-[4，3-b]-s-四嗪的4-氨基-3-肼基-5-巰基-l，2，4-三唑(PURPALDTM)定量地評(píng)價(jià)未反應(yīng)的PEG-CHO的醛部分。3U2將100pl的樣品溶液滴入3ml的PURPALDtm溶液(7.5mg/ml1NNaOH)中。在室溫下充氣以后，利用UV-VIS分光計(jì)在545nm記錄溶液的最大吸收(JASCOV-510UV/VIS/NIR分光計(jì)，日本)。因?yàn)镻URPALDTM對(duì)即使少量存在于空氣中的醛也是敏感的，并且因此產(chǎn)生顯色反應(yīng)，測(cè)量空氣中的陰性對(duì)照并從所述值減去。利用PEG-CHO標(biāo)準(zhǔn)曲線確定未反應(yīng)的PEG-CHO。將這個(gè)PURPALDM測(cè)定的結(jié)果與NMR測(cè)量的結(jié)果相比。用Folin-Ciocalteu測(cè)定法和香草醛-HCl測(cè)定法評(píng)價(jià)結(jié)合物的酚含量。Folin-Ciocalteu測(cè)定法已經(jīng)由許多研究者用于總酚類測(cè)定(Julkunen畫tiittoR.J.Agric.FoodChem.33,21-217(1985))。將15pl的樣品加入到300pl水中。加入150jxl的Folin-Ciocalteu酚試劑并將所述溶液劇烈振蕩。立即加入750^的20%碳酸鈉溶液并將所述混合物用水補(bǔ)足至1.5ml，接著再次振蕩。在20min后，利用UV-VIS分光計(jì)在720nm讀取混合物的吸收率。香草醛-HCl法已經(jīng)用于兒茶素和濃縮鞣質(zhì)測(cè)定(BroadhurstR.B.和JonesW.T.J.Sci.FoodAfric.29，788-794(1978))。對(duì)于該測(cè)定，將100^1的樣品加入到1ml甲醇中的4%香草醛中并將混合物劇烈振蕩。然后加入0.5ml的濃HC1，并且立即將混合物再次振蕩。將所述混合物在室溫下保持20min以后在500nm讀取吸收率。利用以同樣方式測(cè)量的EGCG標(biāo)準(zhǔn)曲線確定利用這兩種測(cè)定的合成化合物的酚含量。每個(gè)測(cè)量一式三份進(jìn)行。用DSCQ100TAInstruments測(cè)量產(chǎn)物的熔化溫度(Tm)。所述測(cè)量利用銦校準(zhǔn)，并且在氮?dú)獯祾呦乱?0°C/min的掃描速率在-40至200'C的溫度進(jìn)行。在25°C用ZetaPALSZetaPotentialAnalyzer(BROOKHAVENINSTRUMENTSCo.)測(cè)量樣品溶液的S-電勢(shì)。每個(gè)測(cè)量一式三份進(jìn)行。聚乙二醇和(-)-表焙兒茶素格酸酯或寡聚(-)-表焙兒茶素掊酸酯之間的醛-介導(dǎo)結(jié)合在該研究中，通過酸催化劑利用醛介導(dǎo)的縮合進(jìn)行聚乙二醇(PEG)與EGCG或寡聚EGCG(OEGCG)的結(jié)合。OEGCG的合成總結(jié)在表1中。在不同反應(yīng)條件下用過量乙醛進(jìn)行所述反應(yīng)。在用透析(MWC(^1000)純化以后，獲得了具有數(shù)千分子量的寡聚體。在乙?；院笥肧EC測(cè)量分子量，因?yàn)樵贓GCG單元和SEC柱上存在的許多羥基之間的相互作用導(dǎo)致較低的分子量估算。分子量和收率都沒有受反應(yīng)時(shí)間的影響，但是非常受溶劑和反應(yīng)氣氛的影響在二甲亞砜(DMSO)和水混合物中分子量和收率都比乙醇和水混合物中高，即使溶劑混合物中水量的增加減少分子量和收率。N2氣氛中的反應(yīng)產(chǎn)生更高的分子量和收率，大概由于空氣中的02終止EGCG的寡聚。得到的寡聚體也可溶于EGCG的良好溶劑，諸如DMSO、N，N-二甲基甲酰胺、丙酮、乙醇、甲醇、四氫呋喃和除水以外的堿性水溶液，并且不溶于其中都不是EGCG的氯仿和己烷。產(chǎn)物的H和"CNMR分析顯示在乙醛存在下的EGCG縮合提供在間苯三酚環(huán)(A環(huán))的C6和C8位通過CH-CH3橋接連接的EGCG寡聚體(圖1)。由于A環(huán)的H6和H8在S^5.83和5.93觀察到的單峰在寡聚以后消失，并且由于CH-CH3橋接的甲基和次甲基質(zhì)子產(chǎn)生的新的峰分別出現(xiàn)在5'H1.48和5.08(513C21.2和16.2)。與EGCG的峰相比，全部OEGCG的峰展寬并且具有更低的強(qiáng)度。PEG與EGCG和OEGCG的結(jié)合物分別總結(jié)在表2和表3中。在進(jìn)行PEG-EGCG結(jié)合以后，將未反應(yīng)的EGCG通過透析除去(MWCO=3.5X103)。為了完全消耗PEG-CHO，將過量的EGCG進(jìn)料到反應(yīng)器中。當(dāng)在N;j氣氛中以比PEG-CHO的摩爾量大20倍的摩爾量進(jìn)料EGCG時(shí)，如用NMR(S9.65(s，CHO))和利用PURPALDTM分光光度法測(cè)定法分析顯示所述產(chǎn)物不含未反應(yīng)的PEG-CH03。即使EGCG對(duì)于醛在C6和C8位具有兩個(gè)可用的連接位置，結(jié)合物的分子量顯示僅PEG-CHO的一個(gè)鏈結(jié)合到EGCG(表2)。這可能是由于單一的PEG鏈在A環(huán)的C6和C8位任何一個(gè)的結(jié)合以后的位阻。然而，當(dāng)用比OEGCG的摩爾量大10倍的摩爾量進(jìn)料PEG-CHO時(shí)，獲得了雙-和三-嵌段的結(jié)合物(PEG-OEGCG和PEG-OEGCG-PEG)這兩者的PEG-OEGCG結(jié)合物(表3)。通過用相同摩爾比的OEGCG和PEG-CHO進(jìn)料，所述結(jié)合僅產(chǎn)生雙-嵌段結(jié)合物而不產(chǎn)生三-嵌段的結(jié)合物。如上述EGCG寡聚的情況中，在DMSO和Nz氣氛中的反應(yīng)產(chǎn)生高收率。包括具有Mn=10000的長(zhǎng)鏈PEG的全部PEG-OEGCG結(jié)合物不是水溶性的，而全部PEG-EGCG結(jié)合物是水溶性的。在用相對(duì)于甲醇的透析除去未反應(yīng)的OEGCG以后，通過離心不透明水溶液分離PEG-OEGCG。NMR分析顯示上清液是未反應(yīng)的PEG-CHO而沉淀是PEG-OEGCG結(jié)合物。PEG-EGCG結(jié)合物的&和13CNMR光譜顯示全部固有峰屬于PEG和EGCG,并且PEG-OEGCG光譜對(duì)于包括CHCH3橋接的OEGCG以及對(duì)于PEG也顯示展寬的峰(圖1)。結(jié)合物的酚測(cè)定利用植物材料中普遍用于酚定量的香草醛和Folin-Ciocalteau測(cè)定評(píng)價(jià)PEG-EGCG和PEG-OEGCG結(jié)合物的EGCG部分含量。Folin-Ciocalteau測(cè)定是用于檢測(cè)蛋白質(zhì)的酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸殘基的蛋白質(zhì)測(cè)定方法。(FolinO.和CiocalteuU.J.Biol.Chem.73,62-650(1927))。該測(cè)定對(duì)于酚基團(tuán)是非特異性的并且也與脲、殼聚糖和鳥嘌呤反應(yīng)而產(chǎn)生深藍(lán)色化合物。香草醛-濃HCl測(cè)定(BroadhurstR.B.andJo加sW.T.J.SciFoodAfric.29，788-794(1978))經(jīng)常用于檢測(cè)兒茶素和矢車菊苷配基(濃縮鞣質(zhì))。利用EGCG制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。兩者測(cè)定中測(cè)試的全部標(biāo)準(zhǔn)物都顯示吸收率和分別在Folin-Ciocalteau的125yM至4mM和香草醛測(cè)定的62.5UM至2mM范圍內(nèi)變化的標(biāo)準(zhǔn)物濃度之間的線性關(guān)系。PEG-EGCG和PEG-OEGCG溶液的香草醛測(cè)定是完全可重現(xiàn)的并且給出與基于它們的分子量計(jì)算的濃度幾乎相同的量。然而，對(duì)于PEG-EGCG和PEG-OEGCG，F(xiàn)olin-Ciocalteau測(cè)定分別產(chǎn)生比基于分子量計(jì)算的濃度高48.3±18.9%和126.5±43.2%的濃度。光學(xué)性質(zhì)圖3描述OEGCG、PEG-EGCG和PEG-OEGCG的UV-VIS光譜。以類似于前體的方式表征這些化合物。EGCG在280nm顯示最大吸收，表明保持原始的黃烷骨架。另外，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)利用酶催化劑通過氧化偶合聚合的(+)-兒茶素除在280nm之外還在388nm顯示最大吸收，產(chǎn)生復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，而通過CH-CH3橋接縮合的(+)-兒茶素僅在280nm顯示最大吸收。因此，認(rèn)為本發(fā)明的OEGCG、PEG-EGCG和PEG-OEGCG的UV-VIS光譜是它們的由如上所述的NMR顯示的結(jié)構(gòu)的另外證據(jù)。熱性質(zhì)OEGCG、PEG-EGCG和PEGC-OEGCG的熱性質(zhì)用DSC測(cè)量表征(圖4)。分別在62.0和150.5'C觀察到對(duì)應(yīng)于PEG和EGCG的熔點(diǎn)(Tm)的吸熱峰。與EGCG相比，OEGCG顯示移動(dòng)至更低溫度的展寬Tm峰，反映了結(jié)晶度的減小。PEG-EGCG和PEG-OEGCG的DSC熱分析圖具有對(duì)應(yīng)于PEG和EGCG或OEGCG的雙峰。源自PEG的Tm也移動(dòng)至更低的溫度并且熔化中的PEG的熱容(△H)變小，當(dāng)分別與EGCG和OEGCG結(jié)合時(shí)減少26%和73%。這些數(shù)據(jù)表明如所描述發(fā)生結(jié)合和寡聚。C-電勢(shì)在PBS中測(cè)量寡聚體和結(jié)合物的C-電勢(shì)(圖5)。PEG和EGCG顯示具有類似值的稍微負(fù)的表面電荷，并且與EGCG相比，PEG-EGCG結(jié)合物顯示沒有電荷差異。另一方面，OEGCG比EGCG顯示更多負(fù)電荷，并且OEGCG與PEG的結(jié)合物產(chǎn)生比PEG-EGCG和OEGCG顯然更強(qiáng)的負(fù)電荷。實(shí)施例2:通過寡聚和與PEG結(jié)合的(-)-表焙兒茶素掊酸酯的生理活性增加材料(-)-表焙兒茶素掊酸酯(EGCG)購(gòu)自KURITALTD.，日本。醛封端的聚乙二醇(PEG-CHO)購(gòu)自NOFCo.，日本。乙酸、乙醛、二甲亞砜-d6、U-二苯基-2-苦基-偕腙肼(DPPH)、黃嘌呤、黃嘌呤氧化酶(XO)、氮藍(lán)四唑(NBT)、2-氨基-2-羥甲基-l，3-丙二醇(Tris)和聚乙二醇(PEG)8000購(gòu)自Sigma-Aldrich。尿激酶(uPA)和SPECTROZYMEUK購(gòu)自AmericanDiagnosticalnc。其它試劑和溶劑是商購(gòu)的并且原樣使用。OEGCG、PEG-EGCG或PEG-OEGCG的合成如上所述合成寡聚EGCG(OEGCG)和聚(乙二醇)與EGCG(PEG-EGCG)或OEGCG(PEG-OEGCG)的結(jié)合物。對(duì)于OEGCG合成，將EGCG溶解在乙酸/水/DMSO的混合物中。通過添加乙醛啟動(dòng)反應(yīng)并且在氮?dú)鈿夥障略?0*€0>112.3)進(jìn)行24小時(shí)。在室溫下將得到的產(chǎn)物相對(duì)于1000倍體積的甲醇透析(分子量截止值1X10"兩天，然后凍干殘留溶液而得到OEGCG。對(duì)于結(jié)合物的合成，將PEG-CHOs和EGCG或OEGCG單獨(dú)溶解在乙酸/水/DMSO的混合物中。通過逐滴添加PEG-CHO溶液?jiǎn)?dòng)所述反應(yīng)并在氮?dú)鈿夥障略?0'C(pH2.9)進(jìn)行24小時(shí)。以上述相同方式透析得到的產(chǎn)物(分子量截止值3.5X103)。通過冷凍干燥透析的殘留溶液而獲得PEG-EGCG和結(jié)合物。在透析(分子量截止值5000)以前通過離心(rpn^3.5X10"沉淀PEG-OEGCG結(jié)合物并且然后凍干。在乙酰化以后，用WatersStyragelHR4E/HR5E柱利用THF作為洗脫液以1ml/min的流速在40'C通過尺寸排阻色譜法(裝有RI-2410檢測(cè)器的Waters26卯，聚苯乙烯標(biāo)準(zhǔn)物)評(píng)估分子量。在Bruker400-MHz核磁共振(NMR)光譜儀上記錄^和13CNMR。二苯基-苦基-偕腙肼清除活性將不同量的樣品與化學(xué)穩(wěn)定的游離自由基1，l-二苯基-2-苦基-偕腙肼(DPPH)溶液混合，并且在25'C利用UV-可見分光光度計(jì)(JASCOV-510UV/VIS/NIR分光計(jì)，日本)將519nm的吸光度連續(xù)記錄30min。全部分析運(yùn)行一式三份并且平均所述結(jié)果。超氧化物陰離子清除活性利用黃嘌呤和黃嘌呤氧化酶(XO)產(chǎn)生超氧化物陰離子，并且用氮藍(lán)四唑(NBT)還原法測(cè)量。在25'C將試樣在含有黃嘌呤和NBT的緩沖溶液(pH7.0)中混合。隨著添加XO開始測(cè)量。利用UV-可見分光光度計(jì)在25'C在560nm將超氧化物陰離子產(chǎn)生用分光光度法監(jiān)視10min。全部分析運(yùn)行一式三份并且平均所述結(jié)果。根據(jù)下式計(jì)算超氧化物清除活性吸光度對(duì)iB-吸光度樣a，_超氧化物清除活性(％)=吸光度對(duì)照黃嘌呤氧化酶抑制活性通過利用UV-可見分光計(jì)在295nm將尿酸的形成監(jiān)控30min而用分光光度法測(cè)量XO的活性。在與超氧化物陰離子測(cè)定的相同條件下進(jìn)行測(cè)定，并且計(jì)算百分比活性。uPA抑制活性在緩沖溶液中將不同量的樣品與uPA混合，并在37'C溫育15min。用SPECTROZYME添加所述混合物溶液并利用微板閱讀器在405nm記錄10min。結(jié)果通過上述醛介導(dǎo)的縮合合成寡聚的(-)-表焙兒茶素掊酸酯(OEGCG)和聚(乙二醇)與EGCG(PEG-EGCG)或寡聚體(PEG-OEGCG)的結(jié)合物。在乙?；院笥贸叽缗抛枭V法對(duì)于OEGCG、PEG-EGCG、和PEG-OEGCG估計(jì)的分子量分別是Mw=4000,Mw/Mn=1.2:M『7卯0，Mw/Mn=1.2;和M『10100，Mw/Mn-1.1。二苯基-苦基-偕腙肼清除活性和超氧化物陰離子清除活性測(cè)量氫原子給予活性的1,l-二苯基-2-苦基-偕腙肼根(DPPH)測(cè)定提供由于自由基清除產(chǎn)生的抗氧化劑活性的評(píng)價(jià)。DPPH，一種紫色的穩(wěn)定自由基，被還原成黃色的二苯基苦基肼，因?yàn)橥ㄟ^氫給予的抗氧化劑清除所述自由基。能夠DPPH清除的化合物在519nm顯示降低的吸光度，作為自由基清除活性的指示。在OEGCG、PEG-EGCG和PEG-OEGCG的全部情況下，樣品溶液的添加顯示519nm處顯著降低的最大吸光度(圖6)。樣品的DPPI-l清除活性由IC5o(需要將DPPH清除50。/。的濃度)表示，如表4中所示。與對(duì)于完好的EGCG所觀察的ICso相比，OEGCG、PEG-EGCG和PEG-OEGCG的濃度依賴的自由基清除活性是增強(qiáng)的。這些活性也比商業(yè)抗氧化劑維生素C和二丁基羥基甲苯(BHT)的活性更高。黃嘌呤和XO的混合物產(chǎn)生還原氮藍(lán)四唑(NBT)的過氧化物陰離子，得到藍(lán)色生色團(tuán)甲腥并且增加560nm的UV吸光度。能清除過氧化物陰離子的化合物，諸如過氧化物歧化酶(SOD)，抑制NBT還原。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，相比于具有較低IC5o(需要將過氧化物陰離子清除50%)的完好EGCG所觀察到的活性，在PEG-EGCG、PEG-OEGCG和OEGCG的情況下，濃度依賴的類似SOD的活性增加，表明這些化合物對(duì)于過氧化物陰離子比未改性的EGCG是更有效力的清除劑。因?yàn)槟芮宄^氧化物陰離子的化合物還可以影響NBT還原，所以研究樣品對(duì)于這些過程的效果。對(duì)照實(shí)驗(yàn)揭示所述樣品在測(cè)試濃度范圍內(nèi)不直接減少NBT。對(duì)于DPPH和過氧化物陰離子的清除活性的評(píng)價(jià)提供那些化合物自由基清除電勢(shì)的直接證據(jù)。DPPH和過氧化物陰離子測(cè)定結(jié)果顯示抗氧化劑活性在EGCG單元-基礎(chǔ)上由寡聚和/或EGCG的PEG結(jié)合而放大。這些結(jié)果意味著任何寡聚體和結(jié)合物(OEGCG、PEG-EGCG或PEG-OEGCG)的單一構(gòu)成EGCG單元具有比非改性形式中的單獨(dú)一個(gè)EGCG單元更有效力的清除活性。黃嘌呤氧化酶抑制活性XO不僅是反應(yīng)性氧種類的重要生物來源而且是擔(dān)負(fù)關(guān)節(jié)中與導(dǎo)致疼痛炎癥的痛風(fēng)有關(guān)的尿酸形成的酶(McCordJ.M.和FridovichI.J.Biol.Chem.1968，243,5753;ChiangH.C,LoY.J.和LuF.J.J:EnzymeInhibition1994，8，61)。圖7顯示通過評(píng)價(jià)從XO形成的尿酸而確定XO抑制活性。以濃度依賴方式，全部OEGCG、PEG-EGCG和PEG-OEGCG顯示比別嘌呤醇更高的抑制活性，所述別嘌呤醇是用于痛風(fēng)治療而經(jīng)常使用的商業(yè)抑制劑(FeherM.D.,等Rhermatology42,321(2003))。相反，EGCG顯示較低的抑制活性，即在測(cè)試濃度范圍上小于約5%抑制。對(duì)于PEG-OEGCG、OEGCG、PEG-EGCG、和別嘌呤醇，以及EGCG，利用10UM樣品測(cè)量的抑制活性分別是IOO、89.3、30.7、22.6、和1.2%。因?yàn)槟芤种芚O的化合物還可以正面影響清除過氧化物自由基的活性，XO抑制活性可以部分有助于表4中顯示的結(jié)果。然而，在測(cè)試濃度范圍中XO抑制活性比過氧化物自由基清除活性更低。因此，OEGCG和那些結(jié)合物對(duì)于過氧化物陰離子清除的更大抑制效果出現(xiàn)，主要是由過氧化物自由基清除而不是XO抑制引起的。這些結(jié)果表明，與未改性的EGCG相比較，EGCG寡聚體和PEG結(jié)合物對(duì)于過氧化物陰離子清除和XO抑制都具有更高的電勢(shì)。uPA抑制活性人癌癥需要蛋白水解酶以侵入細(xì)胞并形成轉(zhuǎn)移。這些酶的一種是尿激酶(uPA)。在小鼠中uPA的抑制可以減少腫瘤尺寸或者甚至引起癌癥完全好轉(zhuǎn)。已知的uPA抑制劑不太可能用于抗癌治療，由于它們的弱抑制活性或高毒性。表明EGCG結(jié)合至uPA，封閉uPA催化三聯(lián)體的His57和Serl95并且從正電荷的uPA環(huán)對(duì)著Arg35延伸。這樣的EGCG局部化將干擾uPA識(shí)別它的底物并且抑制酶活性的能力。在測(cè)試濃度范圍內(nèi)，EGCG顯示非常低的uPA抑制活性(圖8)。然而，在EGCG單元的濃度依賴方式中，OEGCG、PEG-EGCG和PEG-OEGCG顯示更髙的抑制活性。實(shí)施例3:OEGCG和PEG-EGCG的膠束納米絡(luò)合物材料(-)-表焙兒茶素格酸酯(EGCG)購(gòu)自KURITALTD.，日本。醛-封端的聚乙二醇(PEG-CHO)購(gòu)自NOFCo.,日本。乙酸、乙醛、牛血清清蛋白(BSA)、異硫氰酸熒光素牛清蛋白(FITC-BA)、PURPALD和香草醛購(gòu)自Sigma-Aldrich。其它試劑和溶劑是市場(chǎng)上可買到的并且原樣使用。OEGCG、PEGCG和POEGCG的合成如上合成寡聚EGCG(OEGCG)和聚(乙二醇)與EGCG的結(jié)合物(PEG-EGCG)。對(duì)于OEGCG的合成，將EGCG溶解在乙酸/水/DMSO的混合物中。通過添加乙醛啟動(dòng)反應(yīng)并且在氮?dú)鈿夥障略?0'C(pH2.3)進(jìn)行24小時(shí)。在室溫下將得到的產(chǎn)物相對(duì)于1000倍體積的甲醇透析(分子量截止值1X103)兩天，然后凍干殘留溶液而得到OEGCG。對(duì)于結(jié)合物的合成，將PEG-CHOs和EGCG單獨(dú)溶解在乙酸/7jC/DMSO的混合物中。通過逐滴添加PEG-CHO溶液?jiǎn)?dòng)所述反應(yīng)并且在氮?dú)鈿夥障略?0'C(pH2.9)進(jìn)行24小時(shí)。以上述相同方式透析得到的產(chǎn)物(分子量截止值3.5X103)。通過冷凍干燥透析的殘留溶液而獲得PEG-EGCG和結(jié)合物。在乙?；院螅ㄟ^用WatersStyragelHR4E/HR5E柱的尺寸排阻色譜法(裝有RI-2410檢測(cè)器的Waters2690，聚苯乙烯標(biāo)準(zhǔn)物)利用THF作為洗脫液以1ml/min的流速在40。C估計(jì)所述分子量(分別對(duì)于OEGCG和PEG-EGCG，Mw=4000;Mw/Mn=1.2和Mw^7卯0;Mw/Mn=1.2)。寡聚(-)-表焙兒茶素掊酸酯與蛋白質(zhì)或DNA的相互作用將DMSO或甲醇中的10liMOEGCG儲(chǔ)備溶液以多種終濃度(0-0.14mg/ml)加入到2ml具有多種濃度(0-100mg/ml)的PBS中的BSA溶液。在通過自發(fā)自組裝的混合以后，OEGCG和蛋白質(zhì)的絡(luò)合物立即形成。利用顆粒分析儀(ZetaPALS,BROOKHAVENINSTRUMENTSCo.)將絡(luò)合物的尺寸在指示的時(shí)間測(cè)量2天。以相同方式觀察DNA與OEGCG的絡(luò)合物的形成。利用；電勢(shì)分析儀(ZetaPALS，BROOKHAVENINSTRUMENTSCo.)在25'C測(cè)量樣品溶液的C-電勢(shì)。每個(gè)測(cè)量運(yùn)行一式三份。膠束納米絡(luò)合物載體形成和表征將以多種濃度制備的在DMSO中的50u1PEG-EGCG溶液加入到OEGCG/BSA絡(luò)合物溶液以形成膠束納米絡(luò)合物(MNC)載體。利用超濾膜(分子截止值=200000)將MNC溶液超濾三次以除去過量的未參與MNG的flavonoic化合物和蛋白質(zhì)。在25'C，利用顆粒分析儀和C電勢(shì)分析儀分別測(cè)量MNC的尺寸和4-電勢(shì)。用香草醛-HCl測(cè)定評(píng)價(jià)MNC的酚含量。將100li1的樣品加入到1ml甲醇中的4%香草醛溶液并且將混合物劇烈振蕩。然后添加0.5ml的濃HC1，并且將所述混合物立即再次振蕩。在將混合物在室溫下保溫20min以后，在500nm讀取吸收率。利用以相同方式測(cè)量的EGCG標(biāo)準(zhǔn)曲線確定酚含量；每個(gè)測(cè)量運(yùn)行一式三份。為了確定MNC載體中負(fù)荷的蛋白質(zhì)的量，以上述相同方式將FITC-BA負(fù)荷的MNC制造在10mMTris(pH7.0)中并且利用分光熒光計(jì)測(cè)量熒光強(qiáng)度。將激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別設(shè)定在491nm和519nm。通過用負(fù)荷蛋白質(zhì)的質(zhì)量除以進(jìn)料蛋白質(zhì)的初始質(zhì)量而確定蛋白質(zhì)的負(fù)荷效率。將負(fù)荷蛋白質(zhì)的量表示為通過用負(fù)荷蛋白質(zhì)質(zhì)量除以凍干MNC的質(zhì)量而確定的百分比。利用透射電子顯微鏡(TEM)(FEITecnaiG2F20S-Twin)在200kV觀察MNC的形態(tài)。將用0.001mg/ml的磷鴿酸染色的100y1的MNC溶液固定在涂有碳膜的銅網(wǎng)上并在室溫下干燥過夜。結(jié)果在該實(shí)驗(yàn)中，根據(jù)絡(luò)合物的尺寸表征寡聚EGCG(OEGCG)與BSA的絡(luò)合物形成(圖9)。當(dāng)將OEGCG加入到BSA溶液時(shí)，由于絡(luò)合物形成，所述混合物中的顆粒尺寸立即增加。在恒定的BSA濃度，絡(luò)合物尺寸隨著遞增的OEGCG濃度而增加，而隨著在測(cè)試濃度范圍內(nèi)的EGCG添加未觀察到尺寸增加。隨著BSA濃度改變，絡(luò)合物尺寸增加直到最大尺寸，在所述點(diǎn)之后絡(luò)合物尺寸隨著遞增的BSA濃度降低。這些結(jié)果表明，作為蛋白質(zhì)分子的絡(luò)合物形式被OEGCG分子結(jié)合(BaxterN.J"等.Biocehmistry,36,5566-5577(1997);SiebertK.J"等.J.Agric.FoodChem.44,80-85(1996))。因此，當(dāng)BSA濃度小于臨界量時(shí)，OEGCG過量存在，容許形成更大的顆粒。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)濃度高時(shí)，絡(luò)合物形成限于較小的尺寸，導(dǎo)致更少的OEGCG分子可用于形成多個(gè)蛋白質(zhì)分子之間的橋接。將所述絡(luò)合物觀察超過2天是穩(wěn)定的。接著將PEG-EGCG加入到具有遞增濃度的OEGCG/BSA絡(luò)合物溶液并觀察得到的絡(luò)合物尺寸(圖10)。最初選擇具有不同濃度OEGCG和BSA的兩種組合以獲得直徑約為30nm的OEGCG/BSA絡(luò)合物。在某一PEG-EGCG濃度之上尺寸快速增加并且終止在約80nm，表明通過圍繞OEGCG/蛋白質(zhì)絡(luò)合物組裝的PEG-EGCG形成膠束納米絡(luò)合物(MNC)。對(duì)于更低的BSA濃度，與對(duì)于更高濃度BSA所需的量相比，需要形成膠束的PEG-EGCG量是相對(duì)較小的。絡(luò)合物的4-電勢(shì)測(cè)量也表明MNC形成(圖11)。OEGCG/BSA絡(luò)合物的表面電荷顯示比單獨(dú)的BSA或OEGCG任一種更多的負(fù)電荷。然而，在將PEG-EGCG加入到OEGCG/BSA絡(luò)合物以后，所述絡(luò)合物具有與單獨(dú)的PEG相同的表面電荷，表明所述膠束結(jié)構(gòu)由PEG鏈圍繞。在沒有OEGCG時(shí)，通過PEG-EGCG的EGCG部分和BSA之間的自組裝，PEG-EGCG仍與BSA單獨(dú)形成膠束絡(luò)合物(圖12)。同樣，EGCG部分的疏水性相互作用能驅(qū)動(dòng)PEG-EGCG自身之間的自組裝并且在水溶液中形成膠束。然而，當(dāng)另外添加蛋白質(zhì)時(shí)，沒有OEGCG的組裝都不足夠穩(wěn)定并且顯示尺寸的嚴(yán)重減少，表明膠束離解。相反，由PEG-EGCG和OEGCG/BSA形成的絡(luò)合物在另外添加蛋白質(zhì)時(shí)不顯示尺寸改變，很可能由于通過強(qiáng)疏水性和氫鍵相互作用而產(chǎn)生的納米絡(luò)合物結(jié)構(gòu)的OEGCG穩(wěn)定。為了估計(jì)納米絡(luò)合物中負(fù)荷的蛋白質(zhì)的量，制造并測(cè)量FITC-BA負(fù)荷的膠束。負(fù)荷的蛋白質(zhì)的量是39.3%并且負(fù)荷效率是60.9%。另外，利用香草醛-HCl方法確定一起負(fù)荷的類黃酮的量。當(dāng)香草醛測(cè)定用于確定OEGCG、PEG-EGCG和PEG-OEGCG中的EGCG單元時(shí)，結(jié)果是完全可重現(xiàn)的并且得到幾乎與基于它們的分子量計(jì)算的量相同的量。香草醛-HCl測(cè)定顯示58.5%的類黃酮負(fù)荷量與7.3%的負(fù)荷效率。納米絡(luò)合物的光散射分析顯示約80nm的單分散性粒度(圖13B)。TEM圖像顯示納米絡(luò)合物的球形緊密形狀，顯示所述納米絡(luò)合物與用光散射觀察的尺寸具有良好一致性(圖13A)。圖14顯示OEGCG也與DNA形成絡(luò)合物。用光散射測(cè)量的絡(luò)合物尺寸隨著OEGCG的EGCG單元的濃度增加而增加。沒有觀察到未改性的EGCG與DNA在測(cè)試濃度范圍內(nèi)形成絡(luò)合物。實(shí)施例4:PEG-OEGCG膠束納米絡(luò)合物的形成材料(-)-表焙兒茶素掊酸酯(EGCG)購(gòu)自KURITALTD.，日本。醛-封端的聚乙二醇(PEG-CHO)購(gòu)自NOFCo.，日本。乙酸、乙醛、牛血清清蛋白(BSA)購(gòu)自Sigma-Aldrich。其它試劑和溶劑是市場(chǎng)上可買到的并且原樣使用。OEGCG、PEG-EGCG和PEG-OEGCG的合成如上合成寡聚EGCG(OEGCG)和聚(乙二醇)與EGCG的結(jié)合物(PEG-EGCG)。對(duì)于OEGCG的合成，將EGCG溶解在乙酸/水/DMSO的混合物中。通過添加乙醛啟動(dòng)反應(yīng)并且在氮?dú)鈿夥障略?0'C(pH2.3)進(jìn)行24小時(shí)。在室溫下將得到的產(chǎn)物相對(duì)于1000倍體積的甲醇透析(分子量截止值1X103)兩天，然后凍干殘留溶液而得到OEGCG。對(duì)于結(jié)合物的合成，將PEG-CHO和EGCG或OEGCG單獨(dú)溶解在乙酸/水/DMSO的混合物中。通過逐滴添加PEG-CHO溶液?jiǎn)?dòng)所述反應(yīng)并且在氮?dú)鈿夥障略?0'C(pH2.9)進(jìn)行24小時(shí)。以上述相同方式透析得到的產(chǎn)物(分子量截止值3.5X103)。通過將透析的殘留溶液冷凍干燥而獲得PEG-EGCG和結(jié)合物。在透析(分子量截止值5000)以前通過離心(rpm-3.5X10"沉淀PEG-OEGCG結(jié)合物，然后凍干。在乙?；院?，通過用WatersStyragelHR4E/HR5E柱的尺寸排阻色譜法(裝有RI-2410檢測(cè)器的Waters26卯，聚苯乙烯標(biāo)準(zhǔn)物)估計(jì)分子量，在40'C利用THF作為洗脫液，流速為1ml/min。(對(duì)于OEGCG、PEG-EGCG、和PEG-OEGCG，分別為，Mw=4000,Mw/Mn=1.2;Mw=7^0,Mw/Mn=1.2;和Mw=10100，Mw/Mn=l.l)。膠束納米絡(luò)合物載體的形成將以多種濃度制備的DMSO中的50y1PEG-EGCG溶液加入到BSA、EGCG、OEGCG和OEGCG-BSA絡(luò)合物溶液以形成膠束納米絡(luò)合物(MNC)載體。利用超濾膜(分子截止值=200000，ADVANTEC)將MNC溶液超濾三次以除去過量的未絡(luò)合的flavonoic化合物和蛋白質(zhì)。在25°C利用顆粒分析儀(ZetaPALS,BROOKHAVENINSTRUMENTSCo.)測(cè)量MNC的尺寸。29結(jié)果當(dāng)PEG-EGCG加入到預(yù)先形成的OEGCG蛋白質(zhì)絡(luò)合物時(shí)，PEG-EGCG圍繞絡(luò)合物自發(fā)組裝并形成膠束絡(luò)合物(MNC),絡(luò)合物尺寸約為100nm。有趣的是，如果在與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物以前將PEG-EGCG直接加入到OEGCG，形成尺寸約為500nm的不可溶光霧狀絡(luò)合物(圖15)。這可能是由于OEGCG與PEG鏈的強(qiáng)絡(luò)合物形成。在添加OEGCG和未改性的PEG時(shí)觀察到類似的現(xiàn)象，表明OEGCG和PEG鏈之間存在強(qiáng)相互作用。當(dāng)PEG-OEGCG添如到蛋白質(zhì)時(shí)，形成大的絡(luò)合物，絡(luò)合物尺寸為800nm以上(圖16)。該絡(luò)合物可以由結(jié)合物分子的PEG節(jié)段和OEGCG節(jié)段之間以及結(jié)合物和蛋白質(zhì)之間的分子內(nèi)和分子間絡(luò)合作用產(chǎn)生。不像在PEG-EGCG體系中，將PEG-OEGCG添加到預(yù)先形成的OEGCG-蛋白質(zhì)絡(luò)合物同樣產(chǎn)生大的絡(luò)合物，即使在添加PEG-OEGCG時(shí)尺寸稍微降低。這些巨大的絡(luò)合物對(duì)于物理破碎能量如超聲破碎是穩(wěn)定的。然而，PEG-OEGCG的強(qiáng)絡(luò)合作用顯著地受介質(zhì)中pH和離子強(qiáng)度的影響。圖17顯示當(dāng)pH沿箭頭方向改變時(shí)PEG-OEGCG絡(luò)合物的可逆性尺寸改變。而且，在蒸餾水中，PEG-OEGCG與蛋白質(zhì)、EGCG、OEGCG、和OEGCG-蛋白質(zhì)絡(luò)合物形成可溶性絡(luò)合物，得到約100nm的尺寸(圖18)。曾經(jīng)形成在蒸餾水中的絡(luò)合物不再次顯示尺寸增加，即使將它們放回PBS中，可能因?yàn)樵谒黾{米絡(luò)合物核心內(nèi)部保護(hù)OEGCG節(jié)段。OEGCG與PEG的強(qiáng)相互作用可歸因于在酸性和含鹽溶液中這些化合物的疏水性和氫鍵作用增加。實(shí)施例5:用于藥物遞送和組織工程的可注射可生物降解的水凝膠透明質(zhì)酸-氨基乙?；┒一s醛(HA-ADD)結(jié)合物的合成)如下通過下列一般規(guī)程合成HA-AAD結(jié)合物(圖19中的(l)。將透明質(zhì)酸(HA)(lg,2.5mmol)溶解在100ml的蒸餾水中。將氨基乙酰基醛二乙基縮醛(1.2g，9mmol)加入到該溶液。通過添加0.1M的HC1將反應(yīng)混合物的pH調(diào)節(jié)至4.7。N-羥基丁二酰亞胺(0.34g,3.0mmol)和l-乙基-3-[3-(二甲基氨基)丙基]碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)(0.575g，3.0mmol)加入到所述溶液。在混合以后，將反應(yīng)的pH保持在4.7。將所述溶液在溫和的攪拌下在室溫保持24h。通過透析(分子量截止值-1000)將混合物進(jìn)行純化。透明質(zhì)酸-表焙兒茶素掊酸酯(HA-EGCG)結(jié)合物的合成將HA-EGCG結(jié)合物合成如下。將1g的HA-AAD結(jié)合物(l)溶解在60ml蒸餾水中。通過添加HC1將溶液pH調(diào)節(jié)至1。加入5ml溶解在DMSO中的EGCG溶液(0.2g/ml)。在溫和攪拌情況下，在氮?dú)鈿夥障聦⑺鋈芤涸谑覝叵卤３?4h。通過透析(分子量截止值-1000)將混合物進(jìn)行純化，產(chǎn)生如圖20所示的HA-EGCG結(jié)合物。水凝膠合成和來自所述水凝膠的BSA釋放通過在由隔離物分開的兩個(gè)玻璃板之間注入HA，Tyr、含有FITC標(biāo)記的牛血清白蛋白(BSA)的HA-Tyr-EGCG、辣根過氧化酶(HRP)和H202的溶液混合物而制備厚片形狀的水凝膠。在反應(yīng)完成以后，將得到的水凝膠放在50ml的PBS中并通過測(cè)量FITC-BSA的熒光強(qiáng)度檢驗(yàn)BSA從水凝膠的釋放。與沒有兒茶素基類黃酮的HA-Tyr相比，含有EGCG或兒茶素的水凝膠顯示較少的釋放BSA(分別地，圖22A和圖22B)。這可能是由于疏水性相互作用，如BSA中的脯氨酸側(cè)鏈和結(jié)合物中EGCG或兒茶素部分之間的Jl-3!堆積。由此，從含有兒茶素基類黃酮的水凝膠的蛋白質(zhì)釋放可以是更慢的，并且將在身體內(nèi)具有更長(zhǎng)的半衰期。利用上述沒有任何三胺(tiramine)含量的HA-EGCG結(jié)合物(或另一個(gè)HA-兒茶素基類黃酮結(jié)合物諸如HA-兒茶素)也可以制備水凝膠。在圖22中，所述水凝膠包含多種重量％的兒茶素基類黃酮成。例如，HA-Tyr-EGCG40包含60重量％的HA-Tyr和40重量％的HA-Tyr-EGCG。HA-EGCG結(jié)合物的黃嘌呤氧化酶抑制和過氧化物清除活性如上所述進(jìn)行這些實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示在圖23A和圖23B中。在這些圖中，結(jié)合的兒茶素基類黃酮對(duì)于HA重復(fù)單元的比例顯示在每個(gè)結(jié)合物的名稱中。例如，HA-6.8-EGCG指的是EGCG對(duì)于HA重復(fù)單元的結(jié)合程度是6.8%。HA-EGCG結(jié)合物的尿激酶抑制如上所述進(jìn)行這些實(shí)驗(yàn)。所述結(jié)果顯示在圖24中。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，對(duì)于描述于此的例舉性實(shí)施方案的許多修改是可能的。更確切地，本發(fā)明意欲包括如權(quán)利要求所限定的它的范圍之內(nèi)的全部這種修改。在這里涉及的全部文件通過參考完全結(jié)合。雖然在這里公開了本發(fā)明的多種實(shí)施方案，但是根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員的普通常識(shí)可以在本發(fā)明的范圍內(nèi)進(jìn)行許多改編和修改。這樣的修改包括本發(fā)明任何方面的已知等價(jià)物的替換，以便以基本相同方式實(shí)現(xiàn)相同的結(jié)果。除非另外限定，在這里使用的全部專業(yè)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有本發(fā)明領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的含義。<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>(0.18:0.15:0,67)wa乙酸、乙醇和H20的混合物，圓括號(hào)中是體積比，b乙酸、DMSO和H20的混合物，圓括號(hào)中是體積比，"6在乙酰化以后用SEC測(cè)量的分子量。氣氛收率MweMneMw/Mne(%)樣品EGCG乙醛摩爾比溶劑(ml)(g)(g)(EGCG:乙醛)<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>表3.PEG與寡聚EGCG的結(jié)合物的合成<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>a乙酸、乙醇和H20的混合物，圓括號(hào)中是體積比，b乙酸、DMSO和H20的混合物，圓括號(hào)中是體積比，e乙酸、乙醇、DMSO和H20的混合物，圓括號(hào)中是體積比，d在乙酰化以后用SEC測(cè)量的分子量。<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>權(quán)利要求1.一種含有游離醛和類黃酮的遞送劑的結(jié)合物，所述結(jié)合物具有結(jié)合在類黃酮A環(huán)的C6和/或C8位的遞送劑。2.權(quán)利要求1的結(jié)合物，其中所述遞送劑是聚合物并且其中所述類黃酮是兒茶素基類黃酮。3.包含權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的結(jié)合物的遞送載體。4.權(quán)利要求3的遞送載體，其中所述類黃酮是兒茶素基類黃酮即(-)-表兒茶素、(-)-表焙兒茶素、(+)-兒茶素、(-)-表兒茶素掊酸酯或(-)-表焙兒茶素掊酸酯。5.權(quán)利要求3或權(quán)利要求4的遞送載體，其中所述類黃酮是單體的。6.權(quán)利要求3或權(quán)利要求4的遞送載體，其中所述類黃酮是寡聚的。7.權(quán)利要求3至6任何一項(xiàng)的遞送載體，其中所述聚合物是醛封端的聚(乙二醇)、醛衍生化的透明質(zhì)酸、透明質(zhì)酸氨基乙?；┒一s醛結(jié)合物、醛衍生化的透明質(zhì)酸-酪胺、透明質(zhì)酸氨基乙酰基醛二乙基縮醛結(jié)合物-酪胺、環(huán)三磷腈核心苯氧甲基(甲基亞肼基)樹狀聚體或硫代磷酰核心苯氧甲基(甲基亞肼基)樹狀聚體。8.權(quán)利要求7的遞送載體，其中所述聚合物是醛封端的聚(乙二醇)并且所述遞送載體是膠束納米絡(luò)合物。9.權(quán)利要求8的遞送載體，其中所述膠束納米絡(luò)合物包含結(jié)合至寡聚兒茶素基類黃酮的醛封端聚(乙二醇)。10.權(quán)利要求8的遞送載體，其中所述膠束納米絡(luò)合物包含含有寡聚兒茶素基類黃酮的內(nèi)核和含有所述結(jié)合物的外殼，所述結(jié)合物包含結(jié)合至單體兒茶素基類黃酮的醛封端的聚(乙二醇)。11.權(quán)利要求7的遞送載體，其中所述聚合物是醛衍生化的透明質(zhì)酸、透明質(zhì)酸氨基乙酰基醛二乙基縮醛結(jié)合物、醛衍生化的透明質(zhì)酸-酪胺、透明質(zhì)酸氨基乙?；┒一s醛結(jié)合物-酪胺或其組合，并且所述遞送載體是水凝膠。12.權(quán)利要求11的遞送載體，通過與交聯(lián)劑一起注射未交聯(lián)的聚合物-類黃酮結(jié)合物而在體內(nèi)形成所述遞送載體。13.權(quán)利要求3至12任何一項(xiàng)的遞送載體，所述遞送載體還包含生物活性劑。14.權(quán)利要求13的遞送載體，其中所述生物活性劑是蛋白質(zhì)、肽、核酸、小分子、藥物、抗體、激素、酶、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、單鏈DNA、雙鏈DNA、單鏈RNA、雙鏈RNA、短發(fā)夾RNA、siRNA、抗生素、化療劑或抗高血壓劑。15.在酸存在下將具有游離醛基的遞送劑結(jié)合至類黃酮的方法，所述方法包含將所述遞送劑與所述類黃酮在酸催化劑存在下反應(yīng)。16.權(quán)利要求15的方法，其中所述游離醛基是通過在所述遞送劑上的縮醛基轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生的。17.權(quán)利要求15或權(quán)利要求16的方法，其中所述遞送劑是聚合物。18.權(quán)利要求15至17任何一項(xiàng)的方法，其中所述類黃酮是兒茶素基類黃酮。19.權(quán)利要求18的方法，其中所述兒茶素基類黃酮是(-)-表兒茶素、(-)-表焙兒茶素、(+)-兒茶素、(-)-表兒茶素掊酸酯或(-)-表焙兒茶素掊酸酯。20.權(quán)利要求18或權(quán)利要求19的方法，其中所述兒茶素基類黃酮是單體的。21.權(quán)利要求18或權(quán)利要求19的方法，其中所述兒茶素基類黃酮是寡聚的。22.權(quán)利要求17至21任何一項(xiàng)的方法，其中所述聚合物是醛封端的聚(乙二醇)、醛衍生化的透明質(zhì)酸、透明質(zhì)酸氨基乙酰基醛二乙基縮醛結(jié)合物、醛衍生化的透明質(zhì)酸-酪胺、透明質(zhì)酸氨基乙?；┒一s醛結(jié)合物-酪胺、環(huán)三磷腈核心苯氧甲基(甲基亞肼基)樹狀聚體或硫代磷酰核心苯氧甲基(甲基亞肼基)樹狀聚體。23.權(quán)利要求17至21任何一項(xiàng)的方法，其中所述聚合物是蛋白質(zhì)、肽或核酸。24.將兒茶素基類黃酮遞送至受試者的方法，所述方法包含將權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的結(jié)合物或者權(quán)利要求3至14任何一項(xiàng)的遞送載體施用至所述受試者。全文摘要本發(fā)明提供在酸催化劑存在下將含有自由醛基的聚合物與類黃酮結(jié)合的方法，以致將所述聚合物結(jié)合至類黃酮A環(huán)的C6或C8位。得到的結(jié)合物可以用于形成遞送高劑量類黃酮的遞送載體，并且也可以用作遞送另外的生物活性劑的遞送載體。文檔編號(hào)C08B37/08GK101180319SQ200680017596公開日2008年5月14日申請(qǐng)日期2006年3月7日優(yōu)先權(quán)日2005年5月20日發(fā)明者朗卓,楊儀巖,栗澤元一,鄭株潤(rùn)申請(qǐng)人:新加坡科技研究局