專利名稱：聚乙烯亞胺納米凝膠及其應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種聚乙烯亞胺納米凝膠及其在體內(nèi)外基因轉(zhuǎn)染中的應用。
背景技術(shù)：
很多疾病和癌癥已經(jīng)被證實是由單個基因的突變和缺失引起的，基因治療就是將正常基因?qū)塍w內(nèi)來彌補缺失和(或)突變基因的不足。目前，人類基因組計劃已經(jīng)完成，而后基因組計劃正在實施中。開發(fā)新功能型的基因藥物正逐漸成為世界科學研究的熱點之一，而作為基因藥物研制的一個重要環(huán)節(jié)——載體的研制和開發(fā)也吸引著越來越多的研究者。
用來介導DNA或寡聚核苷酸結(jié)合的載體主要有病毒類載體和非病毒類載體兩類。病毒類載體使用重組病毒實現(xiàn)轉(zhuǎn)染治療基因，如逆轉(zhuǎn)錄酶病毒(retroviral vectors，RV)已經(jīng)廣泛用于多種細胞組織的臨床基因治療，另外還有腺病毒載體(adenoviral vectors，AV)、單純皰疹病毒載體(herpes simplex viralvectors，HSV)，以及目前正在興起的慢病毒載體(lentiviral vectors)等。在這些病毒類載體中，有些對所能攜帶的基因片斷的長度有限制，體內(nèi)導入效率極低且無靶向性，有些存在機體變異、致癌等副作用及危險。例如美國3名接受基因治療的“氣泡兒童”綜合癥患者被診斷為白血病，因此FDA2003年1月14日宣布暫停了27項類似的以逆轉(zhuǎn)錄病毒為載體的基因治療。
傳統(tǒng)的非病毒載體，比如裸DNA、脂質(zhì)體，磷酸鈣，以及電轉(zhuǎn)移等，雖然安全，但轉(zhuǎn)導效率極低，難以獲得有意義的基因表達。而非病毒類載體中的陽離子聚合物和DNA結(jié)合形成的復合物具有低毒、低免疫反應、外源基因整合幾率低、無插入基因大小片段限制等優(yōu)點，且制備方法簡單多樣，使用方便，便于保存和檢驗，是目前基因治療載體研究的熱點。
目前國外正在研究的可作為基因轉(zhuǎn)染載體的陽離子聚合物主要有精胺(spermine)、多聚精氨酸(polyarginine)、魚精蛋白(protamine)、聚乙烯亞胺(polyethylenimine，PEI)、聚丙烯亞胺樹狀物(polypropylenimine dendrimers)、多聚胺樹狀物(polyamidoamine dendrimers)、組氨酸賴氨酸分枝狀聚合肽和殼聚糖(chitosan)等。自1995年Boussif等(O.Boussif，F(xiàn).Lezoualc’h，M.A.Zanta，M.D.Merbny，D.Scherman，B.Demeneix，J.P.Behr，A versatile vector for gene andoligonucleotide transfer into cells in culture and in vivopolyethylenimine，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92(1995)7297-7301)首先報道了聚乙烯亞胺(polyethylenimine，PEI)可作為非病毒載體后，PEI作為一種重要的真核細胞的基因轉(zhuǎn)染載體已經(jīng)成為研究最為廣泛的非病毒型基因轉(zhuǎn)染載體之一。大量的體內(nèi)和體外的轉(zhuǎn)染實驗已經(jīng)證實PEI具有顯著的基因轉(zhuǎn)染效率，在轉(zhuǎn)染過程中能夠更好地保護DNA不受其它酶類如DNase1和DNase2的攻擊而降解。
目前國內(nèi)外已有商品化的PEI，其常被用作高分子凝聚劑、分散劑，部分可用于基因轉(zhuǎn)染。它們的合成方法通常為傳統(tǒng)的化學方法，如微乳液聚合(Xin Chen et al.，The synthesis and characterizations of monodispersecross-linked polymer microspheres with carboxyl on the surface，Polymer 43(15)(2003)4147-4152)、多步化學合成等。而這些合成方法中有些步驟較多并繁雜、反應時間長，副反應多且不可控制，而且在這些常規(guī)的有機化學合成工藝中，通常需要一些具有生物毒性的有機溶劑作為反應溶劑，或添加一些化學引發(fā)劑或乳化劑，如二氯甲烷(Young Heui Kim，Jeong Hyun Park，et al.，Polyethylenimine with acid-labile linkages as a biodegradable gene carrier，Journal of Controlled Release(2004)(In press))；又如用2-氨基乙醇為起始原料合成聚乙烯亞胺，產(chǎn)品中有毒的反應物難以除盡，且反應物產(chǎn)率很低，粒徑大小難以精確控制(Anke von Harpe，et al.，Characterization of commerciallyavailable and synthesized polyethylenimines for gene delivery，Journal ofControlled Release(2000))。這不僅使產(chǎn)品的純化工藝復雜，嚴重地污染環(huán)境，而且影響載體在生物醫(yī)藥領(lǐng)域應用的安全性。
另一方面，由于同一類型載體的基因轉(zhuǎn)染效果及安全性等方面可因其理化性質(zhì)不同而有差異，如載體的分子量，分子量的分布，顆粒粒徑大小及其分布等，特別是載體納米粒子在體內(nèi)及體外的吸收對粒徑大小具有依賴性，通常50nm～100nm粒徑的轉(zhuǎn)染效果較好?？刂戚d體納米凝膠的產(chǎn)品在一定的尺度具有窄粒徑分布，有助于提高轉(zhuǎn)染效率，提高產(chǎn)品的利用率、減少用量、減小細胞毒性等。但現(xiàn)有作為基因轉(zhuǎn)染載體的PEI的分子量大都為0.6～25kDa，其結(jié)構(gòu) 中不含有雙鍵或不穩(wěn)定環(huán)，用常規(guī)的化學法很難引發(fā)其繼續(xù)聚合，且由于現(xiàn)有PEI合成技術(shù)很難控制反應按需結(jié)束，故所得PEl分子量及粒徑大小不易控制，分子量分布范圍較寬、粒徑大小不均勻、分散性差，如目前用作基因轉(zhuǎn)染載體的日本東京化成工業(yè)株式會社出品的PEI預聚體的PCS(photon correlation spectroscopy，中文譯名為光子相關(guān)光譜法)結(jié)果提示為多峰分布，粒徑分布范圍寬(如圖1所示)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是解決上述問題，提供一種新的聚乙烯亞胺納米凝膠。
本發(fā)明的聚乙烯亞胺納米凝膠，其由聚乙烯亞胺預聚物水溶液，在pH不超過ll的堿性條件下，采用抽氫劑經(jīng)紫外光照合成反應制得，其顆粒粒徑采用光子相關(guān)光譜法表示為單峰分布，多分散系數(shù)(Poly.Index)為0.1～0.7。
本發(fā)明的聚乙烯亞胺納米凝膠顆粒粒徑通常在20～600nm范圍，較佳的用作基因轉(zhuǎn)染載體的粒徑為30～200nm。
其中，本發(fā)明所說的聚乙烯亞胺預聚物是指結(jié)構(gòu)式如上所示的鏈狀或樹枝分叉狀的不含有雙鍵或不穩(wěn)定環(huán)的低分子量(其分子量一般＜25kDa)聚乙烯亞胺，該聚乙烯亞胺預聚物水溶液也為凝膠形態(tài)；本發(fā)明選用的聚乙烯亞胺預聚物在反應體系中的重量濃度為0.05-16％，較佳為1-7％。
而本發(fā)明在聚乙烯亞胺預聚物溶液中還可以加有成核劑，所說的成核劑是指能與PEI上的N發(fā)生絡(luò)合，可以控制粒度大小并提高PEI分散性，從而得到大小更均勻且儲存穩(wěn)定性高的納米凝膠的物質(zhì)。已知化學領(lǐng)域中能與N絡(luò)合的物質(zhì)，如過渡金屬鹽等均可作為本發(fā)明成核劑，例如鐵、銅、稀土元素等的金屬鹽；優(yōu)選羧酸鐵、氯化亞鐵、氯化銅、氯化亞銅等。
加入的成核劑在反應體系中的濃度較佳地為0.07-20mg/ml，更佳為1.5-3.5mg/ml。
上述的堿性條件是指pH≥7，較佳的是7.6～11，更佳的是8～10。
本發(fā)明中所說的抽氫劑是指在紫外光光照下產(chǎn)生羥基等自由基可以從一些有機物分子上抽取C、N或S等原子上連接的H原子，從而得到新的自由基而引發(fā)一系列的交聯(lián)反應的一類分子。其可為現(xiàn)有紫外光合成反應中常用的各種光引發(fā)劑，如過氧化物，本發(fā)明的抽氫劑優(yōu)選過氧化氫，其在反應體系中的體積濃度為0.02-3％，較佳為0.05-1％，更佳的是0.1～0.5％。
基于如圖3所示的本發(fā)明合成體系的紫外分光光度吸收光譜圖，本發(fā)明選用的紫外光波長為200～260nm，本發(fā)明選擇能高效產(chǎn)生其中253.7nm短波長紫外光的低壓汞燈為輻照源，其較佳的光照強度為＞0、≤18mw/cm2，更佳的是3～18mw/cm2，光照時間一般不少于5分鐘，最長不超過3小時；本發(fā)明為便于觀察及控制反應條件，通常選用光照強度18mw/cm2，光照時間選擇5分鐘～1小時之間。
同大多數(shù)高分子有機反應一樣，本發(fā)明納米凝膠在制備過程中進行攪拌，由于本發(fā)明中需攪拌物質(zhì)流動性較好，所以根據(jù)常規(guī)采用越高的攪拌速度越好，一般為140～500轉(zhuǎn)/分鐘，為便于觀察及控制反應條件，本發(fā)明采用140轉(zhuǎn)/分鐘左右的機械攪拌。
而本發(fā)明中所說的紫外光照合成反應，同現(xiàn)有紫外光合成反應一樣，在除氧條件下進行，本發(fā)明采用最簡易的氮氣鼓泡法。
更佳地，尤其為得到更好的基因轉(zhuǎn)染載體，本發(fā)明還可以將上述合成工藝制得的聚乙烯亞胺納米凝膠隨后進一步純化得到純品即先用0.45μm針式濾器純化，再用分子量為10000-12000道爾頓的透析袋純化去除未經(jīng)反應的成分及其它雜質(zhì)。當然，也可以根據(jù)不同產(chǎn)品要求，采用其它的過濾、萃取等常規(guī)PEI凝膠的提純方法。
本發(fā)明采用短波長的紫外光引發(fā)低分子量的PEI預聚體產(chǎn)生自由基，進一步聚合得到高分子量的PEI納米凝膠。在PEI預聚體中不含有雙鍵或不穩(wěn)定環(huán)，用常規(guī)的化學法很難引發(fā)其聚合，而本發(fā)明光化學合成法是利用抽氫劑在253.7nm波長下產(chǎn)生的羥基自由基抽取預聚體上的H原子從而使其發(fā)生交聯(lián)，生成高分子量的分叉狀PEI目標產(chǎn)物，另外還可使用成核劑與PEI上的N發(fā)生絡(luò)合得到大小更均勻的納米凝膠，其反應過程如圖2所示。
本發(fā)明PEI納米凝膠的紅外光譜及核磁碳譜數(shù)據(jù)提示其含有C＝N-鍵，和反應前預聚體所含有的官能團不一樣。
本發(fā)明的聚乙烯亞胺納米凝膠可用于制備基因轉(zhuǎn)染載體。
本發(fā)明的積極進步效果在于第一、本發(fā)明通過紫外光輻照引發(fā)不含雙鍵和不穩(wěn)定環(huán)的物質(zhì)的聚合，不需要添加引發(fā)劑及表面活性劑，具體而言，其使抽氫劑在紫外光照射下分解產(chǎn)生羥基自由基，抽取PEI預聚體上的氫原子使預聚體發(fā)生交聯(lián)，最終得到更高分子量的PEI納米凝膠，而PEI預聚體本身在該波長下是很難發(fā)生光降解的；另外，反應在水溶液中進行，無具有生物毒性的有機溶劑參與，可以提高其體內(nèi)試驗的安全性；而253.7nm的紫外光可以使大腸菌、紅痢菌、傷寒菌、葡萄球菌、結(jié)核菌、枯草菌、谷物霉菌等細菌和病毒死亡，保證了本發(fā)明PEI納米凝膠的醫(yī)用質(zhì)量。第二、本發(fā)明制備方法工藝簡單，反應時間快，一般僅需5min～1小時，所用試劑生物毒性小，有利于環(huán)保，從而降低了生產(chǎn)成本。第三、本發(fā)明的高分子納米凝膠接近球狀，其粒徑可控，粒徑分布窄，表面呈分叉狀，分散性好，穩(wěn)定性好，細胞毒性和免疫原性低，不和人外周血有核細胞發(fā)生外源基因轉(zhuǎn)染，小牛血清培養(yǎng)液不會改變基因轉(zhuǎn)染效率，對人腫瘤細胞的基因轉(zhuǎn)染效率超過30％。


圖1為現(xiàn)有PEI預聚體的PCS檢測結(jié)果。
圖2為本發(fā)明采用PEI預聚體光化學合成反應過程示意圖。
圖3為本發(fā)明各種合成體系的紫外分光光度吸收光譜圖；其中，A圖為現(xiàn)有PEI預聚體凝膠水溶液；B圖為PEI預聚體凝膠水溶液加入成核劑后的反應體系；C圖為抽氫劑雙氧水的反應體系。
圖4為本發(fā)明聚乙烯亞胺納米凝膠的核磁共振碳(C13)譜圖。
圖5為本發(fā)明聚乙烯亞胺納米凝膠的紅外光譜圖。
圖6為本發(fā)明一實施例3個樣品的PCS檢測結(jié)果(A圖為1號樣品，B圖為2號樣品，C圖為3號樣品)。
圖7為本發(fā)明另一實施例3個樣品的PCS檢測結(jié)果(A圖為4號樣品，B圖為5號樣品，C圖為6號樣品)。
圖8為本發(fā)明一實施例聚乙烯亞胺納米凝膠的掃描電子顯微鏡(A)和原子力顯微鏡(B)圖。
圖9為單個含水聚乙烯亞胺納米凝膠顆粒的原子力顯微鏡圖。
圖10大劑量聚乙烯亞胺納米凝膠對小鼠肝臟、腎臟和心臟超氧化物歧化酶(SOD)活力的影響圖表；圖11為小劑量聚乙烯亞胺納米凝膠對小鼠肝臟、腎臟和心臟超氧化物歧化酶(SOD)活力的影響圖表；圖12為大劑量聚乙烯亞胺納米凝膠對小鼠肝臟、腎臟和心臟谷胱甘肽(GSH)含量的影響圖表；圖13為小劑量聚乙烯亞胺納米凝膠對小鼠肝臟、腎臟和心臟谷胱甘肽(GSH)含量的影響圖表；圖14為大劑量聚乙烯亞胺納米凝膠對小鼠肝臟、腎臟和心臟丙二醛(MDA)含量的影響圖表；圖15為小劑量聚乙烯亞胺納米凝膠對小鼠肝臟、腎臟和心臟丙二醛(MDA)含量的影響圖表；在圖10～15中，生理鹽水(NS)作為陰性(空白)對照，PEI預聚體作為陽性對照，其中▲P＜0.05(vs NS)，*P＜0.05(vs PEI預聚體)，n＝6。
圖16為小牛血清培養(yǎng)液對本發(fā)明PEI納米凝膠基因轉(zhuǎn)染效率的影響圖表。
具體實施例方式
下面用實施例來進一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不僅限于此。
其中，PEI預聚體(Polyethyleneimine)購自日本東京化成工業(yè)株式會社，原液是30％(w/w)的水凝膠溶液；水為二蒸水；其余試劑為常規(guī)市售AR試劑。
用英國MARLVEN公司Zetasizer 3000HS型激光粒度散射儀，對本發(fā)明PEI納米凝膠粒子的粒徑進行PCS表征，測試時的溫度為25℃，入射激光的波長為633nm，其偏振方向與散射檢測光平面垂直。并使用Nanoscope IIIaAFM原子力顯微鏡(Digital Instruments，Santa Barbara，CA)和LEO1530VP型掃描電子顯微鏡(SEM)對純化后的納米粒子的形貌進行表征。
實施例1在50ml石英燒瓶中，加入下列各種組分組成反應體系，每種組分的濃度依次為PEI預聚物的濃度為1.15％(w/w)、羧酸鐵作為成核劑的濃度為1.54mg/ml，加入極少量稀鹽酸溶液(0.5M)調(diào)節(jié)pH值至9.5?？刂茢嚢杷俣葹?40轉(zhuǎn)/分鐘左右，通氮氣除氧30分鐘后，加入3％的雙氧水(過氧化氫)，使其在反應液中的濃度為0.057％(v/v)。在連續(xù)通氮氣(氮氣流量80ml/min)的情況下，用紫外低壓汞燈，以光照強度為18mw/cm2光照1h(小時)引發(fā)反應?？刂迫缟纤龅姆磻獥l件進行三次重復試驗得到1號、2號、3號三個樣品，對所得三次重復樣品用0.45μm針式濾器(ANPEL產(chǎn)品)和分子量10000-12000道爾頓的透析袋(華美生物工程公司)純化樣品。
用上述激光粒度散射儀PCS法測量三個納米凝膠樣品的粒徑各三次，結(jié)果示單峰分布，粒徑分布窄(如圖6所示)，所得平均值分別為1號，91.9nm；2號，79.4nm；3號，89.9nm，它們的多分散系數(shù)依次為0.303、0.6、0.439，平均粒徑大小約為87nm。
對樣品進行冷凍真空干燥后用掃描電子顯微鏡(SEM)和原子力顯微鏡(AFM)表征其形狀為球形結(jié)構(gòu)，整體分散性較好，局部有團聚現(xiàn)象，結(jié)果如圖8所示。用AFM觀察單個粒子，可以在粒子上見到明顯的溝槽，推測為疏松的枝杈狀結(jié)構(gòu)，結(jié)果見圖9。作為對照，將現(xiàn)有的上述PEI預聚體同樣條件下進行PCS檢測，結(jié)果如圖1所示，多峰分布，粒徑分布寬，大小十分不均勻，分散性差。
實施例2PEI預聚物濃度為4.8％(w/w)、氯化亞鐵濃度為3.21mg/ml、加入極少量稀鹽酸溶液調(diào)節(jié)溶液的pH值至10.0。加入3％的過氧化氫，使其在反應液中的濃度為0.12％(v/v)，余同實施例1。
將純化后的聚乙烯亞胺納米凝膠樣品用激光粒度散射儀PCS法測量，均示單峰分布(圖未示)，該聚乙烯亞胺納米凝膠的粒徑平均值為172.9nm，多分散系數(shù)為0.355。在4℃條件下放置21天后再檢測，其粒徑的平均值為171.7nm，多分散系數(shù)為0.415。結(jié)果表明聚乙烯亞胺納米凝膠樣品在放置過程中基本保持穩(wěn)定，粒徑?jīng)]有發(fā)生明顯變化，具有一定的貯存穩(wěn)定性。經(jīng)真空干燥的聚乙烯亞胺納米凝膠樣品以掃描電子顯微鏡測試該樣品的形狀也同實施例1近于球形，分散性好。
實施例3
PEI濃度為1.15％(w/w)、羧酸鐵濃度為1.54mg/ml、加入稀鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值至8.0?？刂茢嚢杷俣葹?40轉(zhuǎn)/min左右，通氮氣除氧30min后，加入3％的過氧化氫，使其在反應液中的濃度為0.11％(v/v)。在連續(xù)通入氮氣(氮氣流量80ml/min)的條件下，紫外光光照強度為18mw/cm2光照1h引發(fā)反應?？刂迫缟纤龅姆磻獥l件每隔一個月進行一次重復試驗，得到4號、5號、6號三個樣品，樣品經(jīng)0.45μm針式濾器過濾和三次透析純化后，經(jīng)PCS測量三個納米凝膠樣品的粒徑各三次，結(jié)果示單峰分布，粒徑分布窄(如圖7所示)，所得平均值分別為4號，136.5nm；5號，146.4nm；6號，150.4nm，它們的多分散系數(shù)依次為0.300、0.437和0.408。
實施例4每種組分的濃度依次為PEI濃度為6.3％(w/w)，不添加成核劑，加入極少量稀鹽酸溶液(0.5M)調(diào)節(jié)pH值＝10.6，在通氮除氧30min后加入過氧化氫使其在反應液中的濃度為1.36％(v/v)，控制紫外光光照強度為18mw/cm2，光照反應時間為3小時，余同實施例1。純化后用PCS測得結(jié)果示單峰分布，納米凝膠的粒徑為38nm，多分散系數(shù)為0.200。
實施例5PEI預聚物濃度為6％(w/w)、成核劑羧酸鐵的濃度為0.1mg/ml、調(diào)節(jié)溶液的pH值至10.0，余同實施例1，用PCS測得結(jié)果示單峰分布，所得納米凝膠的粒徑為341nm左右，多分散系數(shù)為0.105。
實施例6PEI濃度為16％(w/w)，成核劑濃度為20mg/ml，調(diào)節(jié)pH值＝9.5，雙氧水在反應液中的濃度為2.8％(v/v)，余同實施例1。純化后，用PCS測得結(jié)果示單峰分布，納米凝膠的粒徑為106nm，多分散系數(shù)為0.502。
實施例7PEI濃度為3.7％(w/w)，成核劑氯化亞鐵濃度為0.7mg/ml，調(diào)節(jié)pH值＝10.6，雙氧水在反應液中的濃度為0.05％(v/v)，余同實施例1。純化后用PCS測得結(jié)果示單峰分布，納米凝膠的粒徑為600nm，多分散系數(shù)為0.700。
實施例8PEI濃度為4.8％(w/w)，成核劑濃度為3.2mg/ml，調(diào)節(jié)pH值＝10.6，加入過氧化鈉，使其在反應液中的濃度為0.13％(v/v)，控制紫外光光照強度為3mw/cm2，光照0.5小時，余同實施例1。純化后，用PCS測得結(jié)果示單峰分布，納米凝膠的粒徑為200nm，多分散系數(shù)為0.450。
實施例9PEI預聚物濃度為0.05％(w/w)、成核劑濃度為0.56mg/ml、調(diào)節(jié)溶液的pH值至8，加入3％的過氧化氫，使其在反應液中的濃度為0.02％(v/v)，紫外光光照強度為18mw/cm2，光照5分鐘引發(fā)反應，余同實施例1。
純化后的聚乙烯亞胺納米凝膠用PCS測得結(jié)果示單峰分布，其粒徑平均值為256nm，多分散系數(shù)為0.30。
實施例10PEI預聚物濃度為3.7％(w/w)、成核劑氯化亞鐵濃度為0.07mg/ml、調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.6，加入3％的過氧化氫，使其在反應液中的濃度為0.037％(v/v)，紫外光光照強度為18mw/cm2，光照0.5小時引發(fā)反應，余同實施例1。純化后的聚乙烯亞胺納米凝膠用PCS測得結(jié)果示單峰分布，其粒徑平均值為325nm，多分散系數(shù)為0.670。
上述實施例制得的本發(fā)明PEI納米凝膠使用華東師范大學的500MHZ的核磁共振儀對預聚體和本發(fā)明的高分子量PEI納米凝膠進行分子結(jié)構(gòu)表征，其中本發(fā)明PEI納米凝膠的13C-NMRδ35.20，36.28，37.96，39.77，42.73，44.06，46.15，47.69，52.01，54.25，57.65，59.31，60.00，63.66，65.15，67.42，69.44，76.02，164.92，166.35(如圖4所示)，二者的分子結(jié)構(gòu)不相同，本發(fā)明的PEI在164.92-166.35處出現(xiàn)了新的峰，該峰為-C＝N的峰，而在30～70ppm范圍內(nèi)的峰也發(fā)生了較大變化，是因為反應過程中-CH2上的H被抽氫劑抽走，經(jīng)反應得到了新的一些烷基鍵，這進一步驗證了紫外光引發(fā)的交聯(lián)反應的發(fā)生。根據(jù)結(jié)果，我們推斷合成的PEI納米凝膠中含有C＝N-鍵。
此外，本發(fā)明PEI納米凝膠的紅外光譜數(shù)據(jù)為IR(KBr，cm-1)3418.95(vs)，2948.03(s)，2834.95(s)，2359.02(w)，1651.92(m)，1574.98(s)，1471.35(s)，1313.61(m)，1117.61(m)，586.30(m)，其圖譜如圖5所示，與上述預聚體的紅外光譜相比，本發(fā)明PEI在1574.98處出現(xiàn)了一個新峰，而1651.92，1471.35處的峰也發(fā)生了強度的變化，說明在分子中增加了C-H鍵的含量，而出現(xiàn)了C＝N-新鍵，這和C13核磁共振譜的結(jié)果相吻合，即也證實PEI納米凝膠含有C＝N-鍵，和反應前預聚體所含有的官能團不一樣。
應用實施例1 PEI納米凝膠作為腫瘤治療基因轉(zhuǎn)導載體的安全性在徐州醫(yī)學院的協(xié)作下，對本發(fā)明的高分子量PEI納米凝膠作為腫瘤治療基因轉(zhuǎn)導載體的安全性進行了驗證。
其中，大劑量試驗給小鼠100mg/kg體重，0.2ml，1次注射下列樣品；小劑量試驗給小鼠按總共5mg/kg體重的劑量，1次/天，分3天連續(xù)注射下列樣品；樣品為實施例1～4制備得到的各種粒徑的PEI納米凝膠，同劑量的生理鹽水(NS)作為陰性(空白)對照，PEI預聚體作為陽性對照，采用SPSS12.0統(tǒng)計軟件LSD方法對下列各組數(shù)據(jù)進行方差分析及差異作統(tǒng)計學比較，結(jié)果如圖10～15所示。結(jié)論為1、對小鼠肝臟、腎臟和心臟超氧化物歧化酶(SOD)活力的影響大劑量試驗如圖10所示，可見隨PEI納米凝膠粒徑的增大超氧化物歧化酶活力逐漸減小，近似于一定斜率的線性關(guān)系，且PEI預聚體毒性最大。
小劑量試驗如圖11所示，本發(fā)明各種粒徑的PEI納米凝膠對小鼠肝臟、腎臟和心臟SOD活力無顯著影響，但PEI預聚體降低了小鼠肝臟、腎臟和心臟SOD活力。
2、對小鼠肝臟、腎臟和心臟谷胱甘肽(GSH)含量的影響大劑量試驗如圖12所示，可見隨PEI納米凝膠粒徑的增大谷胱甘肽含量逐漸減小，近似于一定斜率的線性關(guān)系，且PEI預聚體毒性最大。
小劑量試驗如圖13所示，本發(fā)明各種粒徑的PEI納米凝膠對小鼠肝臟、腎臟和心臟GSH含量無顯著影響，但PEI預聚體降低了小鼠肝臟、腎臟和心臟GSH含量。
3、對小鼠肝臟、腎臟和心臟丙二醛(MDA)含量的影響大劑量試驗如圖14所示，可見隨PEI納米凝膠粒徑的增大MDA含量逐漸增大，近似于一定斜率的線性關(guān)系，且PEI預聚體毒性最大。
小劑量試驗如圖15所示，本發(fā)明各種粒徑的PEI納米凝膠對小鼠肝臟、腎臟和心臟MDA含量無顯著影響，但PEI預聚體顯著提高了小鼠肝臟、腎臟和心臟MDA含量。
另外，實驗還表明本發(fā)明各種粒徑的PEI納米凝膠和PEI預聚體對小鼠外周血白蛋白、小鼠外周血小鼠肌酐、小鼠外周血白蛋白\球蛋白比例、小鼠外周血小鼠丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、小鼠外周血小鼠尿素氮、小鼠脾臟淋巴細胞細胞周期和凋亡等均無顯著影響。
綜上所述，本發(fā)明的PEI納米凝膠對小鼠肝臟、腎臟和心臟SOD活力、GSH含量、MDA含量等均無顯著影響，說明本發(fā)明的PEI基因轉(zhuǎn)染載體在動物整體水平上無生物毒性。而PEI預聚體會顯著降低小鼠肝臟、腎臟和心臟SOD活力和GSH含量，顯著提高小鼠肝臟、腎臟和心臟中的MDA含量，這說明預聚體對小鼠重要臟器有氧化性損傷。
應用實施例2 本發(fā)明PEI納米凝膠基因轉(zhuǎn)染效率的表征轉(zhuǎn)染方法(1)報告基因pLEGFP-C1質(zhì)粒的擴增、提取和純化可按現(xiàn)有常規(guī)方法進行，報告基因的獲取pLEGFP-C1購自Clonetech公司。
重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細胞感受態(tài)細胞大腸桿菌DH5α的制備，轉(zhuǎn)染大腸桿菌HB101或DH52，應用抗生素平板篩選含有陽性重組子的菌落，并擴菌制備高純度的pLEGFP-C1。
細菌的收集高純度的pLEGFP-C1制備，按質(zhì)粒提純試劑盒(購自QIAGEN公司)說明操作。
核酸的定量UV-2401PC型紫外分光光度儀(日本島津公司)(2)轉(zhuǎn)染細胞轉(zhuǎn)染細胞分別為Bell肝癌細胞、A549肺癌細胞、HELA宮頸癌細胞、BGC-823胃癌細胞(購自中國醫(yī)學科學院藥物研究所)和人外周血有核細胞(實驗者本人)。
(3)利用熒光顯微鏡和流式細胞儀測定在本發(fā)明上述各種粒徑、不同濃度(濃度梯度設(shè)為4μg、6μg、8μg)的PEI納米凝膠(實施例1～4產(chǎn)品)介導下轉(zhuǎn)染Bell肝癌細胞、A549肺癌細胞、HELA宮頸癌細胞和BGC-823胃癌細胞。轉(zhuǎn)染前24h，分別將上述腫瘤細胞接種在24孔細胞培養(yǎng)板中，每孔接種5×104個細胞，待細胞豐度50％～80％左右進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前細胞用PBS洗滌1次，加入1ml不含血清及抗生素的PR1640培養(yǎng)基。
2μg的DNA溶于50μl生理鹽水。不同濃度PEI預先無菌抽濾(最優(yōu)濃度由預試驗確定，并上下個移動一個梯度，共計三個濃度梯度(4μg、6μg、8μg)溶于50μl生理鹽水。
本發(fā)明PEI加入DNA，室溫孵育10分鐘。100μl的PEI/DNA復合物加入細胞培養(yǎng)孔，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)箱37℃溫育2h。PBS洗滌2次，加入含10％FCS(小牛血清)和抗生素的細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，每孔重復12孔。24～36h后熒光顯微鏡下觀察熒光表達并計數(shù)表達率。同時消化，收集細胞PBS洗滌2次，6個復孔流式細胞儀檢測熒光陽性表達，計算結(jié)果時，陽性細胞百分數(shù)值均減去未加質(zhì)粒的空白對照細胞組的自發(fā)性熒光值。其余6個復孔的細胞收集洗滌后加入預冷的75％酒精1ml固定1～2h，PBS洗滌2次加入10μl PI(propidium iodide碘化丙啶)混勻，至4℃閉光30min，流式細胞儀(FACSCalibur美國BD公司)檢測細胞周期和凋亡。
注流式細胞儀(FACS Calibur美國BD公司)光源為488nm的氬離子激光器。GFP(綠色熒光蛋白)受488nm激發(fā)后發(fā)出507nm的綠色熒光。測定完成后在計算機上用Cells Quest軟件分析數(shù)據(jù)。
利用臺盼藍染色法和MTT法研究本發(fā)明PEI體外在最優(yōu)轉(zhuǎn)染濃度(最優(yōu)濃度由預試驗確定，并上下各移動一個梯度，共計三個濃度梯度)及十倍最優(yōu)濃度下對Bell肝癌細胞、A549肺癌細胞、HELA宮頸癌細胞和BGC-823胃癌細胞的毒性等可能影響因素。
(4)人外周血有核細胞的提取和處理抽取人血24ml，分裝于帶有抗凝劑的無菌試管中，3ml/管。將3ml淋巴細胞分離液移入10ml具塞離心管中，再將等量人血緩慢加入離心管中，以1500r/min離心15min。用細長毛細吸管小心吸取云霧狀中間層，共移入3個5ml EP管中，用PBS洗滌2次。將其中一個EP管用無血清、無抗生素的1640混勻，以8×105/孔的細胞數(shù)分裝入24孔培養(yǎng)板中，按腫瘤細胞的轉(zhuǎn)染方法進行轉(zhuǎn)染實驗(PEI的濃度梯度設(shè)為4μg、6μg、8μg，DNA均取2μg，并重復3次)，作為對照組。
將另外2個EP管分別用含5μg/ml conA的1640生長液和含20μg/ml PHA的1640生長液混勻，以8×105/孔的細胞數(shù)分裝入24孔培養(yǎng)板中，在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中孵育。待含有conA刺激因素的細胞孵育20h后按腫瘤細胞的轉(zhuǎn)染方法進行轉(zhuǎn)染實驗(PEI的濃度梯度設(shè)為4μg、6μg、8μg，DNA均取2μg，并重復3次)。待含有PHA刺激因素的細胞孵育48h后按腫瘤細胞的轉(zhuǎn)染方法進行轉(zhuǎn)染實驗(PEI的濃度梯度設(shè)為4μg、6μg、8μg，DNA均取2μg，并重復3次)。
(5)統(tǒng)計學處理采用SPSS12.0統(tǒng)計軟件LSD方法對各組數(shù)據(jù)進行方差分析及差異作統(tǒng)計學比較。
結(jié)果用流式細胞儀和熒光顯微鏡測定本專利合成的PEI納米凝膠對Bell肝癌細胞、A549肺癌細胞、HELA宮頸癌細胞和BGC-823胃癌細胞轉(zhuǎn)染效率的值如下表所示

同時我們還用原子力顯微鏡觀察到濃縮DNA的復合物納米粒子為毛刺狀結(jié)構(gòu)(圖未示)，也證實了PEI和DNA通過靜電作用結(jié)合到一起的設(shè)想，DNA是纏繞在PEI的表面，在進入細胞后，通過細胞中pH值的改變，會使DNA比較容易從復合物上釋放出來。
特別需要指出的是，本發(fā)明的高分子量PEI納米凝膠對經(jīng)PHA和conA處理的人外周血有核細胞進行轉(zhuǎn)染，分別于轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h進行觀察，均未發(fā)現(xiàn)有陽性表達，說明本發(fā)明的PEI納米凝膠不會導致血液內(nèi)有核細胞的外源基因轉(zhuǎn)染。
應用實施例3 小牛血清培養(yǎng)液對本發(fā)明PEI納米凝膠基因轉(zhuǎn)染效率的影響Ogris等認為培養(yǎng)基中含有血清時會影響基因轉(zhuǎn)染載體的基因轉(zhuǎn)染效率(Ogris M，Steinlein P，Kursa M，et al.，The size of DNA/transferring-PEIcomplexes is an important factor for gene expression in cultured cells，Gene Ther.5(10)(1998)1425-1433)。而本實驗用于研究小牛血清培養(yǎng)液對本發(fā)明PEI納米凝膠基因轉(zhuǎn)染效率的影響。
樣品為實施例1、實施例2、上述商品化基因轉(zhuǎn)染PEI預聚體、和現(xiàn)常用于基因轉(zhuǎn)染研究的DOTAP脂質(zhì)體(取自上海交通大學)。試驗過程參見應用實施例2，其中將各種載體/DNA復合物加入96孔板，在有或無FBS(小牛血清，10％)的情況下，轉(zhuǎn)染96孔板中的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，結(jié)果如圖16所示。
結(jié)論本試驗證實本發(fā)明的高分子量PEI納米凝膠用于細胞轉(zhuǎn)染時，小牛血清培養(yǎng)液不會改變基因轉(zhuǎn)染效率，這對開展動物基因轉(zhuǎn)染研究具有十分重要的意義。
權(quán)利要求
1.一種聚乙烯亞胺納米凝膠，其由聚乙烯亞胺預聚物水溶液，在pH不超過11的堿性條件下，采用抽氫劑經(jīng)紫外光照合成反應制得，其顆粒粒徑采用光子相關(guān)光譜法表示為單峰分布，多分散系數(shù)為0.1～0.7。
2.如權(quán)利要求1所述的聚乙烯亞胺納米凝膠，其特征在于其顆粒粒徑為20～600nm。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的聚乙烯亞胺納米凝膠，其特征在于其顆粒粒徑為30～200nm。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的聚乙烯亞胺納米凝膠，其特征在于該聚乙烯亞胺預聚物在反應體系中的重量濃度為0.05-16％。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的聚乙烯亞胺納米凝膠，其特征在于該聚乙烯亞胺預聚物水溶液中還加入成核劑，其在反應體系中的濃度為0.07-20mg/ml。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的聚乙烯亞胺納米凝膠，其特征在于該成核劑為過渡金屬鹽。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的聚乙烯亞胺納米凝膠，其特征在于該抽氫劑為過氧化物，其在反應體系中的體積濃度為0.02-3％；該紫外光波長為200～260nm。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的聚乙烯亞胺納米凝膠，其特征在于該紫外光波長為253.7nm，其光照強度為＞0、≤18mw/cm2，光照時間為5分鐘至3小時。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的聚乙烯亞胺納米凝膠，其特征在于將權(quán)利要求1～9所述的聚乙烯亞胺納米凝膠先用0.45μm針式濾器純化，再用分子量為10000-12000道爾頓的透析袋純化制得其純品。
10.如權(quán)利要求1～9所述的聚乙烯亞胺納米凝膠在制備基因轉(zhuǎn)染載體中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種聚乙烯亞胺納米凝膠，其由聚乙烯亞胺預聚物水溶液，在pH不超過11的堿性條件下，采用抽氫劑經(jīng)紫外光照合成反應制得，其顆粒粒徑采用光子相關(guān)光譜法表示為單峰分布，多分散系數(shù)為0.1～0.7。本發(fā)明還公開了其作為基因轉(zhuǎn)染載體的用途。本發(fā)明PEI納米凝膠粒徑可控，粒徑分布窄，比較均勻，由此降低了細胞毒性和免疫原性，提高了其作為載體在生物醫(yī)藥領(lǐng)域應用的安全性及轉(zhuǎn)染效率，并不和人外周血有核細胞發(fā)生外源基因轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染效率也不受小牛血清培養(yǎng)液影響。
文檔編號C08L39/00GK1737037SQ20051002674
公開日2006年2月22日 申請日期2005年6月15日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月15日
發(fā)明者姚思德, 徐冬梅, 劉永彪, 喬向利, 余家會, 孫漢文, 盛康龍 申請人:中國科學院上海應用物理研究所