專利名稱:一種大環(huán)多胺與聚酰胺綴合物及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及一種化合物及其制備方法與應(yīng)用,特別涉及一種大環(huán)多胺與聚酰胺綴合物及其制備方法與以其金屬配合物為活性成分的核酸切割試劑。
背景技術(shù):
設(shè)計(jì)、合成定點(diǎn)核酸切割試劑是當(dāng)前化學(xué)和分子生物學(xué)研究的一個十分活躍的領(lǐng)域。含有N-甲基吡咯的寡聚酰胺能夠穿透細(xì)胞膜與特定的堿基序列高親和力地結(jié)合,并控制基因表達(dá),是一類十分重要的化學(xué)物質(zhì)(Blasko A,Browne KA,Bruice TC.J.Am.Chem.Soc.1994;1163726;2.Gottesfeld JM,Neely L,Trauger JW,Baird EE,Dervan PB.Nature 1997;387202)。因此,對寡聚酰胺類化合物的設(shè)計(jì)、合成及其生物活性的研究以及提高其分子親合性、序列選擇性和切割效率具有重要意義。
合成核酸酶是化學(xué)生物學(xué)發(fā)展迅速的一個具有挑戰(zhàn)性的新領(lǐng)域,大環(huán)多胺和它的金屬配合物也被合成作為仿酶催化劑(R.S.Dickins,J.A.K.Howard,C.W.Lehmann,J.Moloney,D.Parker,R.D.Peacock,Angew.Chem.1997,109,541-543;Angew.Chem.Int.Ed.Engl.1997,36,521-523;S.Aime,M.Botta,S.G.Crich,B.G.Giovenzana,G.Jommi,R.Pagliarin,M.Sisti,J.Chem.Soc.,Chem.Commun.1995,1885-1886;S.Aoki,M.Shiro,T.Koike,E.Kimura,J.Am.Chem.Soc.2000,122,576-584;B.Knig,M.Pelka,H.Zieg,T.Ritter,H.Bouas-Laurent,R.Bonneau,J.-P.Desvergne,J.Am.Chem.Soc.1999,121,1681-1687;E.Kikuta,T.Koike,E.Kimura,J.Inorg.Biochem.2000,79,253-259)。
發(fā)明創(chuàng)造內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種大環(huán)多胺與聚酰胺綴合物。
本發(fā)明所提供的大環(huán)多胺與聚酰胺綴合物,是具有下述式(I)結(jié)構(gòu)的4-(4-(4-(4-1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷乙酰氨基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-乙酰氨基)-N、N-二甲基丁胺。
式(I)
該大環(huán)多胺聚酰胺綴合物的分子式為C39H58N14O5。
本發(fā)明的第二個目的是提供一種制備上述大環(huán)多胺與聚酰胺綴合物的方法。
本發(fā)明所提供的制備上述大環(huán)多胺與聚酰胺綴合物的方法,包括以下步驟1)制備4,7,10-三(叔丁氧羰酰)-1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷-1-乙酸;2)將步驟1)中制備的4,7,10-三(叔丁氧羰酰)-1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷-1-乙酸溶于DMF(N,N-二甲基甲酰胺)中,再分別加入0.8-0.9倍于所述4,7,10-三(叔丁氧羰酰)-1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷-1-乙酸的物質(zhì)量的1-羥基苯并三氮唑(HOBt)和N,N-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC),室溫反應(yīng)20-24小時;然后過濾除去二環(huán)己基脲(DCU),保留濾液;3)制備4-(4-(4-(4-氨基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-乙酰基)氨基N、N-二甲基丁胺;4)在步驟2)所得濾液中,加入0.8-0.9倍于步驟1)所述4,7,10-三(叔丁氧羰酰)-1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷-1-乙酸的物質(zhì)量的4-(4-(4-(4-氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-乙酰基)氨基N、N-二甲基丁胺,室溫反應(yīng)30-36小時,過濾,殘余物用硅膠H柱層析分離得淡黃色非晶形固體;5)在步驟4)所述淡黃色非晶形固體中加入5.0-6.0倍于步驟1)所述4,7,10-三(叔丁氧羰酰)-1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷-1-乙酸的物質(zhì)量的HBr,室溫解析,脫除叔丁氧羰酰,再在15mL NaOH溶液(40%)中解析得到產(chǎn)物4-(4-(4-(4-1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷乙酰氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-乙酰氨基)-N、N-二甲基丁胺。
在上述制備4-(4-(4-(4-1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷乙酰氨基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-乙酰氨基)-N、N-二甲基丁胺方法中,步驟1)所述的4,7,10-三(叔丁氧羰酰)-1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷-1-乙酸可按下述步驟制備1)在冰浴下制備濃度為0.1M溴乙酸的甲醇溶液(0.143g溴乙酸溶于10ml甲醇中,0.1M的KOH的甲醇溶液(0.056gKOH溶于10ml甲醇中)逐滴滴加濃度為0.1M溴乙酸的甲醇溶液,得到0.05M溴乙酸的鉀鹽懸濁液,所述溴乙酸的甲醇溶液的體積與KOH甲醇溶液的體積相等,2)在濃度為0.5M的4,7,10-三(叔丁氧羰酰)-1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷甲醇溶液20ml中,加入碳酸鉀,所述碳酸鉀的物質(zhì)的量為所述4,7,10-三(叔丁氧羰酰)-1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷的3-5倍;然后冰浴下滴加步驟1)得到的溴乙酸鉀鹽懸濁液,該溴乙酸鉀鹽懸濁液物質(zhì)的量為所述4,7,10-三(叔丁氧羰酰)-1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷的1.2-1.5倍;室溫反應(yīng)4-6h后40-50℃反應(yīng)6-8h,溶液減壓蒸去溶劑后得到固體產(chǎn)物;3)將所得固體產(chǎn)物溶于蒸餾水中,用乙酸乙酯萃取,干燥,減壓濃縮溶劑,柱層析得白色固體產(chǎn)物。
在上述制備4-(4-(4-(4-1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷乙酰氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-乙酰氨基)-N、N-二甲基丁胺方法中,步驟3)中所述4-(4-(4-(4-氨基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-乙酰氨基)-N、N-二甲基丁胺可按下述步驟制備1)N-甲基吡咯與其1-1.2倍物質(zhì)的量的CCl3COCl于室溫進(jìn)行?;磻?yīng)12-16小時,得到N-甲基-2-三氯己?;量?;2)N-甲基-2-三氯己?;量┡c分別是其1.1和0.09倍物質(zhì)的量的HNO3和H2SO4在-10℃進(jìn)行硝化反應(yīng)4小時,室溫進(jìn)行反應(yīng)16小時,得到4-硝基-2-三氯己?;?N-甲基吡咯;3)4-硝基-2-三氯己酰基-N-甲基吡咯與1倍的NH2CH2CH2CH2CH2N(CH3)2室溫反應(yīng)12-16小時,得到4-(4-硝基-N-甲基吡咯-2-己酰)-氨基-N、N-二甲基丁胺;4)4-(4-硝基-N-甲基吡咯-2-己酰)-氨基-N、N-二甲基丁胺在10%的鈀碳催化下于與H2室溫進(jìn)行氫化反應(yīng),得到4-(4-氨基-N-甲基吡咯-2-己酰)-氨基-N、N-二甲基丁胺,所述鈀碳的物質(zhì)的量是4-(4-硝基-N-甲基吡咯-2-己酰)-氨基-N、N-二甲基丁胺的0.05-0.15倍;5)4-(4-氨基-N-甲基吡咯-2-己酰)-氨基-N、N-二甲基丁胺與其0.8-1.0倍物質(zhì)的量的N-甲基-2-三氯己?;?4-硝基吡咯于0℃反應(yīng)12小時,得到4-(4-硝基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-酰基氨基)-N、N-二甲基丁胺;6)4-(4-硝基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-?;被?-N、N-二甲基丁胺在10%的鈀碳催化下于與H2室溫常壓進(jìn)行氫化反應(yīng)24小時,得到4-(4-氨基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-?;被?-N、N-二甲基丁胺,所述鈀碳的物質(zhì)的量是4-(4-硝基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-?;被?-N、N-二甲基丁胺的0.10-0.15倍;然后再分別與1倍的PyPyCOOH(Py=N-methylpyrrole)、1倍的HOBt和1.2倍的DCC所形成的活化酯于室溫反應(yīng)24小時,得到4-(4-(4-(4-硝基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-乙酰氨基)-N、N-二甲基丁胺。
7)在0.1mol/L(0.621g 1mmol溶于10ml)4-(4-(4-(4-硝基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-乙酰氨基)-N、N-二甲基丁胺的DMF溶液中,加入10%鈀碳室溫下催化氫化還原硝基為氨基,反應(yīng)時間為24小時,過濾除去催化劑,濃縮濾液得到4-(4-(4-(4-氨基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-乙?;?氨基N、N-二甲基丁胺無色液體,所述10%鈀碳的物質(zhì)的量是4-(4-(4-(4-硝基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-乙酰氨基)-N、N-二甲基丁胺的0.08-0.10倍。
在上述制備4-(4-(4-(4-1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷乙酰氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-乙酰氨基)-N、N-二甲基丁胺方法中,步驟2)中的4,7,10-三(叔丁氧羰酰)-1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷-1-乙酸在DMF中的濃度可為0.20-0.35M,優(yōu)選為0.25M;所述羥基苯并三氮唑(HOBt)和N、N-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)的物質(zhì)的量均與4,7,10-三叔丁氧羰酰-1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷-1-乙酸的物質(zhì)量相等。
在上述制備4-(4-(4-(4-氨基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-乙酰氨基)-N、N-二甲基丁胺方法中,步驟7)中加入的4-(4-(4-(4-硝基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-乙酰基)氨基N、N-二甲基丁胺可先溶于DMF中,其濃度可為0.2M;本發(fā)明的第三個目的是提供一種核酸切割試劑。
本發(fā)明所提供的核酸切割試劑,其活性成分是具有上述式(I)結(jié)構(gòu)的4-(4-(4-(4-1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷乙酰氨基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-乙酰氨基)-N、N-二甲基丁胺的金屬配合物。
其中,在上述核酸切割試劑中,所述金屬配合物的中心離子可為Zn2+,Cu2+,La2+等金屬離子。
本發(fā)明的4-(4-(4-(4-1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷乙酰氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-乙酰氨基)-N、N-二甲基丁胺的金屬配合物具有核酸切割系統(tǒng)和識別系統(tǒng),切割系統(tǒng)由大環(huán)多胺構(gòu)成,識別系統(tǒng)由寡聚酰胺組成。本發(fā)明為進(jìn)一步合成DNA定點(diǎn)識別及切割試劑提供了良好的基礎(chǔ)和有效的途徑,具有重要的意義。
圖1為4-(4-(4-(4-1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷乙酰氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-乙酰氨基)-N、N-二甲基丁胺的制備過程示意2為反應(yīng)15min時的電泳圖譜圖3為反應(yīng)30min時的電泳圖譜圖4為反應(yīng)45min時的電泳圖譜具體實(shí)施方式
實(shí)施例1、4-(4-(4-(4-1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷乙酰氨基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-乙酰氨基)-N、N-二甲基丁胺的制備4-(4-(4-(4-1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷乙酰氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-乙酰氨基)-N、N-二甲基丁胺的合成過程如圖1所示,具體包括以下步驟1、合成4,7,10-三(叔丁氧羰酰)-1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷-1-乙酸1)將0.070gKOH冰浴下溶于4ml甲醇,然后逐滴滴加0.135g(1mml)溴乙酸的甲醇溶液得到溴乙酸的鉀鹽懸濁液;2)4,7,10-三(叔丁氧羰酰)-1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷0.472g溶于20mL甲醇中,并加入0.157g碳酸鉀,將上述溴乙酸鉀鹽懸濁液在冰浴下滴加到反應(yīng)體系中,室溫反應(yīng)5h后45℃下反應(yīng)7h,得到溶液;3)溶液減壓蒸去溶劑后得到固體,將所得固體溶于25ml蒸餾水中,用25×3ml乙酸乙酯萃取,無水硫酸鎂干燥,減壓濃縮溶劑,以乙酸乙酯與石油醚為洗脫劑柱層析(5∶1)得白色固體4,7,10-三(叔丁氧羰酰)-1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷-1-乙酸,產(chǎn)率87.7%。
2、合成4-(4-(4-(4-硝基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-乙酰基)氨基N、N-二甲基丁胺1)N-甲基吡咯與其1-1.2倍物質(zhì)的量的CCl3COCl于室溫進(jìn)行?;磻?yīng)12-16小時,得到N-甲基-2-三氯己?;量?;2)N-甲基-2-三氯己?;量┡c分別是其1.1和0.09倍物質(zhì)的量的HNO3和H2SO4在-10℃進(jìn)行硝化反應(yīng)4小時,室溫進(jìn)行反應(yīng)16小時,得到4-硝基-2-三氯己?;?N-甲基吡咯;3)4-硝基-2-三氯己?;?N-甲基吡咯與1倍的NH2CH2CH2CH2CH2N(CH3)2室溫反應(yīng)12-16小時,得到4-(4-硝基-N-甲基吡咯-2-己酰)-氨基-N、N-二甲基丁胺;
4)4-(4-硝基-N-甲基吡咯-2-己酰)-氨基-N、N-二甲基丁胺在10%的鈀碳催化下于與H2室溫進(jìn)行氫化反應(yīng),得到4-(4-氨基-N-甲基吡咯-2-己酰)-氨基-N、N-二甲基丁胺,所述鈀碳的物質(zhì)的量是4-(4-硝基-N-甲基吡咯-2-己酰)-氨基-N、N-二甲基丁胺的0.05-0.15倍;5)4-(4-氨基-N-甲基吡咯-2-己酰)-氨基-N、N-二甲基丁胺與其0.8-1.0倍物質(zhì)的量的N-甲基-2-三氯己?;?4-硝基吡咯于0℃反應(yīng)12小時,得到4-(4-硝基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-?;被?-N、N-二甲基丁胺;6)lmmol 4-氨基-N-甲基吡咯-2-己酰氨基-N、N-二甲基丁胺與1mmol的4-硝基-2-三氯己?;?N-甲基吡咯室溫反應(yīng)24小時,得到4-(4-硝基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-?;被?-N、N-二甲基丁胺;7)1mmol 4-(4-硝基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-?;被?-N、N-二甲基丁胺在10%鈀碳催化下于與H2室溫常壓進(jìn)行氫化反應(yīng)24小時,得到4-(4-氨基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-酰基氨基)-N、N-二甲基丁胺,然后再與1mmol的PyPyCOOH、1mmol的HOBt和1mol的DCC的活化酯(反應(yīng)時間為18小時)于室溫下反應(yīng)24小時,得到4-(4-(4-(4-硝基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-乙?;?氨基N、N-二甲基丁胺,所述10%鈀碳的物質(zhì)的量是4-(4-硝基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-?;被?-N、N-二甲基丁胺的0.05-0.15倍。
3、合成4-(4-(4-(4-1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷乙酰氨基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-乙酰氨基)-N、N-二甲基丁胺1)將步驟2中制備的4-(4-(4-(4-硝基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-乙?;被?-N、N-二甲基丁胺(1mmol)溶于25ml DMF中,在10%鈀碳催化下與H2室溫進(jìn)行氫化反應(yīng)24小時,得到4-(4-(4-(4-氨基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-乙酰氨基)-N、N-二甲基丁胺,所述鈀碳的物質(zhì)的量是4-(4-(4-(4-硝基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-乙?;?氨基N、N-二甲基丁胺的0.1倍;2)將1.2mmol 4,7,10-三(叔丁氧羰酰)-1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷-1-乙酸溶于5ml DMF中,再分別加入1.0、1.2倍于所述4,7,10-三(叔丁氧羰酰)-1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷-1-乙酸物質(zhì)的量的1-羥基苯并三氮唑(HOBt)和N,N-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC),室溫反應(yīng)24-26小時;過濾除去二環(huán)己基脲(DCU),保留濾液;
3)將2)所得濾液直接傾入1)中,室溫攪拌反應(yīng)24-26小時,過濾溶液,然后減壓蒸餾蒸出DMF,殘余物用硅膠H柱層析分離(洗脫液CH2Cl2∶CH3OH=3.5∶1)得淡黃色固體;4)將步驟3)中得到的淡黃色固體加入到4.5mmol HBr(濃度為57%)室溫解析18小時,脫除叔丁氧羰酰,然后在10mmol NaOH(40%)中解析,得到產(chǎn)物4-(4-(4-(4-1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷乙酰氨基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-乙酰氨基)-N、N-二甲基丁胺(C39H58N14O5)。
4、化合物的表征按常規(guī)方法對4-(4-(4-(4-1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷乙酰氨基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-乙酰氨基)-N、N-二甲基丁胺(C39H58N14O5)進(jìn)行了核磁共振氫譜和質(zhì)譜分析。結(jié)果如下氫譜1H NMR(DMSO-d6,300MHz)δ10.28(s,1H),9.98(s,1H),9.88(s,1H),8.19(s,1H),8.08(s,H),7.60(s,1H),7.28(s,1H),7.24(s,1H),7.19(s,1H),7.06(s,2H),6.84(s,H),4.06(s,3H),4.04(s,3H),4.01(s,3H),3.97(s,3H),3.56(b,16H),3.17(d,2H),2.27(t,2H),2.15(s,6H)1.67(t,2H)。
質(zhì)譜ESI-MS1103(M++1),1126(M++Na),1142(M++K);熔點(diǎn)205-206℃;元素分析(理論值)C58.38(58.34);H7.31(7.28);N24.48(24.42)。
實(shí)施例2、4-(4-(4-(4-1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷乙酰氨基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-乙酰氨基)-N、N-二甲基丁胺與Zn2+配合物切割Puc191)4-(4-(4-(4-1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷乙酰氨基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-乙酰氨基)-N、N-二甲基丁胺與Zn2+配合物的制備將1mmol 4-(4-(4-(4-1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷乙酰氨基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-乙酰氨基)-N、N-二甲基丁胺溶于4ml的無水甲醇中,將1mmol的高氯酸鋅(溶于3ml的無水甲醇)滴加到上述溶液中,生成白色沉淀,過濾干燥得到所述4-(4-(4-(4-1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷乙酰氨基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-乙酰氨基)-N、N-二甲基丁胺與Zn2+配合物。
2)切割Puc19
將1.695mg 4-(4-(4-(4-1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷乙酰氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-乙酰氨基)-N、N-二甲基丁胺與Zn2+配合物加入200μL高純水中,得到8mmol/L的切割試劑200μL。取0.4μL切割試劑(濃度為8mmol/L),2μL pBR322(濃度為1μg/μL),Tris-HCl緩沖液(Tris-HCl緩沖液的PH分別為7.22,7.40,7.60,7.80,8.00)37.6μL混合得到含切割試劑(濃度為0.08mmol/L)的切割體系。切割溫度為37-40℃,切割時間分別為15min、30min、45min,反應(yīng)完成后,進(jìn)行0.5%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定,結(jié)果分別如圖2、圖3和圖4所示,結(jié)果表明4-(4-(4-(4-1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷乙酰氨基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-乙酰氨基)-N、N-二甲基丁胺與Zn2+配合物對質(zhì)粒DNA(Puc19)的切割效果極好。在切割試劑濃度為80μM時,切割時間為15min就表現(xiàn)出明顯的切割效果,是目前世界上最好的切割試劑之一。圖2、和圖3中,泳道1、8為對照實(shí)驗(yàn),不含切割試劑,PH為8.00,泳道2-6分別為PH 7.22,7.40,7.60,7.80,8.00的Tris-HCl緩沖液。圖4中,泳道1、9為對照實(shí)驗(yàn),不含切割試劑,pH為8.00,泳道2-7分別為PH 7.22,7.40,7.60,7.80,8.00,8.2。
權(quán)利要求
1.一種大環(huán)多胺與聚酰胺綴合物,是具有下述式(I)結(jié)構(gòu)的4-(4-(4-(4-1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷乙酰氨基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-乙酰氨基)-N、N-二甲基丁胺。
2.一種制備4-(4-(4-(4-1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷乙酰氨基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-乙酰氨基)-N、N-二甲基丁胺的方法,包括以下步驟1)制備4,7,10-三(叔丁氧羰酰)-1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷-1-乙酸;2)將步驟1)中制備的4,7,10-三(叔丁氧羰酰)-1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷-1-乙酸溶于DMF中,再分別加入0.8-0.9倍于該化合物物質(zhì)的量的1-羥基苯并三氮唑和N,N-二環(huán)己基碳二亞胺,室溫反應(yīng)20-24小時;然后過濾除去二環(huán)己基脲,保留濾液;3)制備4-(4-(4-(4-氨基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-乙?;?氨基N、N-二甲基丁胺;4)向步驟2)所得濾液中,加入0.8-0.9倍于所述4,7,10-三(叔丁氧羰酰)-1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷-1-乙酸的物質(zhì)的量的4-(4-(4-(4-氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-乙?;?氨基N、N-二甲基丁胺,室溫反應(yīng)30-36小時,過濾,殘余物用硅膠H柱層析分離得淡黃色非晶形固體;5)向步驟4)所述淡黃色非晶形固體中加入5.0-6.0倍于步驟1)所述4,7,10-三(叔丁氧羰酰)-1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷-1-乙酸的物質(zhì)的量的HBr,室溫解析,脫除叔丁氧羰酰,再在5mL 40%NaOH溶液中解析得到產(chǎn)物4-(4-(4-(4-1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷乙酰氨基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-乙酰氨基)-N、N-二甲基丁胺。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法,其特征在于步驟1)所述的4,7,10-三(叔丁氧羰酰)-1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷-1-乙酸按以下步驟制備1)在冰浴下制備濃度為0.1M溴乙酸的甲醇溶液,0.1M的KOH的甲醇溶液逐滴滴加濃度為0.1M溴乙酸的甲醇溶液,得到0.05M溴乙酸的鉀鹽懸濁液,所述溴乙酸的甲醇溶液的體積與KOH甲醇溶液的體積相等,2)在濃度為0.5M的4,7,10-三(叔丁氧羰酰)-1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷甲醇溶液20ml中,加入碳酸鉀,所述碳酸鉀的物質(zhì)的量為所述4,7,10-三(叔丁氧羰酰)-1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷的3-5倍;然后冰浴下滴加步驟1)得到的溴乙酸鉀鹽懸濁液,該溴乙酸鉀鹽懸濁液物質(zhì)的量為所述4,7,10-三(叔丁氧羰酰)-1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷的1.2-1.5倍;室溫反應(yīng)4-6h后40-50℃反應(yīng)6-8h,溶液減壓蒸去溶劑后得到固體產(chǎn)物;3)將所得固體產(chǎn)物溶于蒸餾水中,用乙酸乙酯萃取,干燥,減壓濃縮溶劑;柱層析得白色固體產(chǎn)物。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法,其特征在于步驟3)中所述4-(4-(4-(4-氨基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-乙?;被?-N、N-二甲基丁胺按下述步驟制備1)N-甲基吡咯與其1-1.2倍物質(zhì)的量的CCl3COCl于室溫進(jìn)行?;磻?yīng),得到N-甲基-2-三氯己?;量?;2)N-甲基-2-三氯己?;量┡c分別是其1.1和0.09倍物質(zhì)的量的HNO3和H2SO4在-10℃進(jìn)行硝化反應(yīng),得到4-硝基-2-三氯己酰基-N-甲基吡咯;3)4-硝基-2-三氯己?;?N-甲基吡咯與1倍的NH2CH2CH2CH2CH2N(CH3)2室溫反應(yīng),得到4-(4-硝基-N-甲基吡咯-2-己酰)-氨基-N、N-二甲基丁胺;4)4-(4-硝基-N-甲基吡咯-2-己酰)-氨基-N、N-二甲基丁胺在10%的鈀碳催化下與H2在室溫條件下進(jìn)行氫化反應(yīng),得到4-(4-氨基-N-甲基吡咯-2-己酰)-氨基-N、N-二甲基丁胺,所述鈀碳的物質(zhì)的量是4-(4-硝基-N-甲基吡咯-2-己酰)-氨基-N、N-二甲基丁胺的0.05-0.15倍;5)4-(4-氨基-N-甲基吡咯-2-己酰)-氨基-N、N-二甲基丁胺與其0.8-1.0倍物質(zhì)的量的N-甲基-2-三氯己酰基-4-硝基吡咯于0℃反應(yīng),得到4-(4-硝基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-?;被?-N、N-二甲基丁胺;6)4-(4-硝基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-酰基氨基)-N、N-二甲基丁胺在10%鈀碳催化下與H2室溫進(jìn)行氫化反應(yīng),得到4-(4-氨基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-?;被?-N、N-二甲基丁胺,所述10%鈀碳的物質(zhì)的量是4-(4-硝基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-酰基氨基)-N、N-二甲基丁胺的0.10-0.15倍;然后再與1倍的PyPyCOOH、1倍的1-羥基苯并三氮唑和1.2倍的N,N-二環(huán)己基碳二亞胺所形成的活化酯于室溫反應(yīng)24小時,得到4-(4-(4-(4-硝基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-乙酰氨基)-N、N-二甲基丁胺;7)將4-(4-(4-(4-硝基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-乙酰氨基)-N、N-二甲基丁胺溶于1mMol DMF溶液,以10%鈀碳為催化劑,將其硝基氫化還原為氨基,過濾除去催化劑,濃縮濾液得到4-(4-(4-(4-氨基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-酰基)氨基-N-甲基吡咯-2-乙?;?氨基N、N-二甲基丁胺無色液體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法,其特征在于步驟7)中加入的所述4-(4-(4-(4-硝基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-乙?;?氨基N、N-二甲基丁胺1mmol可先溶于25ml DMF,其濃度可為0.04M。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法,其特征在于所述步驟2)中的4,7,10-三(叔丁氧羰酰)-1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷-1-乙酸在DMF中的濃度可為0.20-0.35M;所述羥基苯并三氮唑和N、N-二環(huán)己基碳二亞胺的物質(zhì)的量均與4,7,10-三(叔丁氧羰酰)-1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷-1-乙酸的物質(zhì)的量相等。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法,其特征在于所述步驟4)中硅膠H柱層析分離的洗脫液為CH2Cl2∶CH3OH=3.5∶1。
8.一種核酸切割試劑,其活性成分是4-(4-(4-(4-1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷乙酰氨基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-乙酰氨基)-N、N-二甲基丁胺的金屬配合物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的試劑,其特征在于所述金屬配合物的中心離子為Zn2+、Cu2+或La2+離子。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種大環(huán)多胺與聚酰胺綴合物及其制備方法與應(yīng)用,本發(fā)明提供的聚酰胺與大環(huán)多胺綴合物,是具有式(I)結(jié)構(gòu)的4-(4-(4-(4-1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷乙酰氨基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-?;?氨基-N-甲基吡咯-2-乙酰氨基)-N、N-二甲基丁胺,該綴合物的金屬配合物具有切割核酸的功能,本發(fā)明為進(jìn)一步合成DNA定點(diǎn)識別及切割試劑提供了良好的基礎(chǔ)和有效的途徑,具有重要意義。
文檔編號C08G69/00GK1560112SQ20041000476
公開日2005年1月5日 申請日期2004年3月5日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月5日
發(fā)明者趙玉芬, 喬仁忠, 張禎 申請人:清華大學(xué)