專利名稱：一種肝素及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明公開了一種肝素及其制備方法，屬一種生物藥品的制備方法。
肝素是天然抗凝藥，它的商品有肝素的鈉鹽稱肝素鈉，和肝素的鈣鹽，稱肝素鈣。10mg肝素在4小時內(nèi)能抑制500ml血漿凝固，臨床上廣泛用于各種外科手術(shù)前后防止血栓形成和栓塞，輸血時預(yù)防血液凝固和保存鮮血時的抗凝劑，小劑量時用于防治高血脂癥和動脈粥樣硬化。眾所周知，肝素廣泛分布于哺乳動物組織中，如腸粘膜，十二脂腸，肺、肝、胰臟、胎盤及血液中。肝素和大多數(shù)粘多糖一樣在體內(nèi)作為蛋白質(zhì)結(jié)合的復(fù)合物存在。這種復(fù)合物抗凝活性，而隨著蛋白去除其活性增加。傳統(tǒng)肝素鈉生產(chǎn)工藝，有從牛肺提取，產(chǎn)率低、工藝繁鎖，且最終產(chǎn)品達(dá)不到質(zhì)量要求。另外，從腸粘膜提取有從十六烷三甲基合溴化氨(CTAB)洛合工藝及乙醚用分液漏斗淬取方法，工藝繁鎖，收率少，不宜工業(yè)化生產(chǎn)。
本發(fā)明的目的是公開一種肝素及其制備方法，它具有簡化生產(chǎn)工序，產(chǎn)品質(zhì)量高并提高工業(yè)化生產(chǎn)能力。
本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，在提取工段中，注意到肝素在堿性介質(zhì)內(nèi)較為穩(wěn)定，且堿能打斷肝素與蛋白質(zhì)的結(jié)合，故組織內(nèi)肝素的提取都采用鈉鹽的堿性熱水或沸水浸提。這樣的提取物內(nèi)，仍存在可溶性肝素－蛋白質(zhì)復(fù)合物。本發(fā)明在將粗品肝素內(nèi)肝素－蛋白質(zhì)分解有兩類方法(1)酶解技術(shù)目前一般在提取時就加入蛋白質(zhì)水解酶，所使用的酶有細(xì)菌蛋白酶，胰蛋白質(zhì)酶、胰酶、胃蛋白酶和本瓜蛋白水解酶，(2)鹽解技術(shù)，鹽解一般是用堿性食鹽水提取與熱變性和凝結(jié)劑(明礬、硫酸鋁)等變性措施相結(jié)合，以除去蛋白質(zhì)。上述方法得到的產(chǎn)物仍含有其它粘多糖、核酸及未除盡的蛋白質(zhì)。本發(fā)明采用陰離子交換劑或長鏈季銨鹽進(jìn)行分級分離，再經(jīng)過有機(jī)溶劑分級沉淀和H2O2二次氧化，制得精品肝素。
一、酶解樹脂法1、工藝路線 2、工藝過程(按以下次序進(jìn)行)(1)酶解新鮮腸粘膜(總固體5-7％)，攪拌中加入絞碎的胰臟5-10kg(可用胰酶粉約0．5-1kg)用30-40％氫氧化鈉調(diào)pH8．5-9．0左右，升溫至40℃-50℃，保溫2-3小時，pH值應(yīng)保持在8．5-9．0。
加入50公斤粗鹽，升溫至90℃左右，用6N鹽酸調(diào)pH6．5左右，停止攪拌，保溫20分鐘，以布袋過濾。
(2)離子交換吸附，濾液冷至50℃以下，用6N氫氧化鈉調(diào)pH7．0加入50公斤D-254強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂，攪拌5小時左右，交換完畢，棄除液體。
(3)洗滌與洗脫，用自來水漂洗樹脂至水清。樹脂用2M氯化鈉(約樹脂體積的等量)攪拌洗滌15分鐘，棄去洗滌液，再用1．2M氯化鈉(約樹脂體積的兩倍)同法洗滌2次。
用3-5M氯化鈉(約樹脂體積的一半量)洗脫1小時，收集洗脫液，然后用3M氯化鈉(約樹脂體積的三分之一量)同法洗脫2次。合并洗脫液。
(4)乙醇沉淀用紙漿助濾，將洗脫液過濾一次，使達(dá)澄清。加入體積的0．9倍量95％乙醇，冷處沉淀8-12小時。虹吸上清液棄除，抽濾干或布袋吊濾干后加入95％乙醇洗2-3次抽干，60-80℃真空干燥，得肝素粗品。
(5)酸化按粗品∶水∶氯化鈉為7∶100∶1，加入純水和氯化物，將粗品投入反應(yīng)鍋內(nèi)后開動攪拌，使粗品完全溶解，同時使反應(yīng)鍋降溫到10℃，用6NHCL，調(diào)液體pH1．9，板框壓濾(硅藻土助濾)濾液調(diào)pH9．0-11．0。
(6)第一次氧化清液恒溫在25℃容器中，緩緩加入2％過氧化氫pH在9-11中保溫24小時，0．2μ微孔濾膜過濾后，0．8倍量95％乙醇沉淀過夜(5-10℃)。
(7)第二次氧化虹吸上清廢乙醇，沉淀物加入粗品重量10倍量的1％氯化鈉溶液中充分溶解后，冷卻10℃以下，用0．2μ微孔濾膜過濾后升溫至25℃，用5N氫氯化鈉調(diào)pH9-11，加入0．5-1．5％H2O2保溫24小時后再用0．2μ微孔濾膜過濾后，調(diào)pH4．0-7．00清液加入0．7倍量95％乙醇沉淀，靜置過夜。
(8)6小時后吸去肝素上層酒精清液，粗品重量6-10倍1％無熱原氯化鈉溶液中，溶解后，冷至10℃以下，用0．2μ微孔濾膜再過濾清清液加入0．7倍量95％乙醇沉淀，靜置過夜。
(9)次日虹吸廢乙醇后，沉淀物濾干，或吊濾干后用95％乙醇洗滌2-3次。
(10)成品進(jìn)入60-80℃，真空干燥箱，干燥24小時-36小時后進(jìn)行球磨，粉碎后得精品肝素170-180iu／mg，透光率達(dá)英國藥典PB98版標(biāo)準(zhǔn)。
二、鹽解樹脂法1、工藝路線 2、工藝過程(按以下次序進(jìn)行)1)提取取新鮮腸粘膜1000公斤，按3．3％加入食用鹽，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH8．8-9．0逐步升溫至50-55℃，保溫2小時，繼續(xù)升溫至95℃維持10分鐘，冷卻至60℃以下，用30目雙層布過濾，收集濾液。
2)吸附將備用的D-254樹脂按3-5％比例加入攪拌，吸附6小時，停止攪拌，棄除廢液，收集樹脂。用自來水漂洗樹脂洗清為止。
3)洗滌與洗脫，將漂洗清的樹脂，倒入缸內(nèi)，用1．3N氯化鈉溶液為樹脂量的1．5倍體積攪拌洗滌1小時，濾干后再用1．4N氯化鈉溶液洗滌一次，最后樹脂用3N氯化鈉攪拌洗滌2次，第一次為5小時，第二次2小時，第一次的量為樹脂1．5倍，第二次為樹脂的1倍，然后收集洗脫液。
4)乙醇沉淀，合并二次濾液，用紙漿助濾，將濾液過濾至澄清，加入體積的1倍量(V／V)95％乙醇沉淀過夜，虹吸上清液棄除，抽濾或者布袋吊濾干后，加入95％乙醇洗2-3次抽干，60-80℃真空干燥箱內(nèi)干燥，得肝素粗品。接下工序按照酶解工藝5-10條辦法進(jìn)行操作。
本發(fā)明能夠工業(yè)化生產(chǎn)中利用酸化后去除酸性雜蛋白再經(jīng)過的二次過氧化氫氧化技術(shù)所獲肝素產(chǎn)品經(jīng)××××藥品測試產(chǎn)品的單位效價始終保持在每毫克170國際單位以上，而中國藥典、歐洲藥典等都表達(dá)在每毫克150國際單位以上。精制的肝素溶解度、澄清度及在紫外光中的吸收度均達(dá)到國內(nèi)外優(yōu)級產(chǎn)品技術(shù)指標(biāo)；在波長280nm，OD值規(guī)定為0．20以下，而本發(fā)明的產(chǎn)品在0．060-0．080，在波長260nm，OD值規(guī)定為0．15以下，而本發(fā)明產(chǎn)品在0．040-0．050，本發(fā)明的操作過程中，(不受外因干擾)產(chǎn)品全部達(dá)到無菌、無熱原。特別是近年來，國外客商要求產(chǎn)品中的硫酸皮膚素含量必須小于3％以下，而本發(fā)明生產(chǎn)的肝素，其硫酸皮膚素含量僅在0．5％左右。
實(shí)施例1一、粗制工段2500千克新鮮腸粘膜投入反應(yīng)鍋內(nèi)，在不斷攪拌中加入豬胰酶粉12．5千克，用30-40％氫氧化鈉調(diào)pH8．0-8．5，升溫至45℃，保溫2-3小時。加入125千克食鹽，升溫至90℃用6N鹽酸調(diào)pH6．5±停止攪拌，保溫20分鐘，以布袋過濾，得清液約3000升，清液用6N氫氧化鈉調(diào)pH7．0，LKTY120千克D-254樹脂攪拌，吸附5小時，棄除液體，收集吸附后樹脂，用自來水漂洗清，樹脂用2M氯化鈉攪拌洗滌15分鐘，再用1．2M氯化鈉洗滌2次。洗脫改用5M氯化鈉65知攪拌洗脫1小時，收集洗脫液，再用5M氯化鈉40知洗脫半小時，收集濾液與攪拌洗脫1小時，收集洗脫液，再用1．2M氯化鈉洗滌2次。洗脫改用5M氯化鈉65升攪拌洗脫1小時，收集洗脫液，再用5M氯化鈉40升洗脫半小時，收集濾液與第一次合并約為100升，用布氏漏斗清后加入90升95％乙醇沉淀過夜，次日虹吸上清廢乙醇，沉淀物濾干后用95％乙醇洗1-2遍，進(jìn)入真空干燥箱60-80℃干燥24小時，得粗品肝素1050克，每毫克效價為102單位?？傂r為1．07億單位。
二、精制工段1050克粗品加入含1％氯化鈉溶液12升攪拌至充分溶解后，用6N鹽酸調(diào)pH1．9，板框壓濾收集清液11．5L，調(diào)pH9．0-11．0后加入230ml過氧化氫，25℃保溫24小時用0．2μ微孔濾膜濾后0．8倍量95％乙醇沉淀6小時后虹出廢濾，沉淀物加入10升無熱原水(含1％氧化鈉)溶解后，再用0．2μ微孔濾膜濾過，調(diào)pH9-11，升溫25℃加入115毫升過氧化氫保溫24小時后，過0．2μ微孔濾膜0．65倍95％乙醇沉淀，沉淀物進(jìn)行二次溶解過0．2μ微孔濾膜后，0．7倍95乙醇沉淀，靜置過夜，次日濾干沉淀物，用95％乙醇洗滌1-2次后進(jìn)入60-80℃真空干燥箱內(nèi)干燥36小時，進(jìn)行球磨粉碎后，得精品肝素581克，測效價173iu／毫克，總效價1．005億u。
實(shí)施例2一、粗制工段2500千克新鮮腸粘膜中，加入82．5千克食用鹽，用氫氧化鈉調(diào)pH8．8-9．0，逐步升溫至50-55℃保溫2小時。繼續(xù)升溫至95℃，維持10分鐘，冷卻到60℃以下，用雙層紗布過濾收集濾液約2600ml。然后加入D-254樹脂125千克，攪拌吸附6小時，停止攪拌，棄除廢液，收集樹脂，用水漂洗清；加入1．3N氯化鈉溶液190升攪拌洗滌1小時；濾干后用1．4N氯化鈉溶液190升攪拌洗滌，攪拌洗滌1小時后，濾干樹脂，加入190升3N氯化鈉攪拌洗脫5小時，收集濾液，樹脂再加入120升3N氯化鈉攪拌2小時，合并2次濾液310升后，加入95％乙醇310升攪拌10分鐘后，靜置過夜；次日虹吸上清液廢乙醇，沉淀物濾干后用95％乙醇洗1-2遍，進(jìn)入真空干燥箱60-80℃干燥24小時得粗品938克，單位效價105單位／毫克，總效價為0．985億單位。
二、精制工段精制工段操作同實(shí)實(shí)施例(1)粉碎后得精品肝素529克，測效價為176iu／mg，總效價為0．931追加單位。
本發(fā)明簡化了傳統(tǒng)生產(chǎn)技術(shù)，本發(fā)明所獲得的肝素質(zhì)量達(dá)到單位效價高，無菌、無熱原、無雜質(zhì)、透光率、收集率均達(dá)到國際國內(nèi)領(lǐng)先水平，且操作簡單，并適合于工業(yè)化生產(chǎn)，為生產(chǎn)肝素的一種新穎技術(shù)。
權(quán)利要求
1.一種肝素及其制備方法，肝素提取大多數(shù)可從牛肺；哺乳動物的肝臟，胸腺和牛、羊、豬的腸粘膜中提取，通過酶水解，或者鹽水解，用強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂分離后得到肝素粗品，酶解生產(chǎn)肝素粗品按以下次序工藝流程進(jìn)行腸粘膜在pH8．5-9．0條件下加入胰酶和氯化鈉升溫至40℃-50℃，保溫2-3小時后升溫到90℃，用6N氫氧化鈉調(diào)pH6．5，布袋過濾得清液，加入3-5％的D254樹脂攪拌吸附5小時，樹脂經(jīng)過洗滌后，洗脫出含肝素的粗品液用10．9倍量95％乙醇沉淀后，真空干燥得粗品肝素。鹽解生產(chǎn)肝素粗品按以下次序工藝流程進(jìn)行腸粘膜加入3．3％食用鹽、氫氧化鈉調(diào)pH8．8-9．0逐步升溫至50-55℃，保溫2小時，繼續(xù)升溫至95％，維持10分鐘冷卻至60℃，以下用30目雙層紗布過濾，收集濾液，再加入3-5％的D254樹脂攪拌吸附6小時，棄除廢液，樹脂用水漂洗后，經(jīng)過洗滌、洗脫，得含肝素液體，加入1倍量95％乙醇沉淀過夜，虹吸上清(棄除)，抽濾或布袋吊濾干后，加95％乙醇洗2-3次，進(jìn)60℃-80℃真空干燥箱內(nèi)干燥得肝素粗品，粗品肝素再進(jìn)行精制和純化，其特征在于精制純化經(jīng)過二次過氧化氫的氧化及有機(jī)溶媒的分級沉淀，其精制的工藝流程為粗品溶解于10-15倍量1％鹽水中加入6N鹽酸調(diào)pH1．0-2．0，在5℃-10℃條件下過濾出清液，調(diào)pH9．0-11．0加入0．5-1．5％H2O2升溫25℃并保溫24小時后，用0．2μ的微孔濾膜過濾后，0．8倍量95％酒精沉淀6小時后，虹吸出上清，沉淀物用1％氯化鈉鹽水溶解后再調(diào)pH9．0-11．0再加入1．5％H2O2升溫25℃，并保溫24小時后，用0．2μ的微孔濾膜過濾后，0．7倍量95％酒精沉淀6小時后，虹吸出上清，沉淀溶解于粗品重量6-10倍的1％無熱原氯化鈉溶解中，冷至10℃以下，用0．2μ微孔濾膜再將液體濾至澄清，清液加入0．7倍量95％酒精沉淀靜止過夜，次日吸出上清液，沉淀濾干后，95％乙醇洗滌1-2次后進(jìn)60℃-80℃真空干燥箱，干燥24-36小時后，球磨后得精品肝素。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肝素制備方法，其特征在于所述的肝素酸化，用6N鹽酸調(diào)pH1．7-2．0，最佳pH為1．9，以此來去除大量酸性蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肝素制備方法，其特征在于所述的肝素二次氧化，均采用過氧化氫方法，及控制的乙醇分級沉淀中掌握用量為0．8倍、0．7倍、0．7倍量，最好在第三次酒精加量為0．65倍量。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述肝素制備方法，其特征在于所述的粗品肝素的酶解工藝品中所用酶包含胰酶，胰臟，蛋白酶及肝素專用酶等，其粗品的質(zhì)量控制在80u／mg-100u／mg之間。
5.一種由上述權(quán)利要求肝素制備方法所獲得的肝素，其特征在于單位效價≥160iu／mg，可在160-180iu／mg之間；硫酸皮膚素檢出量≤0．5％，透光率280nm在≤0．08，260nm在≤0．06，400nm在≤0．018，420nm在≤0．015，470nm在≤0．010，產(chǎn)品為無菌、無熱原產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明為一種肝素及其制各方法,肝素的提取起始原料為腸粘膜,通過酶水解或者鹽水解得到含有肝素的溶液,再通過聚苯乙烯二乙烯苯三甲胺季胺型強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂吸附,洗滌,洗脫出肝素類粘多糖物質(zhì),本發(fā)明特征是此物質(zhì)經(jīng)過精制、純化操作最終得到精品肝素,采用有機(jī)溶媒的分級沉淀,從中分離出類肝素類其他粘多糖,如硫酸皮膚素等物質(zhì),再經(jīng)過二次過氧化氫氧化的精制操作。使最終精品肝素質(zhì)量達(dá)到單位效價高,無菌、無熱原、無雜質(zhì),透光率、收得率均達(dá)到國際國內(nèi)領(lǐng)先水平,且操作簡便,適合于規(guī)模生產(chǎn)。
文檔編號C08B37/10GK1283636SQ0012509
公開日2001年2月14日 申請日期2000年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2000年9月7日
發(fā)明者沙龍華, 金武 申請人:上?；莺Ｉ破窂S