專利名稱：單一聚合度的甘露糖醛酸的制備方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種有機(jī)聚合物，特別是涉及一種具有抗腫瘤活性的單一聚合度的甘露糖醛酸。
在一日本專利(06172375)中公開了一種用鮑魚丙酮粉提取物制備甘露糖醛酸的方法，該鮑魚丙酮粉提取物中含有甘露糖醛酸裂合酶。這是一種應(yīng)用酸水解和酶解制備聚合度2～7的寡聚甘露糖醛酸的方法，其分離效果不佳。
本發(fā)明的目的是提供一種制備過程簡單，分離效果好的單一聚合度的甘露糖醛酸的制備方法，并且該產(chǎn)品具有抗腫瘤活性，可用于開發(fā)抗腫瘤藥物。
一種單一聚合度的甘露糖醛酸的制備方法，包括使褐藻酸鈉溶于水，加入褐藻膠裂合酶進(jìn)行反應(yīng)，用沸水浴加熱使酶失活，離心后除去沉淀雜質(zhì)，將溶液調(diào)pH，離心除去產(chǎn)生的沉淀物，用堿液溶解并調(diào)pH，加入乙醇產(chǎn)生沉淀，干燥后用離子交換色譜柱分離各單一聚合度的甘露糖醛酸混合物，將甘露糖醛酸混合物用洗脫液洗脫，分步收集洗脫液組分，分別加入乙醇進(jìn)行沉淀，脫鹽后凍干，其特征是所述的將溶液調(diào)pH范圍為2.5～3.2，所述的洗脫液為醋酸鈉的梯度洗脫液，所用褐藻膠裂合酶是由弧菌產(chǎn)生的。
一種單一聚合度的甘露糖醛酸，其特征是具有抗腫瘤活性，用于開發(fā)抗腫瘤藥物。
本發(fā)明的制備方法分離效率高，制出的各種單一聚合度的甘露糖醛酸具有不同程度的抗腫瘤活性，可用于開發(fā)成抗腫瘤藥物。
下面通過實(shí)施例說明本發(fā)明。
取5g褐藻酸鈉溶于100ml水，加入5單位(褐藻膠裂合酶的酶活力單位為每min使0.2％的褐藻膠溶液吸光度增加1所需的酶量為一個(gè)酶活單位。)由弧菌產(chǎn)生的褐藻膠裂合酶液，該酶的生產(chǎn)方法己在00111178.7號在先申請中敘述過了。在28℃下反應(yīng)，直到230nm吸光值不再變化，然后沸水浴加熱使酶失活，冷卻后離心去雜質(zhì)，將上清液調(diào)pH2.85，離心去掉沉淀，用4mol/L的NaOH調(diào)pH到7，加入乙醇使產(chǎn)品沉淀，干燥后得到不同聚合度的甘露糖醛酸混合物。用Q-sepharose fast flow陰離子交換色譜柱分離各單一聚合度的甘露糖醛酸。色譜柱先用0.1mol/LpH7.5的醋酸鈉緩沖液起始洗脫液平衡好，再將1g上述制備的甘露糖醛酸溶于起始緩沖液上色譜柱，用0.1～1的醋酸鈉梯度洗脫液洗脫，用230nm的紫外檢測器檢測洗脫下來的甘露糖醛酸含量，分步收集各洗脫組分，脫鹽后分別加入乙醇沉淀出甘露糖醛酸，干燥后得到2～12不同聚合度的甘露糖醛酸。
采用本方法可以制備出聚合度為2～12的甘露糖醛酸。這些寡糖用高效陰離子交換色譜(high performance anion exchange chromatography HPAEC)檢測為單峰，說明為單一聚合度。
用噻唑藍(lán)(TTM)實(shí)驗(yàn)方法測定了用本發(fā)明的方法制備的各單一聚合度的甘露糖醛酸的抗腫瘤活性。實(shí)驗(yàn)時(shí)將癌細(xì)胞以10％小牛血清(FCS)的RPMI1640培養(yǎng)基配成104個(gè)/ml懸液，于37℃，5％CO2，100μl/孔(96孔板)撫育24h，各組對應(yīng)加三聚甘露糖醛酸，使其濃度分別為1，10，100ug/ml，空白組對應(yīng)加培養(yǎng)基，每組5個(gè)平行孔，培養(yǎng)24h后加入5mg/ml的TTM 20ul，培養(yǎng)4h，去上清液加150ul二甲基亞砜(DMSO)，用酶標(biāo)儀測定570nm，(630nm為設(shè)定波長)吸光值。所用的癌細(xì)胞株為Ovcar-3人卵巢癌細(xì)胞。用此方法測得三聚甘露糖醛酸100ug/ml的劑量時(shí)的抑瘤率為18.6％。其他各種聚合度的甘露糖醛酸也以此方法測定了抑瘤率，其結(jié)果類似。
權(quán)利要求
1.一種單一聚合度的甘露糖醛酸的制備方法，包括使褐藻酸鈉溶于水，加入褐藻膠裂合酶進(jìn)行反應(yīng)，用沸水浴加熱使酶失活，離心后除去沉淀雜質(zhì)，將溶液調(diào)pH，離心除去產(chǎn)生的沉淀物，用堿液溶解并調(diào)pH，加入乙醇產(chǎn)生沉淀，干燥后用離子交換色譜柱分離各單一聚合度的甘露糖醛酸混合物，將甘露糖醛酸混合物用洗脫液洗脫，分步收集洗脫液組分，分別加入乙醇進(jìn)行沉淀，脫鹽后凍干，其特征是所述的將溶液調(diào)pH的范圍為2.5～3.2，所述的洗脫液為醋酸鈉的梯度洗脫液，所述的酶是由弧菌產(chǎn)生的專一性褐藻膠裂合酶。
2一種單一聚合度的甘露糖醛酸，其特征是具有抗腫瘤活性，用于開發(fā)抗腫瘤藥物。
3如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述的甘露糖醛酸的單一聚合度分別為2～12。
全文摘要
一種單一聚合度的甘露糖醛酸的制備方法,包括使褐藻酸鈉溶于水,加入褐藻膠裂合酶進(jìn)行反應(yīng),用沸水浴加熱使酶失活,離心后除去沉淀雜質(zhì),將溶液調(diào)pH,離心除去產(chǎn)生的沉淀物,用堿液溶解并調(diào)pH,加入乙醇產(chǎn)生沉淀,干燥后用離子交換色譜柱進(jìn)行分離,用洗脫液洗脫,其特征是所述的將溶液的調(diào)pH范圍為2.5～3.2,所述的洗脫液為醋酸鈉的梯度洗脫液,所述的酶是由弧菌產(chǎn)生的專一性褐藻膠裂合酶。本產(chǎn)品是具有抗腫瘤活性,用于開發(fā)抗腫瘤藥物。
文檔編號C08B37/00GK1341665SQ00111368
公開日2002年3月27日 申請日期2000年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2000年9月7日
發(fā)明者管華詩, 劉巖, 江曉路 申請人:青島海洋大學(xué)