專利名稱：：治療性二核苷酸和衍生物的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及通過施用P1-(胞苷5’-)-P4-(尿苷5’-)四磷酸(CP4U)或其藥物學上可接受的酯、酰胺或鹽來提高殘存粘液分泌物的水合作用，刺激粘蛋白的產(chǎn)生，和提高纖毛擺動頻率，以增強分泌物清除的方法。
背景技術：
：美國有一千五百萬慢性阻塞性肺病(COPD)病人，而且它是導致死亡的第六大疾病。它的特征是，通過肺中粘液分泌的殘留，隨著時間的過去，導致進行性肺機能障礙。許多診斷為COPD的病人有被稱為慢性支氣管炎(CB)的疾病，而每年有600,000個病人因CB的急性惡化而住院。囊性纖維化(CF)和原發(fā)性纖毛運動障礙(PCD)是被假設為COPD的相似臨床癥狀的肺病例子。纖毛運動障礙，不論是原發(fā)性還是繼發(fā)性，都導致僅能通過咳嗽除去的殘存分泌物。由于粘纖毛清除機能減退，許多COPD病人用咳嗽來幫助清除殘存的分泌物。另一種以殘存粘液分泌物累積為特征的疾病狀態(tài)是竇炎。竇炎是典型的與上呼吸道感染相關的鼻竇炎癥。它能作為急性或慢性病發(fā)生。它是本國最常抱怨的保健問題，影響估計三千一百萬病人。(A.Moss和V.Parsons，國家健康統(tǒng)計中心，1986:66-7,DHHS出版號(PHS)86-1588(1985))。中耳炎(OM)是主要折磨3歲以下兒童的中耳病毒或細菌感染。它常常是由通過鼻咽和咽鼓管傳到中耳的上呼吸道感染引起的。每年為了診斷和治療OM大約有25,000,000-50,000,000例醫(yī)院探診。在3歲時，大約75％的兒童可能已得過一次急性OM(J.Klein.臨床感染性疾病19,823-33(1994))。用抗菌素適當治療后，中耳中仍剩有積液，導致聽覺損傷和可能的語言和認知發(fā)展延遲。提高清除中耳分泌物的能力可減少或根除中耳炎的顯著后遺癥。另一種以殘存分泌物為特征的疾病是肺炎。由于各種原因不活動的病人有得肺炎的極大危險。雖然對其特別警惕，而且進行了許多干預，每年仍有400,000個以上的病人患了具有顯著發(fā)病率和死亡率的肺炎。需要插管和機械性送氣的病人由于不活動和粘纖毛清除的降低，有患送氣相關肺炎(VAP)的額外危險。在每年患VAP的超過100,000人中，VAP死亡率可達50％以上。還有治療上需要提高淚腺系統(tǒng)引流的情況。當淚腺系統(tǒng)未正常工作時，結果可能是過度流淚(淚溢)，粘液膿性釋放和再發(fā)性淚腺炎。目前鼻淚管阻塞的治療方法大多是有傷害性的手術程序，而研究者們已開始尋找非傷害性藥物治療方法。淚分泌可通過和水合氣道上皮相似的P2Y2和/或P2Y4嘌呤受體-介導機制來從淚腺輔助組織中刺激出來。干眼病是由角膜前的淚膜不正常而產(chǎn)生的效果的通用術語，其特征是淚產(chǎn)生的減少或淚膜蒸發(fā)的加快，以及導致的眼表疾病?，F(xiàn)在，干眼病的藥物治療還局限在施用人工淚(鹽溶液)來臨時重新濕潤眼睛。然而，緩解是暫時的，需要頻繁滴加。正常的，粘液分泌物是通過粘纖毛清除(MCC)系統(tǒng)來除去的。MCC依靠三種成分的綜合作用1)杯狀細胞和粘膜下腺的粘液分泌；2)上皮細胞上的纖毛運動，其推動粘液掃過腔體表面；和3)伴隨控制水流入粘液的腔體上皮細胞離子運入或運出?，F(xiàn)在已知尿苷5’-三磷酸(UTP)等核苷磷酸介導MCC系統(tǒng)的所有成分。第一，已顯示在體外，UTP能提高杯狀細胞分泌粘液的速度和總量(M.Lethem等，美國呼吸道細胞分子生物學雜志，9,315-22(1993))。第二，已顯示在體外，UTP能提高人氣道上皮細胞纖毛擺動的頻率(D.Drutz等，藥物開發(fā)研究37(3),185(1996))。和第三，已顯示在體外，UTP能提高Cl-的分泌，和因此來自氣道上皮細胞的水分泌(S.Mason等，BrJ，Pharmacol.103,1649-56(1991))。另外，設想UTP引起Ⅱ型肺泡細胞釋放表面活性劑(Gobran.美國生理學雜志267,L625-L633(1994))對肺的最佳運轉有貢獻，而且可幫助使MCC最大化。已顯示由于P2Y2受體刺激磷酸酶C,UTP能提高胞內Ca++(H.Brown，等，分子藥物學，40,648-55(1991))。UTP對粘纖毛升降系統(tǒng)的所有成分的介導導致正常志愿者中肺粘纖毛清除的提高，而且沒有顯著副作用(K.Oliver.等，AmJ.Respir.Crit.CareMed.154,217-23(1996))。另外，UTP顯著增強了PCD病人中咳嗽清除(用咳嗽來除去殘存的分泌物)(P.Noone，等，AmJ.Respir.Crit.CareMed.153,A530(1996))。也已顯示二核苷酸，P1-P4-二(尿苷5’-)四磷酸，能提高正常健康志愿者中的痰產(chǎn)生的增加，表明MCC的增強。由于證明了UTP提高殘存粘液分泌物清除的能力，引起了申請人調查其它核苷磷酸來維持或提高療效而提高穩(wěn)定性。在該調查的過程中，發(fā)現(xiàn)CP4U，不像其它含胞苷的二核苷酸四磷酸C2P4，擁有對P2Y2和P2Y4受體驚人的能力。另外，觀察到如其在生物制備物中的穩(wěn)定性證明的，CP4U出乎意料的具有驚人的生物降解抗性。本發(fā)明根據(jù)CP4U生物穩(wěn)定性提高所引起的在呼吸道治療中的強大作用和持續(xù)性的提高。發(fā)明簡述公開了一種在需要治療的個體中通過水合粘液來增強分泌物清除，并提高纖毛擺動頻率的方法。該方法包含施給病人式Ⅰ的化合物式Ⅰ或其藥物學上可接受的鹽、酯或酰胺。還公開了式Ⅰ的化合物的新穎酯和酰胺。式Ⅰ的化合物是高度穩(wěn)定的，而且是P2Y2和/或P2Y4嘌呤受體的選擇性刺激劑；因此，它們可用于治療慢性阻塞性肺病如慢性支氣管炎、PCD、和囊性纖維化；它們還可用于治療有患肺炎危險的不活動病人。另外，由于它們清除殘存粘液分泌物和刺激纖毛擺動頻率的一般作用，本發(fā)明的化合物可用來治療竇炎和中耳炎。式Ⅰ的化合物還可用來促進有患肺癌、肺炎和其它感染性疾病的危險的病人吐出用于診斷的痰標本。另外，假定式Ⅰ的化合物能作為哮喘治療的助劑。它們還能通過清除肺的粘液分泌物來提高運動員的表現(xiàn)。式Ⅰ的化合物還可用于傷口愈合。發(fā)明詳述本發(fā)明提供了一種在需要該治療的人中清除殘存粘液分泌物并增強纖毛擺動頻率的方法。該方法包含施給病人式Ⅰ的化合物?；蚱渌幬飳W可接受的鹽、酯或酰胺。包括其鹽、酯和酰胺的式Ⅰ的化合物將在下文被稱為“本發(fā)明化合物”。本發(fā)明化合物包含藥物學上可接受的鹽，例如但不限于鈉或鉀等堿金屬鹽；鎂或鈣等堿土金屬鹽；錳鹽；或銨或四烷基銨鹽，即，NX4+(其中X是C1-4烷基)。藥物學上可接受的鹽是保留了母體化合物的所需生物活性，而沒有毒物學影響的鹽。本發(fā)明的鹽包含單-，二-三-和四-價陽離子，它們含有單一的陽離子或混合的陽離子。本發(fā)明還提供了本文公開的化合物的新穎?；幬锴绑w(如酯和酰胺)。本發(fā)明的優(yōu)選酯包括羧酸酯(其中酯基團的非羰基部分選自正丙基、叔丁基、正丁基等直鏈或支鏈烷基、烷氧基烷基(如甲氧基甲基)、芳烷基(如芐基)、芳氧基烷基(如苯氧基甲基)、和芳基(如苯基))；磺酸酯，如烷基-或磺酸芳烷酯(如磺酸甲酯)；氨基酸酯(如L-纈氨?；騆-異亮氨酰)；二羧酸酯(如半琥珀酸酯)。磷酸酯還可以被C1-20醇或2,3-二(C6-24)酰基丙三醇等進一步酯化。這些酯中任何烷基基團含有1到18個碳原子，具體是1到4個碳原子。含有3-18個碳原子的烷基基團可以是飽和或未飽和的。任何存在于這些酯中的芳基基團優(yōu)選包含被鹵素、C1-4烷基、C1-4烷氧基、硝基或羥基任選取代的苯基。本發(fā)明上文提到的藥物學上可接受的酰胺包括胞嘧啶氨基基團是酰胺形式的那些衍生物，例如NHCOR(其中R是C1-6烷基或芳基(如被鹵素、C1-4烷基、C1-4烷氧基、硝基或羥基取代的苯基)。本發(fā)明化合物是P2Y2和/或P2Y4嘌呤受體的高度選擇性刺激劑；因此，它們可用于治療包括人的患有慢性支氣管炎、急性支氣管炎、慢性支氣管炎急性惡化、PCD、囊性纖維化等慢性阻塞性肺病的哺乳動物，以及預防由于不活動引起的肺炎。在纖毛受到損傷或缺失的例子中，本發(fā)明化合物增強咳嗽清除。另外，由于它們清除殘存粘液分泌物和激發(fā)纖毛擺動頻率的一般作用，本發(fā)明的化合物也能用于治療哺乳動物，包括人中的急性或慢性竇炎和中耳炎。通過增強分泌物清除，化合物可用于在暴露于吸入性生物戰(zhàn)爭藥劑前后的預防。它們還能用于在獲得顯像之前清除肺分泌物來增強肺顯像。由于其驚人提高的生物穩(wěn)定性，本發(fā)明化合物提供了對于呼吸道治療作用的提高的持續(xù)性。該穩(wěn)定性的改善對治療急性和慢性呼吸道疾病都提供了有利之處。式Ⅰ化合物的酯和酰胺可用于治療干眼或視網(wǎng)膜剝離等眼科疾病。它們也可用來提高淚腺系統(tǒng)引流。雖然本發(fā)明化合物主要涉及治療人，但它們也可用于獸醫(yī)學目的，治療其它哺乳動物如犬、貓和馬。本發(fā)明化合物可經(jīng)口腔、局部、腸胃外，用吸入、噴霧、手術內、直腸或陰道給藥，以含有常規(guī)無毒藥物學可接受的載體、佐劑或載體的劑量單位配方施用。本文所用的術語“局部”包括貼劑、凝膠、霜、藥膏、液體沖洗劑或鼻、眼或耳滴劑。本文所用的術語“腸胃外”包括皮下注射、靜脈內、肌肉內、胸骨內注射或滴注技術。在本發(fā)明的另一個方面，提供了一種藥物學配方，其包含本發(fā)明的化合物和藥物學可接受的載體。一種或多種本發(fā)明化合物可與一種或多種無毒的藥物學可接受的載體或稀釋劑或佐劑，而如需要與其它活性成分共同存在。這些載體的一種是糖，其中化合物可通過玻璃化被緊密地結合在基質中，或簡單與載體混合(如乳糖、蔗糖、海藻糖、甘露醇)或其它肺或氣道傳遞的可接受成分。本發(fā)明的化合物可單用或和DNAse或乙酰半胱氨酸等粘液水解酶一起，或與放射標記的物質一起施用。含有本發(fā)明化合物的藥物組合物可以是適合口服的形式，例如片劑、錠劑、水或油懸液、可分散粉末或顆粒、乳劑、硬或軟膠囊、或糖漿或酏劑。用于口服的組合物可根據(jù)任何本領域已知的制備藥物組合物的方法制備，而且這些組合物可含有一種或多種選自甜味劑、調味劑、著色劑和防腐劑的藥劑，來提供藥物學上一流和可口的制品。片劑含有混合了適于片劑生產(chǎn)的無毒性藥物學上可接受賦形劑的活性組分。這些賦形劑可以是例如碳酸鈣、碳酸鈉、乳糖、磷酸鈣或磷酸鈉等惰性稀釋劑；玉米淀粉或藻酸等成粒劑和崩解劑；淀粉、明膠和阿拉伯樹膠等粘合劑；和硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石等潤滑劑。片劑可以是未包衣或可通過已知技術包衣，來延遲崩解和胃腸道中的吸收，因而提供了在一段長時期內的持續(xù)作用。例如，可使用甘油一硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯?？诜浞竭€可作為硬明膠膠囊存在，其中將活性成分和諸如碳酸鈣、磷酸鈣或高嶺土等惰性固相稀釋劑混合，或作為軟明膠膠囊存在，其中將活性成分和水或油如花生油、液態(tài)石蠟或橄欖油等基質混合。水性配方含有與適于生產(chǎn)的賦形劑混合的活性材料。這些賦形劑是懸浮劑，如羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素和藻酸鈉。分散劑或濕潤劑可以是天然存在的磷脂或丙炔化氧和脂肪酸的縮合產(chǎn)物，或環(huán)氧乙烷和長鏈脂肪醇的縮合產(chǎn)物，或環(huán)氧乙烷與衍生自脂肪酸和己糖醇部份酯的縮合產(chǎn)物，或環(huán)氧乙烷與衍生自脂肪酸和己糖醇酐的部份酯的縮合產(chǎn)物。本領域的技術人員將認識到包含于上文一般描述的許多特異性賦形劑和濕潤劑。水性配方還可含有一種或多種防腐劑，如對-羥基苯甲酸乙酯或正丙酯，一種或多種著色劑，一種或多種調味劑和一種或多種甜味劑，如蔗糖或糖精。用于通過加水制備水相混懸劑的可分散粉末和顆粒提供了活性成分與分散劑或濕潤劑、懸浮劑和一種或多種防腐劑的混合物。上文已提到的例子示范性說明了合適的分散劑或濕潤劑和懸浮劑。也可存在其它賦形劑，如甜味、調味和著色劑。本發(fā)明的化合物可以在滅菌基質中腸胃外施用。由所用載體和濃度而定，可使藥物懸浮或溶解在載體中。有利的，局部麻醉劑、防腐劑和緩沖劑等輔助劑也可溶在載體中。無菌注射制品可以是在無毒性胃腸外可接受的稀釋劑或溶劑中的無菌注射溶液或懸液。在可使用的可接受的載體和溶劑中有無菌水、鹽溶液或林格氏溶液。本發(fā)明化合物可以用給藥于耳內、直腸內或陰道內施用的栓劑形式施用?？赏ㄟ^將藥物和合適的無刺激賦形劑(在常溫下是固體而在體溫下是液體而且因此可在體內融化來釋放藥物)混合來制備組合物。這樣的材料是可可油和聚乙二醇?？赏ㄟ^手術內裝置，用沖洗、灌洗、局部用、注射或其它本領域技術人員已知的方法來施用本發(fā)明化合物的溶液。為了治療呼吸道疾病，可用從大約10-7M到大約10-1M，優(yōu)選10-5M到10-3M的濃度水平，或大約1-400mg劑量。為了眼科和竇用途，可用0.1到10.0％濃度?？梢院洼d體物質混合生產(chǎn)單劑量劑型，其活性成分用量將視治療的宿主和施藥的具體模式而變化。然而可以理解，任何具體病人的特定劑量水平是由包括具體化合物的活性、年齡、體重、健康狀況、性別、飲食、施藥時間、施藥途徑和吸收、分散、代謝和排泄速率、聯(lián)用的藥物、以及經(jīng)治療的具體疾病類型和嚴重程度在內的各種因素而定的?？赏ㄟ^例如但不限于羰基二咪唑或二環(huán)己基碳二亞胺等縮合劑的活化使尿苷單-，二-，或三磷酸和胞苷單-，二-，或三磷酸縮合來形成所要的二核苷酸四磷酸(P1-(胞苷5’-)-P4-(尿苷5’-)四磷酸)；或通過縮合相似活化的胞苷單-，二-，或三磷酸和尿苷單-，二-，或三磷酸來制備本發(fā)明包括的化合物。類似程序得到(P1-(胞苷5’-)-尿苷5’-)四磷酸的N4-酰胺衍生物。用作起始材料的核苷磷酸可以是商業(yè)可購得的(Sigma)，也可以是通過本領域技術人員熟知的方法從相應的核苷制備的。相似的，當核苷不是商業(yè)可購得的，它們可通過修飾其它可購得的核苷，或通過從雜環(huán)或糖前體用本領域技術人員熟知的方法合成。本領域技術人員將認識到，可使用其它合成方法來制備式Ⅰ化合物的藥物學上可接受的鹽和?；幬锴绑w。因此，可利用陽離子交換樹脂來制備鹽?？捎美鐚⑺牧u基或氨基化合物和合適的酸(用羰基二咪唑、二環(huán)己基碳二亞胺或其它合適縮合劑活化)，或和具有或不具有叔胺、季銨鹽或無機堿等堿性催化劑的酸酐或酰氯反應來制備酯或酰胺。本領域技術人員將認識到，如下文實施例證明的，可以改變起始材料并使用額外的步驟來產(chǎn)生本發(fā)明包含的化合物。在一些情況下，某些反應官能團的保護對實現(xiàn)一些上文的轉化是必需的。一般的，對有機合成領域技術人員來說，對這些保護基團的需要，以及對結合和除去這些基團的條件是清楚的。下文實施例將進一步說明本發(fā)明，但不用來將本發(fā)明范圍限制在其描述的具體程序的范圍和精神內。實施例1P1-(胞苷5’-)-P4-(尿苷5’-)四磷酸，季銨鹽的制備通過將尿苷5’-單磷酸的游離酸(Sigma)(3.0g)和三丁基氨(2.0mL)溶于DMF來制備尿苷5’-單磷酸三丁基銨鹽的0.34M溶液。將尿苷5’-單磷酸三丁基銨鹽的無水DMF溶液(5.6ml，1.89mmol,0.34M)在N2下加到10ml圓底燒瓶中，并加入羰基二咪唑(459mg,2.83mmol)，將溶液在25℃攪拌30分鐘。加入由胞苷5’三磷酸三鈉鹽用Dowex50H4樹脂處理，然后加入用DMF中的三丁基胺處理制備的胞苷5’-三磷酸三丁基銨鹽的DMF溶液，將反應混合物在65℃攪拌3小時。真空蒸發(fā)溶液，并用柱層析純化兩次(DEAESephadex:H2O→0.3MNH4HCO3梯度)。35℃真空濃縮純組分，加入H2O，重新蒸發(fā)10次，獲得白色固體(203mg):1HNMR(D2O,TMS)δ4.1(m,br,6H),4.2(m,4H),5.8(m,3H),5.95(m,1H),7.7(m,2H):31PNMR(D2O,H3PO4std)δ-22.4(m,2P),-10.6(m,2P)；C18H26N5O22P4(M-H)的準確質譜計算值=788.0020，測量值787.9985。實施例2P1-(胞苷5’-)-p4-(尿苷5’-)四磷酸，季銨鹽的制備將溶于水(5mL)的尿苷5’-三磷酸(UTP)三鈉鹽(5.86g,0.01mol)溶液放在BioRadAG-MP50強陽離子交換樹脂柱(以其吡啶鹽形式)(50ml床體積)上，并用蒸餾水(大約300mL)洗脫入含有三丁基胺(5.55g,0.03mol)的燒瓶中。將懸液和乙醇一起振蕩，并將混合物放在冰箱中過夜。過濾溶液，來除去少量油狀殘余物，減壓蒸發(fā)至干，使剩余物在0.08mmHg，室溫下干燥1小時。用2×20mL無水二甲基甲酰胺(DMF)在0.1mmHg下蒸發(fā)干燥剩余物。用無水丙酮將得到的無水三丁基銨鹽補充到100mL，得到儲備溶液(UTP中0.1M)。將二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)(Baker,1.0g,5.0mmol)加到一部分前面的UTP溶液(10mL,1mmol)中，將溶液在室溫下攪拌30分鐘。用過濾除去沉積的二環(huán)己基脲，用正己烷(100mL)抽提反應混合物，并將剩余物溶解在含重氫的無水二甲基亞砜(DMSO-d6,3.0mL)。將該尿苷5’-環(huán)偏磷酸(UcTP)加到胞苷5’-單磷酸(CMP)的三丁基銨鹽(通過將三丁基胺(0.714mL,3mmol)加到CMP游離酸(Sigma,0.65g,2mmol)中)，50℃攪拌該懸液24小時制備。高真空下蒸發(fā)反應混合物過夜，將剩余物溶解在水中(5mL)，通過半制備性離子交換層析(HamiltonPRPX-100柱，用等度1.0M碳酸氫銨，8mL/min,30min洗脫，500微升多次注射)分離。31和37分鐘之間洗脫出來的二核苷酸四磷酸含有該產(chǎn)物的組分用水重復蒸發(fā)，并將剩余物凍干來得到白色固體的標題化合物(59mg)。1HNMRD2O,δppm(來自四甲基硅烷)4.10-4.13(m,6H)4.17-4.26(m,4H)；5.815(d,J=7.8Hz,1H)；5.82(d,J=5.0Hz,2H)；6.082(d,J=7.7Hz,1H)；7.80(d,J=7.8Hz,1H)；7.91(d,J=8.2Hz,1H)。31PNMR(D2Oδppm(來自H3PO4):-22.45(m,2P)；-10.80(m,2P)。實施例3通過肌醇磷酸含量測定測量的藥理測定學活性通過對P2Y2和其它P2Y受體活性的肌醇磷酸試驗表明了本發(fā)明化合物的藥物學利用性。此為E.Lazarowski等，英國藥物學雜志，116,1619-27(1995)描述的廣泛使用的含量測定方法，將肌醇磷酸形成作為測量通過G-蛋白將化合物活化受體和磷脂酶C連接的活力的標準。用E.Lazarowski等，英國藥物學雜志，116,1619-27(1995)描述的肌醇磷酸測定測試了式Ⅰ化合物誘導P2Y1、P2Y2、P2Y4和P2Y6受體活性的活力。對于CP4U和所有含胞苷的二核苷酸C2P4的結果總結在下文表Ⅰ。表Ⅰ活性總結EC50’s(μmol)<tablesid="table1"num="001"><table>化合物P2Y1P2Y2P2Y4P2Y6C2P4IA*IA*IA*IA*CP4UIA*0.450.653.5</table></tables>*IA=無活性(即30μM時無刺激劑活性)在該試驗中，CP4U和所有胞苷二核苷酸類似物C2P4比較，顯示了對P2Y2和P2Y4受體的驚人活性。實施例4體內氯化物分泌的誘導促進疾病(病人將從運動和清除這些分泌物中獲益)中增厚的氣道粘液分泌物的水合作用。頂端非-CFTR氯通道的活化誘導氯離子和水流出，來幫助重新水合肺分泌物(Boucher，美國專利號5,292,498和Boucher等，美國專利號5,635,160和其中的參考文獻)。人鼻氣道細胞中的氯化物分泌從新鮮切下的人鼻手術標本上去隔離并分離氣道上皮細胞(Yankaskas等，Am.Rev.Respir.Dis.132,1281-1287(1985))。將匯合單層培養(yǎng)在補充有F-12激素的培養(yǎng)基(Wu等，Am.Rev.Respir.Dis.132,311-320(1985))中的可滲透性膠原基質載體上。37℃培養(yǎng)細胞使其匯合。監(jiān)視經(jīng)上皮電阻的發(fā)展來測定細胞間緊密連接的形成。在肯定緊密連接形成后，將含有培養(yǎng)物的基質載體放在在改良Ussing室中。將培養(yǎng)的人氣道上皮和Krebs二碳酸Ringer[KBR(mM)140Na+,120Cl-5.2K+,25HCO3-,2.4HPO2-4,0.4HPO4-,1.1Ca2+,1.2Mg2+，和5.2葡萄糖]的粘膜下層浴放在Ussing室中。用KBr或高K+，低Cl-(HKLC)Ringers[(mM)40Na+,100K-,4.5Cl-，120葡萄糖酸酯,25HCO3-,2.4HPO2-4,0.4HPO2-4,1.1Ca2+,1.2Mg2+,和5.2葡萄糖]浸泡腔表面。研磨聚碳酸酯Ussing室，來使之適合支持細胞生長的可滲透膠原質基質的塑料杯。監(jiān)視了包括Isc，透皮電位差異和電阻的生物電性質。用數(shù)字式電壓表(UNCElectronics,ChapelHill,NC)測量了短路電流(Isc)，并繪在長圖記錄儀上。定期記錄開路電位，在電壓夾模式下，通過響應10mV電壓脈沖的電流偏差監(jiān)視電導。記錄了穩(wěn)定的Isc基線，將氨氯吡咪(100μM)加到浸泡頂端表面的溶液中，來阻斷鈉吸收。這些條件下測量到的余量Isc是氯化物分泌的良好估計(Boucher等，J.Clin.Invest.78,1245-1252(1986)；Willumsen等，Am.J.Physiol.256,C226-233,C1033-1044,C1045-1053(1989))。在記錄了穩(wěn)定基線后，將試驗化合物的溶液加到浸泡上皮培養(yǎng)物頂端表面的室中。記錄Isc的改變。通過以0.5對數(shù)步驟累積加入更高濃度的試驗化合物獲得了對應濃度的曲線。實施例4的圖Ⅰ顯示了人鼻上皮細胞中當在細胞表面培養(yǎng)基中加入U2P4或CP4U時，氯離子擴散電位的改變(ΔIsc，短路電位的改變)。結果顯示在氯化物分泌測定中，CP4U大約比所有含尿苷的二核苷酸U2P4強10倍。圖Ⅰ測試了式Ⅰ化合物(CP4U)抵抗存在于培養(yǎng)人支氣管(氣道)上皮細胞被酶代謝的能力，并將結果和二核苷酸U2P4(P1,P4-二(尿苷5’-)四磷酸)和核苷三磷酸，UTP(尿苷5’-三磷酸)比較。使上皮細胞在ALⅠ-培養(yǎng)液的氣-液界面上長成單層。對完全分化的細胞在KRB-Ringer溶液(pH7.2)中37℃用0.1mM核苷酸底物進行測定。在5,10,15,20,40和60分鐘時取出氣道表面液體的等分部分。通過煮沸和過濾該部分來停止代謝，用高效液相層析來分析樣品，使用下列條件C-18柱用55分鐘10-100mMKH2PO4梯度和穩(wěn)定的8mM四丁基硫酸氫銨和10％甲醇。圖Ⅱ中表示了結果。式Ⅰ的化合物CP4U，顯示了和其它核苷酸，UTP和U2P4比較，出乎意料的穩(wěn)定性。CP4U在60分鐘內不被代謝。而UTP和U2P4分別被降解100和40％。圖Ⅱ人支氣管上皮細胞水解CP4U,U2P4和UTP的相對速率在動物模型中測試了本發(fā)明主題的化合物(L.Allegra等，應用生理學雜志，55(3)726-730(1983)；J.R.Sabater等，Am.Respir.Crit.Care.Med.,154,341-345(1996))。當和載體對照比較時，霧狀化合物刺激了氣管粘液速率(TMV)。TMV是一根大氣管中粘纖毛清除的量度。現(xiàn)已用完整、清楚、精確的術語描述了本發(fā)明和制造與使用它的方式和過程，從而使本領域任何與之有關的技術人員能制造和使用它?？衫斫獾氖?，可不違背如權利要求中列出的、本發(fā)明的精神和范圍來產(chǎn)生本發(fā)明的前述優(yōu)選例及其變體。為具體指出并清楚要求作為發(fā)明的主體，權利要求概括了本說明書。權利要求1．一種在需要治療的哺乳動物中增強分泌物清除并提高纖毛擺動頻率的方法，其特征在于，該方法通過給該哺乳動物式Ⅰ施用化合物式Ⅰ或其藥物學上可接受的鹽、酯或酰胺。2．一種在哺乳動物中治療慢性阻塞性肺病的方法，其特征在于，該方法通過施用有效量的權利要求1中所述的式Ⅰ化合物來增強分泌物清除和除盡。3．一種在哺乳動物中治療急性和慢性竇炎的方法，其特征在于，該方法通過施用有效分泌物清除量的權利要求1中所述的式Ⅰ化合物。4．一種在哺乳動物中促使吐出深部痰標本的方法，其特征在于，該方法通過施用對促使樣品吐出有效的一定量的權利要求1中所述的式Ⅰ化合物。5．一種增強咳嗽清除的方法，其特征在于，該方法通過施用有效量的權利要求1中所述的式Ⅰ化合物。6．一種增強肺顯像的方法，其特征在于，該方法通過在獲得顯像前，施用對從肺清除分泌物有效的一定量的權利要求1中所述的式Ⅰ化合物。7．一種預防肺炎的方法，其特征在于，該方法通過施用對增強分泌物清除有效的一定量的權利要求1中所述的式Ⅰ化合物。8．一種治療中耳炎的方法，其特征在于，該方法通過施用有效量的權利要求1中所述的式Ⅰ化合物。9．一種增強清除吸入的生物戰(zhàn)爭藥劑的方法，其特征在于，該方法通過施用有效量的權利要求1中所述的式Ⅰ化合物。10．一種治療干眼病的方法，其特征在于，該方法通過施用有效量的權利要求1中所述的式Ⅰ的酯或酰胺。11．一種治療視網(wǎng)膜剝離的方法，其特征在于，該方法通過施用有效量的權利要求1中所述的式Ⅰ的酯或酰胺。12．一種藥物組合物，其特征在于，該藥物組合物包含權利要求1中所述的式Ⅰ化合物或它的藥物學可接受的鹽、酯或酰胺，以及藥物學上可接受的載體。13．一種權利要求1中所述的式Ⅰ化合物的酰胺，其特征在于，該酰胺選自胞嘧啶氨基是NHCOR的衍生物，其中R是C1-6烷基、苯基或被鹵素、C1-4烷基、C1-4烷氧基、硝基或羥基取代的苯基。14．一種權利要求1中所述的式Ⅰ化合物的酯，其特征在于，該酯選自正丙基、叔丁基、甲氧基甲基、芐基、苯氧基甲基、苯基、磺酸甲酯、L-纈氨酰、L-異亮氨?；虬腌晁狨?。15．P1-(胞苷-5’-)-P4-(尿苷5’-)四磷酸季銨鹽。全文摘要本發(fā)明涉及P文檔編號C07H19/207GK1301168SQ99806423公開日2001年6月27日申請日期1999年5月19日優(yōu)先權日1998年5月22日發(fā)明者B·R·葉克,W·彭德格斯特,J·L·里德烏,M·皮徹,R·C·鮑徹,M·J·斯塔茨申請人:印斯拜爾藥品股份有限公司,北卡羅來納州大學查珀爾希爾分校