專利名稱：肝靶向性高糖密度半乳糖基干擾素偶聯(lián)物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一類通過分枝橋試劑，使干擾素(一種藥用蛋白質(zhì))分子中每一個可偶聯(lián)的位點(通常是游離的氨基)連接上2-5個半乳糖基，從而形成高糖密度的半乳糖基干擾素偶聯(lián)物。在機體內(nèi)，該偶聯(lián)物顯示出顯著的肝靶向特征。
通過系統(tǒng)的文獻檢索和查新，尚未查見本發(fā)明化學(xué)結(jié)構(gòu)類型的半乳糖基干擾素偶聯(lián)物目前，查見相關(guān)的文獻和專利報道如下[1]鐘裕國等 肝靶向性的半乳糖基干擾素偶聯(lián)物中國發(fā)明專利申請公開說明書 申請?zhí)?311196公開號CN1087093A
公開日1994年5月25日[2]濱口直等 糖基化細胞素中國發(fā)明專利申請公開說明書 申請?zhí)?3117879.7開號CN1087916A
公開日1994年6月15日[3]管昌田等 半乳糖基干擾素的合成及其肝靶向性研究中華核醫(yī)學(xué)雜志1996，11(2)234[4]鐘裕國等 肝靶向半乳糖基干擾素的合成及其生物學(xué)性質(zhì)研究中國藥物化學(xué)雜志 1995，5(3)164-8[5]鐘裕國等 肝靶向半乳糖基細胞色素C的合成及其肝靶向性研究華西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報1996，27(2)130-3[6]管昌田等 以NGA作為肝靶向藥物載體的可行性研究中華核醫(yī)學(xué)雜志1992，12(2)166-8文獻[1]，[2]兩個專利其半乳糖基干擾素偶聯(lián)物的結(jié)構(gòu)均為干擾素分子中可偶聯(lián)位點連接上1個半乳糖基，與本發(fā)明在結(jié)構(gòu)和功能上均有顯著的差異；文獻[3][4][5][6]是發(fā)明人為本發(fā)明進行的基礎(chǔ)研究和方法學(xué)研究，未公開發(fā)表本發(fā)明專利的內(nèi)容。
八十年代國外學(xué)者證實僅存在于哺乳動物肝細胞膜上的肝結(jié)合蛋白(HBP)是無唾液酸糖蛋白的受體(ASGPR)。將人白蛋白用半乳糖基修飾后所得的半乳糖基白蛋白(NGA)，為一人工合成的ASGPR的配體，呈典型的配體——受體識別，并具有配體——受體結(jié)合的全部生物學(xué)特征，國外將NGA用為肝靶向藥物的載體。
干擾素是人體內(nèi)原性細胞素，為一分子量為1.6萬左右的活性蛋白，具有抗病毒和抗腫瘤等多種生物活性，為當今公認的對乙型、丙型病毒性肝炎進行病因性治療的首選藥物。由于注射給藥后隨血循環(huán)自然分布，轉(zhuǎn)運到肝臟的僅有注入劑量的5-7％，要對肝細胞內(nèi)的肝炎病毒發(fā)生藥效，要求大劑量(300萬單位/天)長時間(三個月)的藥物治療，因而醫(yī)療費用高昂，副反應(yīng)增多，其療效不夠理想(病毒陰轉(zhuǎn)率僅有30％左右)。
本發(fā)明者在國內(nèi)首次進行了肝靶向干擾素的研究用化學(xué)方法，將半乳糖基連接在人白細胞干擾素(INF-α)，基因工程干擾素(rINF α)蛋白分子上，使之具有ASGPR配體和保留INF活性的兩重生物學(xué)特性。研究結(jié)果表明，所制備的半乳糖基干擾素偶聯(lián)物(Gal-INF-α，Gal-rINF-α1)其肝臟分布率為注入劑量的20-25％，抗病毒活性較未進行半乳糖修飾的原料干擾素提高了2-3倍。這種糖密度為2-3的偶聯(lián)物，盡管肝靶向性較之原料干擾素已提高了2-3倍，但仍不夠理想，從發(fā)明人的基礎(chǔ)研究中獲知，如將糖密度提高到8-12，肝臟分布率可望達到30-50％。
鑒于干擾素分子中，半乳糖修飾的可結(jié)合點(游離氨基)有限，為了提高糖密度，發(fā)明者設(shè)計并合成了可連接多個半乳糖的分枝橋試劑(M1，M2，M3，M4)，并與干擾素(rINFα1，rINF-α2b)進行偶聯(lián)，通過純化分離和生物學(xué)特性研究實驗，所制備的雙半乳糖基干擾素(2Gal-rINFα2b，T1)蛋白電泳單帶，糖密度＝10，肝臟分布率30-35％。
本發(fā)明的目的在于提供一類連接上2-5個半乳糖的分枝橋試劑與干擾素偶聯(lián)形成高糖密度的半乳糖基化干擾素偶聯(lián)物，該偶聯(lián)物具有顯著的肝靶向性。進一步開發(fā)成為病毒性肝炎的治療藥物，將會減少干擾素的用藥劑量、增強療效，降低不良反應(yīng)，節(jié)省醫(yī)療費用，這對乙型、丙型肝炎的臨床治療，可望取得突破性效果。
本發(fā)明為一種在芳環(huán)分枝橋和脂鏈分枝橋的兩端，分別以甙鍵、肽鍵、亞氨酯鍵偶連不同分子數(shù)的半乳糖和干擾素而制備的高糖密度半乳糖基干擾素偶聯(lián)物，該偶聯(lián)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)通式如下。
G＝M1，M2，M3，M4X＝O，NHn＝2-6INF＝rINFα2b，rINFα1G為半乳糖分枝橋試劑，其中M1為雙糖芳環(huán)橋試劑，M2為雙糖脂鏈橋試劑，M3為三糖脂鏈橋試劑，M4為芳環(huán)芳環(huán)橋試劑，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下
上述試劑M1，M2，M3，M4分別與r-INFα1、r-INFα2b偶聯(lián)經(jīng)純化后，分別得高糖密度乳糖基干擾素偶聯(lián)物T1T2T3T4，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如下
本發(fā)明目標物的制備方法如下芳環(huán)分枝橋類型選合成分枝糖試劑M1，偶聯(lián)干擾素制備目標物T1為例。
雙半乳糖芳環(huán)分枝橋試劑M1的合成用3，5-二羥基苯甲酸為起始原料與6-氨基己酸甲酯縮合，得3，5-二羥基苯甲酰甲氧羰基己胺，再用二溴乙烷烴化羥基后與硫代半乳糖試劑結(jié)合得M1。
雙半乳糖芳環(huán)橋干擾素偶聯(lián)物T1的制備將M1用甲醇——甲醇鈉溶液水解后，蒸去甲醇，殘留物溶于pH＝8的磷酸緩沖溶液中，加入rINFα2b和縮合劑EDC，待縮合反應(yīng)完成后，將反應(yīng)液透析至透析外液無糖檢出，無菌過濾，冷凍干燥得T1。具體工藝條件及操作過程見實施例1。
脂鏈分枝橋類型選合成分枝糖試劑M2，偶連干擾素制備目標物T2為例。
雙半乳糖脂鏈橋試劑M2的合成用丙二酸二乙酯為起始原料，經(jīng)縮合、環(huán)化、脫羧還原、加成、開環(huán)、碘代等七步得二碘物，再與硫代半乳糖試劑縮合得M2。
雙半乳糖脂鏈橋干擾素偶聯(lián)物T2的制備將M2置于甲醇——甲醇鈉溶液中醇解得亞氨基酯，用氮氣揮去甲醇，殘留物溶于磷酸緩沖液中，加入rINFα1待縮合反應(yīng)完成后，將反應(yīng)液透析至透析外液無糖檢出，無菌過濾，冷凍干燥得T2。
本發(fā)明目標物的純度、糖密度和肝靶向性測檢(用目標物T1為例)純度與糖密度檢測采用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法對雙半乳糖基干擾素偶聯(lián)物(2Gal-rINFα2b即T1)(圖1標示A)和原料rINFα2b(圖1標示B)和標準分子量蛋白(圖1標示C)進行電泳。結(jié)果見電泳圖(圖1)，結(jié)果表明，T1和rINFα1的蛋白電泳均為單帶(見A.B)兩者電泳遷移率有顯著差異，達到純化要求。
糖密度的測算用標準分子量蛋白C作標準曲線，測得T1分子量為18700Da，rINFα2b為15200Da，而M1的分子量為694Da。則每分子T1約含5分子M1(18700-15200/694＝5.04)，而每個M1分子含有兩個半乳糖，則T1的糖密度為10。
肝靶向性檢測將T1和原料rINFα2b分別用放射性同位素131I(氯胺T法)進行核素標記得131I-T1和131I-rINFα2b分別注射入家兔靜脈中，用Siermens Basicar r照相機作家兔全身放射顯影，各自拍攝收集5-30分鐘疊加照片(圖2，圖3)。圖2為原料(131I-rINFα2b)照片，為自然分布的血池顯象，其中肝、腎、膀胱的放射顯像，清晰可見。附圖3為131I-T1象，可明顯的看到核素在肝區(qū)濃集，腎和膀胱顯象微弱。兩者對比，可直觀的看到T1的肝靶向性。
小鼠體內(nèi)分布實驗將T1和rINFα2b分別用125I標記(氯胺T法)，所得的125I-T1和125I-rINFα2b分別注入各組小鼠尾靜脈，定時處死小鼠，解剖并完整收集小鼠各臟器，測定各臟器官中的放射量，計算其占注入總放射量的百分率，結(jié)果見表1.表2。檢測結(jié)果表明125I-T15分鐘肝分布峰值為36.50±2.54，125I-rINFα2b為11.97±0.25，T1的肝攝取率為原料rINFα2b的3.1倍。
以上小鼠體內(nèi)分布實驗的結(jié)果充分表明了基因工程干擾素α2b采用該偶聯(lián)方法接上半乳糖基后，所形成的雙半乳糖基基因工程干擾素α2b偶聯(lián)物(2Gal-IFNα2b)與原料基因工程干擾素α2b(IFNα2b)相比，具有明顯的肝靶向。實施例1雙半乳糖芳環(huán)橋干擾素(rINFα2b)偶聯(lián)物(T1)的制備
雙半乳糖芳環(huán)橋試劑M1的合成將6-氨基已酸甲酯在HOBT催化下，用DCC與3.5-二羥基苯甲酸(1)縮合，生成中間體(2)。在堿性條件下與1，2-二溴乙烷發(fā)生烴化反應(yīng)，得中間體(3)。隨后將二溴代物200mg(0.41mmol)溶于15ml丙酮和6ml蒸餾水中后，加入2-S-(2，3，4，6-四-O-乙酰-β-1)-吡喃半乳糖基-2-異硫脲氫溴酸鹽800mg(1.67mmol)，碳酸鉀274mg(1.99mmol)，室溫攪拌10分鐘后，加入亞硫酸氫鈉172mg(1.65mmol)，該反應(yīng)混合物避光室攪拌24小時后，減壓濃縮，加入30ml氯仿于殘余物中，15ml水洗一次，無水硫酸鈉干燥后減壓濃縮，所得殘余物經(jīng)硅膠柱層，石油醚-乙酸乙酯(1∶1)洗脫，洗脫液濃縮、結(jié)晶，得白色粉末狀固體M1150mg，mp57-58℃，收率29％。IR3414，2940，1750，1647cm1；HNMR(200HMZ；CDCL3)6.91(2H，d，ArH)，6.54(1H，S，ArH)，5.43(2H，d，HC-S)5.05(2H，dd，2X-CHOAc)4.60(4H，dm，2X，-CHOAC)，4.19(6H，m，2XCH2OAc，2X-CHO)4.00(4H，dd，2XCH2OAr)，3.65(3H，S，CH3OCO-)，3.40(2H，m，NCH2)，3.16(2H，m，CH2S)2.95(2H，m，CH2S)，2.32(2H，t，CH2CO2)2.14(6H，s，2XCH3CO)，2.10(6H，s，2XCH3CO)，2.05(6H，s，CH3CO)，1.98(6H，s，CH3CO)，1.6l(4H，m，-CH2-，CH2-)，1.42(2H，m，CH2)ppm。
雙半乳糖基芳橋干擾素(rINFα2b)偶聯(lián)物(T1)的制備將分枝糖試劑M1200mg，0.16mmol溶于20ml無水甲醇中，隨后加入0.1N的甲醇鈉的甲醇溶液4.0mol(0.4mmol)，室溫攪拌6小時后，減壓濃縮，殘余物中加入4.0ml水，繼續(xù)室溫攪拌10小時，加入pH＝8.0的磷酸緩沖液(4ml)，用1N的鹽酸調(diào)pH＝8.0后，加入EDC 36mg(0.16mmol)，攪拌混勻后，加入4mg基因工程干擾素a2b于4℃攪拌24小時后，將反應(yīng)液加入已預(yù)先處理的透析袋中，用0.1M的含0.73％氯化鈉的磷酸緩沖液透析，每六小時更換一次透析外液，直至用苯酚——硫酸法檢測透析外液無糖為止透析液無菌過濾，冷凍干燥得T1。
采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法(圖1)，可分別測出偶聯(lián)物T1(2Gal-IFNa2b)和所用原料干擾素(IFNa2b)的分子量，分別為18700Da和15200Da，而修飾基團為694Da，故由此算出偶聯(lián)物T1中的分枝半乳糖為5，而每個分枝半乳糖試劑含兩個半乳糖殘基，所以偶聯(lián)物T1(2Gal-IFNα2b)糖密度應(yīng)為10。
用上述方法制備，純化并確認了結(jié)構(gòu)及糖密度為10的偶聯(lián)物T1(2Gal-IFNα2b)作為試驗用樣品進行其在動物體內(nèi)的肝靶向性研究。
將該偶聯(lián)物T1(2Gal-IFNα2b)用氯胺T法進行125I標記，并用Sephadex G50層析注，以PBS洗脫進行純化處理，三氯醋酸沉淀法測定其放化純度達99％以上，并用同樣的125I標記的原料干擾素(125I-IFNα2b)為對照物，分別從體重為15-20g的小鼠尾靜脈注入，作小鼠體內(nèi)分布實驗。試驗組每只小鼠注入標記過的偶聯(lián)物T12ug，對照組每只小鼠注入標記過的對照物2ug后，分別于5’、10’、15’、30’、60’、120’等不同時相斷頭處死。解剖取出各臟器，測定各臟器的放射性，結(jié)果以各臟器中的放射性蓄積量占注入量的百分比表示(見表1、表2)。
由表1可看見，125I-2Gal-IFNα2b主要分布于肝、腎、腸道以及血液中，肝臟攝取量在5分鐘達到高峰，占總放射性的36.5％。腸道放射性從5’至30’逐漸上升，并且在30’時達到高峰，隨后放射性開始下降。由此可推測腸道的放射性主要來自于肝臟。腎臟的放射性在5分鐘內(nèi)達到最大攝取10.2％，隨后逐漸減少，說明125I-2Gal-IFNα2b可從腎臟排泄。另外，在對照組125I-IFNα2b中(見表2)，腎臟放射性分布較高，5分鐘達到峰值10.49％與125I-2Gal-IFNα2b主的峰值相當，表明其同樣也可從腎臟排泄，但肝臟攝取量在5分鐘同樣也達峰值時，僅為11.97％。隨后逐漸下降。125I-2Gal-IFNα2b與125I-IFNα2b的肝攝取峰值之比為3.05∶1，并且兩者在120分鐘后，125I-2Gal-IFNα2b的肝的攝取率仍高于125I-IFNα2b。表1125I-2Gal-Interferonα2b的小鼠體內(nèi)分布實驗結(jié)果時間(mins)5 10 15 3060 120血 12.00±0.93 9.17±2.74 8.93±0.12 8.95±1.126.56±0.45 6.56±1.94心臟0.50±0.130.48±0.16 0.46±0.13 0.32±0.030.26±0.02 0.33±0.12肝臟36.50±2.54 31.2±2.37 23.87±1.93 9.99±1.876.53±0.18 4.37±0.36脾 0.75±0.270.87±0.16 0.53±0.13 1.13±0.020.63±0.07 0.37±0.01肺 1.48±0.281.37±0.39 1.33±0.21 1.48±0.461.11±0.17 0.87±0.29腎 10.20±1.18 8.42±0.48 6.63±0.32 5.15±0.623.78±0.12 2.79±0.32腸 4.06±2.114.51±1.18 4.02±0.09 6.17±0.514.67±1.23 1.49±1.79表2125I-2Gal-Interferonα2b的小鼠體內(nèi)分布實驗結(jié)果時間(mins)5 10153060 120血 15.94±0.37 11.96±0.75 10.06±0.49 8.05±0.526.53±1.09 3.82±0.59心臟 0.85±0.080.51±0.010.50±0.070.34±0.030.28±0.03 0.20±0.01肝臟 11.97±0.26 10.97±1.87 7.03±1.375.75±1.673.53±0.50 2.42±0.12脾 1.12±0.250.93±0.120.81±0.290.56±0.310.43±0.12 0.37±0.03肺 3.62±1.182.00±0.092.21±0.241.72±0.561.71±0.28 0.85±0.18腎 10.49±1.28 7.42±1.446.16±0.693.65±0.762.01±0.03 1.39±0.14腸 7.99±4.208.28±0.619.49±3.736.57±0.776.59±0.77 4.36±0.97實施例2雙半乳糖基胺鏈橋干擾素(rIFNα1)偶聯(lián)物(T2)的制備
雙半乳糖基胺鏈橋試劑M2的合成用丙二酸二乙酯為起始原料，經(jīng)甲醛縮合，丙酮環(huán)化后加熱脫羧得(7)，用鋰鋁氫還原后與丙烯結(jié)合得(9)，經(jīng)脫保護開環(huán)后磺?；秒p磺酸二醇酯(11)，用碘化鈉處理(11)得二碘化物(12)，將二碘化物(12)379mg(1mmol)溶于20ml丙酮和12ml蒸餾水中后，加入2-S-(2，3，4，6-四-O-乙酰-O-吡喃半乳糖基)-2-異硫脈氫溴酸鹽920mg(4mmol)隨后加入碳酸鉀579mg(4.2mmol)，室溫避光攪拌20小時后，減壓濃縮反應(yīng)液，加40ml氯仿于殘余物中，20ml水洗一次，無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮，殘余物經(jīng)硅膠柱層析，石油醚-丙酮(2∶1)洗脫，得無色油狀物M2450mg，收率53％。IR2936，2334，1752cm-1；HNMR(200MHzinCDCl3)5.42(2H，d，2XCHS)，5.15(2H，t，2XCHOAC)，5.03(2H，dd，2XCHOAC)，4.50(2H，d，2XCHOAC)，4.13(4H，m，2XCH2OAC)，3.96(2H，m，2XCH..0)，3.59(4H，m，2XOCH2)，2.85(4H，m2XSCH2)，2.61(2H，t，CH2CN)，2.15(6H，s，2XCH3CO)，2.07(6H，s，2XCH3CO)，2.06(6H，S，2XCH3CO)，2.04(6H，s，2XCH3CO)，1.97(6H，s，2XCH3CO)，1.92(1H，m，CH)ppm雙半乳糖基脂鏈橋干擾素(rINFα1)偶聯(lián)物(T2)的制備將9.2mg(0.1mmol)M2溶于40ml無水甲醇中，室溫攪拌下，加入8mg甲醇鈉，室溫攪拌48小時后，用氬氮流揮干甲醇，將20ml磷酸緩沖液(pH8)加入殘留物中，溶解后用1NHCl調(diào)至pH8，于4℃下，加入干擾素(rINFα1)4mg，4℃攪拌24小時，反應(yīng)液透析除去游離糖及無機鹽，無菌過濾，冰凍干燥得T2。實施例3三半乳糖基脂鏈橋干擾素(rINFα2b)偶聯(lián)物(T3)的制備
三半乳糖基脂鏈橋試劑(M3)的合成用樹枝狀季戊四醇為起始原料，與丙烯腈加成后得四腈物(14)，隨后醇解得四酯(15)，用硼烷部分還原得醇酯(16)，磺酸酯化得(17)，將(17)與2-s-(2，3，4，6-四-O乙酰-β-O-吡喃半乳糖基)-2-異硫脲氫溴酸鹽縮合，產(chǎn)物經(jīng)硅膠柱層析純化得(M3)其結(jié)構(gòu)鑒定光譜數(shù)據(jù)如下IR2932，1752，1748cm-1；HNMR(200MHzn CDCl3)，5.43(3H，d，3XCHS)，5.17(3H，t，3XCHOAC)，5.04(3H，dd，3XCHOAC)，4.32(3H，d，3XCHOAC)，4.05(6H，m，3XCH2OAC)，3.92(3H，m，3XCHO)，3.68(3H，s，CH3OCO)，3.67(2H，t，OCH2)3.32..3.4Z(14H，m，7XOCH2)，2.76(6H，m，3XSCH2)，2.55(2H，t，CH2)，2.16(9H，s，3XCH3CO)，2.11(9H，s，3XCH3CO)，2.09(9H，s，3XCH3CO)，2.00(9H，s，3XCH3CO)ppm，三半乳糖基干擾素(rINFα2b)偶聯(lián)物(T3)的制備將M3200mg溶于20ml無水甲醇中，加入0.1N的甲醇鈉甲醇溶液4.0ml(0.2mmol)室溫攪拌8小時，減壓濃縮，殘余物中加入4.0ml水繼續(xù)室溫攪拌10小時，加入pH＝8.0的磷酸緩沖液10.0ml，用1N的鹽酸精細調(diào)至pH8后，加入EDC 40mg攪拌均勻后加入4mg基因工程干擾素(rINFα2b)，于4℃攪拌反應(yīng)24小時，將反應(yīng)液加入已預(yù)先處理的透析袋中，用0.1M的含0.73％氯化鈉的磷酸緩沖液透析，每六小時更換一次透析外液，直至用苯酚一硫酸法檢測透析外液無糖反應(yīng)為止。反應(yīng)液經(jīng)無菌過濾后，冷凍干燥得(T3)。


圖1是本發(fā)明雙半乳糖—干擾素α2b(A)、干擾素α2b(B)和標準分子量蛋白(C)的電泳圖。圖2是本發(fā)明131碘-干擾素α2b家兔全身放射顯像圖(5-30分)。圖3是本發(fā)明131碘T1(雙半乳糖基干擾素α2b)家兔全身放射顯像圖(5-30分)。
權(quán)利要求
1.一種肝靶向性高糖密度半乳糖基干擾素偶聯(lián)物，其特征在于芳環(huán)分枝橋和脂鏈分枝橋的兩端，分別以甙鍵、肽鍵、亞氨酯鍵偶連2-5個半乳糖和干擾素而生成高糖密度分枝橋干擾素偶聯(lián)物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)通式如后。
2.據(jù)權(quán)利要求1所述的偶聯(lián)物，其特征在于偶聯(lián)的半乳糖在偶聯(lián)物分子中所占的分子比即糖密度應(yīng)為4-20∶1。
3.據(jù)權(quán)利要求1所述的偶聯(lián)物，其特征在于偶聯(lián)物在哺乳動物的肝臟攝取率應(yīng)大于給藥劑量的30％。
G＝雙半乳糖芳環(huán)橋試劑(M1)雙半乳糖脂鏈橋試劑(M2)X＝O，NH 三半乳糖芳環(huán)橋試劑(M3)n＝2-6 三半乳糖脂鏈橋試劑(M4)INF＝人白細胞干擾素(INFα)基因工程干擾素α1(rINFα1)基因工程干擾素α2b(rINFα2b)
全文摘要
本發(fā)明提供的是一種高糖密度半乳糖基干擾素偶聯(lián)物,它是通過分枝橋試劑,使干擾素(INF)分子中的每一個可偶聯(lián)位點連接上2—5個半乳糖基而形成的偶聯(lián)物。該偶聯(lián)物與原藥干擾素相比較具有顯著的肝靶向性和藥理活性,可望開發(fā)成為病毒性肝炎的病因性治療藥物,其化學(xué)結(jié)構(gòu)通式如上式。
文檔編號C07K14/435GK1268517SQ9911748
公開日2000年10月4日 申請日期1999年12月28日 優(yōu)先權(quán)日1999年12月28日
發(fā)明者鐘裕國, 吳勇, 管昌田, 石和平 申請人:華西醫(yī)科大學(xué)