專利名稱：雷公藤內(nèi)酯醇衍生物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種雷公藤內(nèi)酯醇衍生物，其生產(chǎn)方法，在生產(chǎn)治療癌癥的藥物中的應(yīng)用，以及含有這種化合物的藥物組合。
雷公藤具有抗癌作用已為國內(nèi)外學(xué)者所證實。1972年Kuphchan(1)就從雷公藤中分離獲得含環(huán)氧的二萜化合物，即雷公藤內(nèi)酯醇(triptolide)，用于抗腫瘤研究。雷公藤內(nèi)酯醇在0.2及0.25mg/kg ip時，能延長L615白血病小鼠的存活時間，且存活小鼠經(jīng)數(shù)次攻擊不致白血病。在1ng/ml劑量時可抑制人鼻咽癌KB細(xì)胞的體外增殖(張覃沐，陳正玉，林晨，雷公藤內(nèi)酯醇抗腫瘤作用及對小鼠免疫功能的影響，中國藥理學(xué)報，1981；2(2)128)，在抑制乳腺癌和胃癌細(xì)胞集落形成時，其強度與抑制人白血病HL-60細(xì)胞相近，IC50為0.504-1.22μg/L。對人宮頸癌Hela細(xì)胞動力學(xué)影響的實驗發(fā)現(xiàn)，雷公藤內(nèi)酯醇對時相同步化細(xì)胞均有殺傷作用，并對S期細(xì)胞敏感。實驗還證明，雷公藤內(nèi)酯醇在抗腫瘤的同時，能抑制RNA及蛋白質(zhì)的合成，并選擇性地使磷酸果糖激酶上的巰基失活，抑制肝糖元合成，使RNA聚合酶失活，干擾DNA的復(fù)制(許建華，李長春，黃自強，雷公藤內(nèi)酯醇對Hela細(xì)胞的細(xì)胞動力學(xué)影響，中國藥理學(xué)報，1989；10(6)550)。由于雷公藤環(huán)氧二萜內(nèi)酯化合物具有較強的生物活性和應(yīng)用前景，引起研究者們的廣泛興趣，對它們的化學(xué)合成、結(jié)構(gòu)修飾以及生物活性研究至今持續(xù)不斷(Berchtold GA et al，J Am Chem Soc，1980，1021200；Tamelen EEet al.J Am Chem Soc，1982，1041785)。早在80年代初期，就已成功地化學(xué)合成了雷公藤內(nèi)酯醇，但由于反應(yīng)路線長，步驟多且反應(yīng)苛刻，最終獲得的目標(biāo)產(chǎn)物僅有理論研究價值。于德泉等(于德泉，張東明，王淮濱，梁曉天，雷公藤內(nèi)酯醇的結(jié)構(gòu)修飾，藥學(xué)學(xué)報，1992，27(11)830)對雷公藤內(nèi)酯醇作了大量的化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾，曾獲得許多有價值的產(chǎn)物。雷公藤內(nèi)酯醇是雷公藤中的主要有效成分之一，盡管用量小，但其生物活性有效劑量接近其LD50臨床仍表現(xiàn)出相當(dāng)毒性，故妨礙了進(jìn)一步開發(fā)和臨床應(yīng)用。另外從目前的文獻(xiàn)報道來看，國內(nèi)外對雷公藤環(huán)氧二萜類化合物的生物活性研究仍是大部分集中在免疫抑制上，而對它們的抗腫瘤作用的研究不是很多，其原因是與其它具有免疫抑制作用的天然產(chǎn)物相比，雷公藤環(huán)氧二萜類化合物更具特色。但近期的研究表明，自身免疫系統(tǒng)性疾病如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病視網(wǎng)膜病變、紅斑性狼瘡等與腫瘤的生長一樣，都涉及到病變的新生血管生成，這些病都可稱之為“血管生成性疾病”。因此，作為治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和其它新生血管生成疾病的化合物也可能表現(xiàn)出對腫瘤的抑制作用(Folkman J，Nature Med，1995，127)。
分子腫瘤學(xué)研究所取得的進(jìn)展為治療腫瘤提供了許多如癌基因、抑癌基因以及其它可供利用的抗癌藥物作用的靶點，如能找到藥物攻擊癌細(xì)胞的靶點尤其拮抗癌基因及其異常表達(dá)產(chǎn)物的藥物，對抗腫瘤藥物的研究和發(fā)展將具有重要的價值。凋亡及與凋亡有關(guān)的癌基因是抗腫瘤藥物篩選的重要靶點。雷公藤內(nèi)酯醇可誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞凋亡的研究(Yang YL，et al，Immunopharmacology 1998；40139)表明在誘導(dǎo)凋亡的早期雷公藤內(nèi)酯醇激活凋亡相關(guān)蛋白酶。T12對多種腫瘤細(xì)胞有很強的殺傷作用，毒性也遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于雷公藤內(nèi)酯醇；從分子水平研究T12的作用機制也發(fā)現(xiàn)，該化合物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，并引發(fā)凋亡相關(guān)蛋白酶的激活，改變凋亡程序或凋亡程序的基因產(chǎn)物即降解Bcl-2癌蛋白，T12引發(fā)的這種活性明顯強于雷公藤內(nèi)酯醇，使它有希望成為一種新型、低毒的抗腫瘤藥物。
本發(fā)明的一個目的是提供一種毒性低，臨床應(yīng)用價值高的雷公藤內(nèi)酯醇衍生物。
本發(fā)明的又一個目的是提供一種本發(fā)明的雷公藤內(nèi)酯醇衍生物的用途。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種生產(chǎn)本發(fā)明的雷公藤內(nèi)酯醇衍生物的方法。
本發(fā)明的再一個目的是提供一種含有本發(fā)明的雷公藤內(nèi)酯醇衍生物的藥物組合物。
本發(fā)明提供了一種雷公藤內(nèi)酯醇衍生物，其結(jié)構(gòu)式為 其中，R1是H，含有1-4個碳原子的烷基，-Ac-C(＝O)(CH2)nCO2H，或者是氨基酸基，其中，n為1-4的整數(shù)；R2是-SCN，-NCS。由于分子內(nèi)重排，-SCN和-NCS之間可能會發(fā)生轉(zhuǎn)換。
在本發(fā)明的化合物中，優(yōu)選R2是-SCN；R1是H。
于德泉等用不同試劑打開雷公藤內(nèi)酯醇的12，13-環(huán)氧而得到包括12-位鹵素(Cl，Br)的一系列雷公藤內(nèi)酯醇衍生物。12-位為鹵素的雷公藤內(nèi)酯醇衍生物進(jìn)入體內(nèi)后，在酶促作用下，C12，13-可能重新關(guān)環(huán)，回復(fù)為前體化合物雷公藤內(nèi)酯醇，從而再度表現(xiàn)前體化合物雷公藤內(nèi)酯醇的毒性。本發(fā)明用雷公藤內(nèi)酯醇為原料，在溫和反應(yīng)條件下，用硫氰酸銨進(jìn)行C-12，13的開環(huán)反應(yīng)，獲得新型高抗腫瘤活性，低毒的12-β-硫氰酸基-13-α-羥基雷公藤內(nèi)酯醇(以下簡稱T12)，其結(jié)構(gòu)式如下 其中，R1是H，含有1-4個碳原子的烷基，-Ac-C(＝O)(CH2)nCO2H，或者是氨基酸基，其中，n為1-4的整數(shù)。R1基團可通過公知的方法加入。
本發(fā)明還提供了一種生產(chǎn)上述化合物的方法，包括將如下式所示的結(jié)構(gòu)在加熱條件下與硫氰酸反應(yīng)， 其中，R1是H，含有1-4個碳原子的烷基，-Ac-(＝O)(CH2)nCO2H，或者是氨基酸基，其中，n為1-4的整數(shù)。
本發(fā)明的上述方法中，所述反應(yīng)最好是在有機溶劑中在65-87℃的條件下進(jìn)行的。所述的有機溶劑最好是叔丁醇。
本發(fā)明還提供了一種上述化合物在制備治療癌癥的藥物中的應(yīng)用。
在上述應(yīng)用中，所述的癌癥可以是乳腺癌，肺癌，腎癌，惡性黑色素瘤，結(jié)腸癌和卵巢癌。而對腎癌，卵巢癌，乳腺癌，結(jié)腸癌和惡性黑色素瘤具有更好的效果。
本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有抑制癌細(xì)胞生長有效量的本發(fā)明的化合物以及藥物上可接受的載體。
在上述的藥物組合物中，所述的癌細(xì)胞可以是乳腺癌，肺癌，腎癌，惡性黑色素瘤，結(jié)腸癌和卵巢癌。最好是腎癌，卵巢癌，乳腺癌，結(jié)腸癌和惡性黑色素瘤細(xì)胞。
本發(fā)明還提供了另外一種藥物組合物，它含有抑制癌細(xì)胞生長協(xié)同有效量的本發(fā)明的化合物和bcl-2反義核苷酸，以及藥物上可接受的載體。
附圖簡要說明

圖1表示T12誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的DNA降解狀態(tài)。圖2表示T12誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞和Bre-01細(xì)胞Bcl-2發(fā)生降解。圖3表示T12誘導(dǎo)bcl-2發(fā)生降解的強度并與其它三種化合物的比較。圖4表示本發(fā)明的化合物與反義核酸協(xié)同作用Col-06細(xì)胞的結(jié)果。
實施例112-β-硫氰酸基-13-α-羥基雷公藤內(nèi)酯醇的制備方法；取3.6g(0.01mol)雷公藤內(nèi)酯醇溶于400ml叔丁醇中，于50℃下攪拌加熱溶解，待完全溶解后，加入11.4g(0.15mol)硫氰酸銨。升溫至80℃，反應(yīng)24hrs，反應(yīng)畢。反應(yīng)液加入400ml乙酸乙酯，有機層用飽和氯化鈉水溶液洗3次，MgSO4干燥，過濾，于60℃下蒸除溶劑，剩余物加入丙酮溶解。TLC檢測，氯仿∶甲醇(95∶5)展開，T12為主要點，含少量T和其它副產(chǎn)物。丙酮液加入10g 100-200目硅膠拌樣，除盡丙酮，200-300目硅膠柱層析分離，先用氯仿洗脫除盡T，再換用氯仿∶甲醇(95∶5)洗脫，TLC跟蹤檢測，收集T12餾分，合并T12。減壓蒸除溶劑后加入少量丙酮溶解，放置，析出T12粒狀結(jié)晶3.77g，收率90％。Mp265-266℃.Rf值為0.15(CHCl3/MeOH，95∶5)，顯色劑為Kedd’s試劑，呈紫紅色。元素分析C21H25NSO6，計算值％C，60.14. H，6.01. N，3.34.實測值％C，59.85. H，5.93. N，3.26.[α]D25-114.06℃(acetone，4.17mg/ml).IR(KBr)cm-13450，3000，2152，1739，1674，1441，1032，980。MS m/z(％)419(M+，13)，404(-CH3，14.5)，361(- ，13)，343(-H2O，13)，271(14)，241(23)，151(48)，137(89)，72(91)，61(100)。1HNMR，δppm0.8(3H，d，J＝6.77Hz，16-CH3)，0.95(3H，s，20-CH3)，0.99(3H，d，J＝6.88Hz，17-CH3)，1.28(1H，m，1-αH)，1.45(1H，m，1-βH)，1.85(1H，t，J＝14.17Hz，6-βH)，2.0(1H，m，2-H)，2.18(1H，m，2-H)，2.20(1H，m，6-αH)，2.25(1H，m，15-H)，2.67(1H，m，5-H)，3.0(1H，d，J＝4.4Hz，14-H)，3.35(1H，m，7-H)，3.75(1H，d，J＝5.61Hz，11-H)，3.90(1H，d，J＝5.87Hz，12-H)，4.85(2H，m，19-H)，5.0(1H，s，13-OH)，5.45(1H，d，J＝4.2Hz，14-OH)；13CNMR，δppm14(16-C)，15.5(20-C)，16(17-C)，17(2-C)，22.5(6-C)，29(15-C)，30(1-C)，35(10-C)，39(5-C)，51(11-C)，57.5(12-C)，60.5(8-C)，61.5(7-C)，67(9-C)，70.5(19-C)，74(14-C)，76.5(13-C)，115(SCN)，123(3-C)，162(4-C)，173(18-C)。
實施例2SRB法測定T12對20種不同腫瘤細(xì)胞的抑制作用體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞已成為篩選抗癌藥物和進(jìn)行研究的重要手段。過去常用的手段是利用動物如小鼠白血病/淋巴瘤細(xì)胞系，但人與小鼠的細(xì)胞對藥物的反應(yīng)有明顯的差別，因此近年來大多已改用人體腫瘤細(xì)胞系進(jìn)行體外抗腫瘤試驗。本發(fā)明的抗腫瘤試驗應(yīng)用了六種細(xì)胞系，分別為肺癌(Lu-06)、乳腺癌(Bre-o1)、卵巢癌(Ov-01)、腎癌(Re-01)、結(jié)腸癌(Col-06)、惡性黑色素瘤(Mel-08)。
采用美國國立癌癥研究所建立的SRB抗癌藥物篩選方法(Skehan P，Storeng R，Scudiero D et al，New colorimentric cytotoxicity assay foranticancer-drug screening.J Nalt Cancer Inst 1990；821107)對本發(fā)明進(jìn)行體外抗腫瘤測試，并與其先導(dǎo)化合物雷公藤內(nèi)酯醇(T)和另一雷公藤內(nèi)酯醇衍生物8-OH雷公藤內(nèi)酯醇(高活性免疫抑制劑，以下簡稱T8，見Jung，1/1999 PCT/US98/08562，WO98/52933)以及抗腫瘤植物合成藥紫杉醇進(jìn)行了比較。測試方法如下將腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)在含5％小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，內(nèi)含適量青、鏈霉素和谷氨酰胺，在5％CO2，37℃條件下培養(yǎng)。分別將受試細(xì)胞按一定密度接種于96孔板內(nèi)，24小時后給藥組換成新的含被試藥物的培養(yǎng)液(藥品先經(jīng)DMSO溶解后，加入PBS稀釋成1mg/ml濃度，使用時按所需濃度再稀釋并加入細(xì)胞中)繼續(xù)培養(yǎng)48小時。每孔加入預(yù)冷的50％三氯乙酸(TCA，最終濃度為10％)50μl，靜置5分鐘后移放置4℃1小時，在自動洗板機上洗滌5次，空氣干燥。加入100μl SRB液(用1％醋酸配制成0.4％溶液)染色10分鐘，再置洗板機上用1％醋酸溶液洗滌4次，以除去未結(jié)合染料，空氣干燥。最后用150μl 10mmol/L非緩沖Tris溶液溶解結(jié)合的SRB，充分混勻后，用微孔板讀數(shù)儀，在波長490nm處進(jìn)行自動快速比色測定，同時對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。
表1T12和taxol作用六個腫瘤細(xì)胞系的GI50均值(μg/ml)比較細(xì)胞系 T T8 T12 TaxolLu-06(肺癌) 0.090.50.6 0.075Bre-01(乳腺癌)0.040.30.055 0.06OV-01(卵巢癌) 0.006 0.06 0.02 0.05Mel-08(黑色素瘤) 0.020.25 0.09 0.07Re-01(腎癌) 0.030.25 0.06 1Col-6(結(jié)腸癌) 0.020.10.03 0.007本發(fā)明對六個腫瘤細(xì)胞系的作用結(jié)果以及與T、T8和紫杉醇的比較如表1。本發(fā)明對六個腫瘤細(xì)胞均具有明顯的抑制作用，其作用略低于T，但明顯高于T8，抗腎癌作用顯著高于紫杉醇；對結(jié)腸癌，卵巢癌、乳腺癌以及黑色素瘤細(xì)胞也顯示很強的抑制作用。
實施例3貼壁生長細(xì)胞集落形成法測定T12對腫瘤克隆原細(xì)胞的抑制作用克隆原細(xì)胞是指具有持續(xù)分裂能力的細(xì)胞。腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)均以克隆原細(xì)胞的增殖為基礎(chǔ)。當(dāng)單個細(xì)胞連續(xù)分裂6代或以上時，可形成彼此不接觸的集落群體，通過計數(shù)集落可定量分析克隆原細(xì)胞，是一種較靈敏的檢測方法。集落形成測試方法如下所述取指數(shù)生長期貼壁Re-01細(xì)胞，經(jīng)Trypsin-EDTA消化后制成單個分散細(xì)胞懸液，進(jìn)行活細(xì)胞計數(shù)，用RPMI1640培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞密度為500個/ml。取35ml培養(yǎng)皿，每三個一組，加入稀釋后的細(xì)胞懸液，本發(fā)明以10倍稀釋成五種不同濃度(0.001～10μg/ml)加入，同時設(shè)藥物空白組。細(xì)胞與藥物混勻后置含5％CO2的37℃溫箱中培養(yǎng)14天。棄去培養(yǎng)液，常規(guī)Giemsa染色細(xì)胞并計數(shù)含50個細(xì)胞以上的集落。集落抑制率(％)＝(1-給藥組集落數(shù)/對照組集落數(shù))×100以腎癌Re-01細(xì)胞系為材料，測定了T12對其集落形成的抑制作用，結(jié)果為T12作用濃度為0.1ug/ml時，可完全抑制Re-01克隆原細(xì)胞的生長；作用濃度為0.01ug/m和10.001ug/ml，抑制率分別為85％和28％。
實施例4人癌裸鼠異種移植物的實驗治療以往通過多種小鼠模型發(fā)現(xiàn)的抗腫瘤藥主要對惡性淋巴瘤和白血病有效，而且小鼠腫瘤細(xì)胞對抗腫瘤藥物的敏感性高于人體腫瘤細(xì)胞。裸鼠具有胸腺依賴性功能缺乏，異種移植時無排斥反應(yīng)。異種移植后的人體腫瘤在裸鼠體內(nèi)仍保持其原有的組織形態(tài)及免疫學(xué)特征以及染色體組型和對抗腫瘤藥物的原有敏感性。將人體惡性黑色素瘤細(xì)胞Mel-08接種裸鼠體內(nèi)，異種移植方法如下所述藥物配制取相應(yīng)量樣品，加適量的吐溫80助懸，以0.5％CMC-Na溶液配制成所需濃度的混懸液(每個劑量0.5ml/鼠)。
免疫功能缺陷裸鼠，體重17-19克，6-8周齡，均為雌性。試驗組和陽性對照組均為6只，陰性對照組為12只。陽性對照藥物為氮烯咪胺(DTIC)，以生理鹽水配制；陰性對照給以相應(yīng)的溶劑。
試驗的主要步驟取生長旺盛的荷瘤動物，無菌條件下以勻漿法制備人體惡性黑色素瘤成細(xì)胞懸液，以相應(yīng)宿主每鼠腋皮下接種0.2ml/只，次日按實驗設(shè)計方案腹腔給藥，連續(xù)十四天，4mg/kg/日。實驗結(jié)束后解剖各組動物，剖取腫瘤稱重，按下列公式計算腫瘤抑制率腫瘤抑制率＝[(對照組平均瘤重-給藥組平均瘤重)/對照組平均瘤重]×100。
與藥物未處理組比較，腫瘤生長明顯受抑制，抑瘤率為50.17％，與已經(jīng)用于臨床的陽性對照藥物氮希咪胺(20mg/kg)的結(jié)果(抑瘤率為54.92％)接近。
實施例5T12誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的凝膠電泳檢測細(xì)胞凋亡對個體發(fā)育過程中細(xì)胞衰亡與更新、保持細(xì)胞數(shù)目的相對恒定方面起著重要作用。凋亡發(fā)生變化或異常，將導(dǎo)致人類疾病的產(chǎn)生。腫瘤過去被認(rèn)為是增殖、分化異常疾病，隨著對腫瘤細(xì)胞凋亡的研究，現(xiàn)認(rèn)為腫瘤也是細(xì)胞凋亡異常的疾病。細(xì)胞凋亡異常打破了正常組織中細(xì)胞增殖與凋亡的平衡調(diào)節(jié)，導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)目的不斷增加，表現(xiàn)出生長優(yōu)勢，最終形成腫瘤。因此，可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的藥物是治療腫瘤的一條有效途徑。
細(xì)胞凋亡的后期由于核酸酶的活化作用，使核染色質(zhì)DNA降解，并產(chǎn)生不同長度(180-200bp)的寡聚核小體片段，通過瓊脂糖電泳可觀察到此特征。該特征是目前判斷細(xì)胞凋亡發(fā)生的重要標(biāo)志。應(yīng)用瓊脂糖電泳方法檢測了以1μg/ml濃度的T12作用人早幼粒白血病HL-60細(xì)胞后的DNA降解狀況。操作步驟如下所述。
經(jīng)本發(fā)明處理后的HL-60細(xì)胞約3×106用含2mmol/L EDTA的PBS洗2次，加入0.3mlTBE緩沖液(Tris.HCl 50mmol/L，pH 8.0，含10mmol/LEDTA)，0.25％NP-40及Rnase A(終濃度為1％)，混勻后，37℃溫育30分鐘；再加入proteinase K(終濃度為1mg/ml)，37℃繼續(xù)溫育30分鐘。取上清液15μl加5μl上樣緩沖液，在1.5％瓊脂糖凝膠上電泳，紫外光下觀察結(jié)果并照相。
圖1顯示了T12處理與未處理的HL-60細(xì)胞的DNA降解狀態(tài)。T12分別處理細(xì)胞4、12、24小時后，在1.5％的瓊脂糖膠上出現(xiàn)清晰的DNA梯狀條帶(DNA降解標(biāo)志，孔3-5)，未經(jīng)T12處理和經(jīng)處理2小時的細(xì)胞未產(chǎn)生DNA梯狀條帶(孔1、2)，表明T12可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。
實施例6流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期分布細(xì)胞凋亡的某些特征也能夠通過用流式細(xì)胞儀的檢測反應(yīng)出來，以此判定凋亡的發(fā)生，同時也是進(jìn)行藥物作用后細(xì)胞周期分布檢測的可靠工具。流式細(xì)胞儀分析方法如下所述。
經(jīng)本發(fā)明分別處理和未處理的Re-01和HL-60細(xì)胞2×106，分別于不同時間收集細(xì)胞，1000rpm/分離心5分鐘，去上清，沉淀用PBS洗滌兩次，再以1∶9比例加入70％乙醇固定細(xì)胞，混勻后-20℃過夜。再次離心收集細(xì)胞，PBS洗滌兩次，加入1ml 20μg/ml PI染色液(用40mM Na2HPO4/檸檬酸緩沖液，pH7.8；0.25mg/ml Rnase A)，室溫染色30分鐘。在Epics Elite流式細(xì)胞儀上(COULTER公司，US)，以488nm激光為光源，檢測紅色熒光信號，結(jié)果分析軟件為Elite 4.0和DNA Multicycle。
表2T12處理HL-60細(xì)胞不同時間的DNA含量分析(％)處理時間(h)0 2 4 8 24Sub-G1 9.1 28.9 74.8 79.879.8表3T12處理Re-01細(xì)胞不同時間的DNA含量分析(％)處理時間(h)0 12 24 48 72Sub-G1 5.1 10.3 27.4 54.090.0如表2、3所示，以T12(1μg/ml)分別HL-60細(xì)胞處理2小時，Re-01細(xì)胞12小時即可誘導(dǎo)細(xì)胞出現(xiàn)DNA含量小于2倍體的亞G1凋亡峰，并隨作用時間的延長亞G1凋亡峰含量增加。
表4T12對HL-60細(xì)胞作用不同時間的細(xì)胞周期變化作用時間(h) G0/G1 S G2/Mcontrol 32.0 53.7 14.32 29.5 59.2 11.34 71.8 25.3 2.9表5T12對Re-01細(xì)胞作用不同時間的細(xì)胞周期變化處理時間(h) G0/G1 S G2/Mcontrol 28.4 60.6 11.02438.1 36.9 25.04840.7 43.3 16.0從表4、5可以看出，未經(jīng)藥物處理的HL-60細(xì)胞和Re-01兩種細(xì)胞大部分都處于S期，經(jīng)T12分別處理不同時間后，可見細(xì)胞G0/G1期百分比增高，表明在1μg/ml濃度作用下，T12可明顯減少S期的細(xì)胞群體，而增加G0/G1期的細(xì)胞群體，其作用呈時間依賴性。
實施例7本發(fā)明使凋亡相關(guān)蛋白酶活化并降解Bcl-2蛋白細(xì)胞凋亡是受多因素調(diào)控的程序性死亡過程，許多癌基因、抑癌基因參與了這一過程，如bcl-2。在T12對六個腫瘤細(xì)胞的生長抑制的分析中，我們發(fā)現(xiàn)，異常表達(dá)Bcl-2的癌細(xì)胞表現(xiàn)出對本發(fā)明的特異敏感性，GI50顯著低于Bcl-2表達(dá)陰性或低水平表達(dá)的癌細(xì)胞(如表6所示)。
表6部分過度表達(dá)和低水平表達(dá)Bcl-2細(xì)胞的GI50比較Bre-01*Bre-07 Col-06*Col-05 Mel-08*Mel-050.055 0.3 0.03 0.2 0.07 0.25“*”表示高表達(dá)Bcl-2的細(xì)胞系(Western blot檢測)因此推測T12誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用可能與bcl-2癌基因或其產(chǎn)物有關(guān)。為了證實這一推測，應(yīng)用抗Bcl-2單抗并以異常表達(dá)Bcl-2的HL-60細(xì)胞為材料，進(jìn)行蛋白免疫印跡反應(yīng)，檢測本發(fā)明作用后Bcl-2蛋白表達(dá)狀態(tài)。方法所述如下。
經(jīng)藥物處理后的HL-60細(xì)胞1×106，離心后直接懸于樣品處理液(20mmol/L Tris/HCl pH8.0，4％SDS，30％甘油，10％β-巰基乙醇和適量溴酚藍(lán))，用微量注射器反復(fù)抽吸，使細(xì)胞裂解，100℃煮沸3分鐘，直接上樣經(jīng)12％SDS-PAGE分離，將凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5％脫脂奶粉封閉過夜，加入抗Bcl-2單抗，作用2小時，洗膜后用辣根過癢化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗孵育，化學(xué)發(fā)光法顯色處理圖2所示為T12作用HL-60細(xì)胞24，48小時(孔4，5)，與未處理細(xì)胞(孔6)比較，在蛋白印跡主帶位置(p26)的下方，增加一條可與特異單抗反應(yīng)的降解條帶(相對分子量大約為20kDa)。同樣濃度的T12處理Bre-01乳腺癌細(xì)胞48小時(孔7)，也可獲得相同的印跡反應(yīng)結(jié)果。但本發(fā)明不誘導(dǎo)淋巴瘤Ly-01細(xì)胞Bcl-2發(fā)生降解(孔1，2)。Bcl-2蛋白降解可使Bcl-2失活并加速腫瘤細(xì)胞凋亡(Yamamoto AM et al，Leukemia 1998；121467)。Bcl-2的降解提示本發(fā)明誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程引發(fā)了可降解Bcl-2的凋亡蛋白酶的激活。進(jìn)一步比較了本發(fā)明與其先導(dǎo)化合物triptolide、T8和雷公藤多甙粉引發(fā)HL-60細(xì)胞凋亡蛋白活性升高的差異，檢測了四種化合物在1μg/ml處理濃度下，介導(dǎo)凋亡蛋白酶降解Bcl-2的強度，結(jié)果如圖3本發(fā)明(孔5)介導(dǎo)蛋白酶降解Bcl-2的強度明顯高于其它三種化合物(孔1對照，孔2-4分別為雷公藤多甙粉、T和T8)。
實施例8本發(fā)明與反義核苷酸的協(xié)同作用反義核苷酸是90年代誕生的一種新型生物技術(shù)治療藥物，該藥物特異地、選擇性地攻擊引起疾病的基因及其特定的堿基序列，從而阻斷其活性和蛋白質(zhì)的合成，最終達(dá)到治療腫瘤的目的。癌基因bcl-2的高表達(dá)與多種人體腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)，其基因產(chǎn)物抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡途徑。反義核苷酸作用靶基因并使之失活，具有非常高的序列特異性，但對于已經(jīng)生成的癌蛋白卻束手無策。因此利用人工合成的bcl-2反義核苷酸(中國專利申請?zhí)?8 1 11872.0)作用異常表達(dá)Bcl-2的癌細(xì)胞，封閉其癌基因的表達(dá)即封閉基因產(chǎn)物Bcl-2的生成；再利用本發(fā)明可誘導(dǎo)凋亡相關(guān)蛋白酶激活的作用，使已經(jīng)生成的Bcl-2蛋白降解，這種新穎的聯(lián)合處理腫瘤細(xì)胞的方式，將為臨床治療腫瘤疾病提供新的思路。以結(jié)腸癌細(xì)胞Col-06為材料，先后用反義核苷酸和本發(fā)明處理。并以單獨T12和單獨反義作為對照，方法如下所述反義核苷酸體外處理采用將反義核苷酸，脂質(zhì)體混和液用無血清1640按所需濃度稀釋并處理細(xì)胞，37℃培養(yǎng)6小時，棄去舊培養(yǎng)液，用無血清1640洗滌一次后，加入含10％小牛血清的培養(yǎng)基，37℃5％CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)至72小時；本發(fā)明組處理直接用含血清培養(yǎng)基稀釋至所需濃度，作用細(xì)胞48小時；本發(fā)明聯(lián)用反義核苷酸組則先經(jīng)反義處理，24小時之后加入本發(fā)明，繼續(xù)作用48小時。所有測試濃度包括藥物空白細(xì)胞對照以及加藥零時細(xì)胞對照均為三復(fù)孔。檢測采用同實施例3相同的方法進(jìn)行。
結(jié)果如圖4所示。單獨用本發(fā)明作用Col-06細(xì)胞，其GI50大約為0.04μg/ml，與反義聯(lián)用處理細(xì)胞GI50小于0.001μg/ml，比T12單獨作用降低了50倍以上。
實施例9本發(fā)明的急性毒性實驗毒性實驗是抗癌新藥研究的重要環(huán)節(jié)，而小鼠是毒性研究中最常用的動物。本發(fā)明的毒性實驗，采用昆明種小鼠腹腔注射單次給藥，觀察給藥后動物產(chǎn)生的毒性反應(yīng)，并測定其半數(shù)致死量。昆明種小鼠，體重20±1克，6周齡。室溫24±2℃、相對濕度65±10％條件喂養(yǎng)，飼以標(biāo)準(zhǔn)全價營養(yǎng)顆粒飼料，自由攝食和飲水。試驗設(shè)5個劑量組，劑量間距為0.8。動物隨機分組，每組20只，雌雄各半。給藥后觀察即時反應(yīng)，記錄兩周內(nèi)小鼠的死亡分布，死亡小鼠及兩周后存活小鼠進(jìn)行解剖肉眼尸檢，發(fā)現(xiàn)有病變組織時，對該組織進(jìn)行鏡檢。試驗結(jié)果以Bliss方法計算。
以腹腔注射單次給藥對昆明種小鼠急性毒性試驗的LD50值為74.42mg/kg，性別之間無顯著性差異，P值＞0.05。先導(dǎo)化合物雷公藤內(nèi)酯醇的LD50值為0.85mg/kg體重已有報導(dǎo)(Folkman J Nature Med 1995，127)。與此比較，本發(fā)明的毒性明顯低于先導(dǎo)化合物T。
權(quán)利要求
1.一種雷公藤內(nèi)酯醇衍生物，其結(jié)構(gòu)式為 其中，R1是H，含有1-4個碳原子的烷基，-Ac，-C(＝O)(CH2)nCO2H，或者是氨基酸基，其中，n為1-4的整數(shù)，R2是-SCN，或者-NCS。
2.按照權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，R2是-SCN；R1是H。
3.一種生產(chǎn)權(quán)利要求1所述的化合物的方法，包括將如下式所示的雷公藤內(nèi)酯醇在加熱條件下與硫氰酸反應(yīng)， 其中，R1是H，含有1-4個碳原子的烷基，-Ac，-C(＝O)(CH2)nCO2H，或者是氨基酸基，其中，n為1-4的整數(shù)。
4.按照權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，該反應(yīng)是在有機溶劑中在65-87℃的條件下進(jìn)行的。
5.按照權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的有機溶劑是叔丁醇。
6.權(quán)利要求1或2所述的化合物在制備治療癌癥的藥物中的應(yīng)用。
7.按照權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的癌癥是腎癌，乳腺癌，肺癌，惡性黑色素瘤，結(jié)腸癌或卵巢癌。
8.一種藥物組合物，它含有抑制癌細(xì)胞生長有效量的權(quán)利要求1或2所述的化合物以及藥物上可接受的載體。
9.按照權(quán)利要求8所述的組合物，其特征在于，所述的癌細(xì)胞來自乳腺癌，肺癌，腎癌，惡性黑色素瘤，結(jié)腸癌或卵巢癌。
10.一種藥物組合物，它含有抑制癌細(xì)胞生長協(xié)同有效量的權(quán)利要求1或2所述的化合物和bcl-2反義寡核苷酸，以及藥物上可接受的載體。
11.按照權(quán)利要求10所述的組合物，其特征在于所述的癌細(xì)胞來自乳腺癌，肺癌，腎癌，惡性黑色素瘤，結(jié)腸癌或卵巢癌。
全文摘要
一種雷公藤內(nèi)酯醇衍生物，其結(jié)構(gòu)式為右式，其中，R
文檔編號C07D493/04GK1261602SQ99111660
公開日2000年8月2日 申請日期1999年8月20日 優(yōu)先權(quán)日1999年4月16日
發(fā)明者王大元, 高小平, 李文武, 李伯剛 申請人:成都地奧制藥集團有限公司, W&K國際公司