專利名稱：香豆素標(biāo)記雷公藤內(nèi)酯醇及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物制藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種香豆素標(biāo)記雷公藤內(nèi)酯醇及其制
備方法和應(yīng)用。
二.
背景技術(shù)：
衛(wèi)矛科雷公藤屬雷公藤的根部提取物作為傳統(tǒng)中藥，用于治療免疫性疾病，比 如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腎炎、全身性紅斑狼瘡等已經(jīng)有了幾千年的歷史。其中一種二萜類的 化合物雷公藤內(nèi)酯醇，英文triptolide。是該提取物的主要活性成分。雷公藤內(nèi)酯醇的化 學(xué)分子式為C2。H2406，分子量為360。目前，它的全合成已經(jīng)獲得成功。作為一種免疫 抑制藥物，雷公藤內(nèi)酯醇具有很好的抗炎、抗腫瘤及抗生育作用，可應(yīng)用于許多自身免 疫性疾病的治療，最近又顯示其在器官移植抗排斥反應(yīng)方面具有廣闊的應(yīng)用前景。
雷公藤內(nèi)酯醇作為一種藥物，目前采用同位素標(biāo)記的方法來研究其分子的細(xì)胞
定位，但是同位素標(biāo)記方法需要特殊實(shí)驗(yàn)條件，同時具有同位素污染產(chǎn)生，對實(shí)驗(yàn)人員 也有傷害。由于目前實(shí)驗(yàn)手段的局限性，雷公藤內(nèi)酯醇的細(xì)胞定位和分子靶點(diǎn)尚未明 確。4-溴甲基-7-甲氧基香豆素與酸容易形成相應(yīng)的酯，此類酯有很強(qiáng)的熒光而且相當(dāng) 穩(wěn)定。這些衍生物的熒光光譜表明，激發(fā)光譜和熒光光譜的峰值分別位于320-340nm和 390-420nm處。香豆素標(biāo)記的雷公藤內(nèi)酯醇產(chǎn)生的熒光，不僅為其體內(nèi)示蹤提供更加直 觀的證據(jù)，也可為其藥代動力學(xué)研究提供新的參考。
三.

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的問題是提供一種用香豆素標(biāo)記雷公藤內(nèi)酯醇的制備及其應(yīng)用 的方法。
本發(fā)明所述香豆素標(biāo)記的雷公藤內(nèi)酯醇是一種具有如下特征的分子 l)分子量648; 2)最大激發(fā)波長320nm; 3)最大發(fā)射波長398nm; 4)在全
波長光 的照射下可發(fā)出黃色光；5)生物特性對于鼠源巨噬細(xì)胞株ana-l的IC50為 104ng/ml。 具有免疫抑制活性。 本發(fā)明所述香豆素標(biāo)記的雷公藤內(nèi)酯醇的制備方法是 l)雷公藤內(nèi)酯醇的活化將其14位的羥基進(jìn)行衍生化活化，在pH9-10條件下， 與丁二酸酐進(jìn)行酰化反應(yīng)，反應(yīng)式如圖3所示，得到triptolide 14-succinate，以下稱mtp。
2)4-溴甲基-7-甲氧基香豆素標(biāo)記mtp與4-溴甲基-7-甲氧基香豆素，以下稱 Br-Mmc， 按照l : 3的摩爾比在50mg/ml濃度的碳酸鉀、丙酮溶劑中反應(yīng)，37°C，反應(yīng)1 小時。 反應(yīng)方程式見圖4。用大量熱水洗滌產(chǎn)物，冷凍干燥即可。
香豆素標(biāo)記的雷公藤內(nèi)酯醇的鑒定方法 1)電噴霧質(zhì)譜鑒定標(biāo)記產(chǎn)物產(chǎn)物分子量為648，見圖1。 2)香豆素標(biāo)記的雷公藤內(nèi)酯醇，具有明顯熒光最大激發(fā)波長320nm，最大發(fā) 射波長398nm。且對照組雷公藤內(nèi)酯醇與標(biāo)記物Br-Mmc在此波長處無明顯熒光。
3)香豆素標(biāo)記的雷公藤內(nèi)酯醇具有細(xì)胞毒性，可抑制免疫細(xì)胞生長。其IC50為 160nM ; mtp同條件下的IC50為28nM ;雷公藤內(nèi)酯醇同條件下的IC50為13.9nM。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)方法相比其有益效果是本發(fā)明用香豆素標(biāo)記雷公藤內(nèi)酯 醇，作為指示劑，產(chǎn)生的熒光效率高，不易淬滅，相當(dāng)穩(wěn)定，使得雷公藤內(nèi)酯醇體內(nèi)示 蹤變得直觀可行。標(biāo)記后雷公藤毒性的降低也為其體內(nèi)示蹤提供了有利的條件。本發(fā)明 的主要用途為1)雷公藤內(nèi)酯醇及其衍生物mtp的細(xì)胞定位；2)雷公藤內(nèi)酯醇及其衍生物 mtp分子靶點(diǎn)的確定3)雷公藤內(nèi)酯醇及其衍生物mtp的藥代動力學(xué)研究。
四.


圖1.香豆素標(biāo)記的雷公藤內(nèi)酯醇ESI譜圖
圖2.雷公藤內(nèi)酯醇細(xì)胞內(nèi)熒光示蹤圖
圖3.雷公藤內(nèi)酯醇的活化反應(yīng)式
圖4.雷公藤內(nèi)酯醇的香豆素標(biāo)記反應(yīng)式
五.
具體實(shí)施例方式
以下給出用香豆素標(biāo)記雷公藤內(nèi)酯醇制備及示蹤的方法的實(shí)例。
試劑雷公藤內(nèi)酯醇采購自深圳牌牌科技有限公司。4-溴甲基-7-甲氧基香豆
素采購自sigma公司。 香豆素標(biāo)記雷公藤內(nèi)酯醇制備 1)取10mg雷公藤內(nèi)酯醇，丁二酸酐15mg， 4-二甲氨基吡啶0.33mg，溶解在lml
的二氯甲烷中。 2)用三乙胺調(diào)pH值在9-10左右。 3)在磁力攪拌器的攪拌下，室溫反應(yīng)24小時。 4)用大量溫水洗滌反應(yīng)物，將其中有機(jī)相烘干得到淡黃色晶體 triptolide 14-succinate 。 5)取上述反應(yīng)產(chǎn)物triptolide 14-succinate 5mg， 4-溴甲基-7-甲氧基香豆素 8.8mg，碳酸鉀50mg。 6)加入1000ul的丙酮溶劑中，在磁力攪拌器的攪拌下，37°C，反應(yīng)1小時。
7)用大量熱水洗滌產(chǎn)物，取有機(jī)相，烘干即得黃色的香豆素標(biāo)記雷公藤內(nèi)酯 醇。 香豆素標(biāo)記雷公藤內(nèi)酯醇細(xì)胞內(nèi)示蹤 1)Hepal-6細(xì)胞株培養(yǎng)條件37°C， 5%二氧化碳，在含有3%小牛血清的 DMEM培養(yǎng)基中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 2)將細(xì)胞制成1 X 105個/ml密度鋪6孔板，每孔中放置一個邊長2.2cm的蓋玻 片，每孔加入2ml的含有2X的小牛血清DMEM，培養(yǎng)過夜，制成細(xì)胞爬片。
3)用DMSO溶解Dil( —種商品化的細(xì)胞膜紅色熒光染料)，濃度為ImM ;用 DMSO溶解香豆素標(biāo)記的雷公藤內(nèi)酯醇，濃度為lmM。 4)將3)步驟中的兩種溶液分別加入2)步驟中的含有細(xì)胞爬片的6孔板中，使得 Dil溶液的終濃度為5iiM，香豆素標(biāo)記的雷公藤內(nèi)酯醇的終濃度為4iiM， 37°C，培養(yǎng) 30min。 5)將細(xì)胞爬片置于熒光顯微鏡中觀察，可見Dil在細(xì)胞膜部位發(fā)出紅色熒光，雷 公藤發(fā)出的藍(lán)色熒光主要位于胞質(zhì)部位，見圖2。
權(quán)利要求
一種香豆素標(biāo)記的雷公藤內(nèi)酯醇，其特征是分子量為648，最大激發(fā)波長320nm，最大發(fā)射波長398nm，在全波長光的照射下可發(fā)出黃色光，對于鼠源巨噬細(xì)胞株ana-1的IC50為104ng/ml。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述香豆素標(biāo)記的雷公藤內(nèi)酯醇的制備方法，其特征是由以下步驟構(gòu)成l)將雷公藤內(nèi)酯醇14位的羥基進(jìn)行衍生化活化，在pH9-10條件下與丁二酸酐進(jìn)行酰 化反應(yīng)，得到triptolide 14-succinate，以下稱mtp ;2>^ 與4-溴甲基-7-甲氧基香豆素按照1 : 3的摩爾比，在50mg/ml碳酸鉀、丙酮 溶劑中反應(yīng)，37°C，反應(yīng)1小時，用大量熱水洗滌產(chǎn)物，冷凍干燥。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述香豆素標(biāo)記的雷公藤內(nèi)酯醇的細(xì)胞示蹤方法，其特征是Dil溶 液的終濃度為5iiM，香豆素標(biāo)記的雷公藤內(nèi)酯醇的終濃度為4iiM， 37°C，細(xì)胞爬片染 色時間為30分鐘。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述香豆素標(biāo)記的雷公藤內(nèi)酯醇在生物技術(shù)領(lǐng)域中的應(yīng)用1) 雷公藤內(nèi)酯醇及其衍生物mtp的細(xì)胞定位；2) 雷公藤內(nèi)酯醇及其衍生物mtp分子靶點(diǎn)的確定；3) 雷公藤內(nèi)酯醇及其衍生物mtp的藥代動力學(xué)研究。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物制藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種香豆素標(biāo)記雷公藤內(nèi)酯醇及其制備方法和應(yīng)用。用4-溴甲基-7-甲氧基香豆素標(biāo)記雷公藤內(nèi)酯醇，其分子量為648，最大激發(fā)波長320nm，最大發(fā)射波長398nm，全波長光的照射下可發(fā)出黃色光，具有免疫抑制活性。制備時，先將雷公藤內(nèi)酯醇14位羥基活化，后在丙酮溶劑中與4-溴甲基-7-甲氧基香豆素和碳酸鉀反應(yīng)，生成具有熒光特性的雷公藤內(nèi)酯醇衍生物。將其加入活細(xì)胞中，可見細(xì)胞質(zhì)有藍(lán)色熒光，為雷公藤內(nèi)酯醇的細(xì)胞定位于示蹤提供了直觀的證據(jù)。
文檔編號G01N21/64GK101691393SQ200910035979
公開日2010年4月7日 申請日期2009年10月15日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月15日
發(fā)明者盧彥, 徐加發(fā), 沈萍萍 申請人:南京大學(xué)