專利名稱:一種從天麻中提取的抗真菌蛋白及其制備方法
一種從天麻中提取的抗真菌蛋白及其制備方法屬于生物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
現(xiàn)有技術(shù)1.天麻(Gastrodia elata)是蘭科名貴的中草藥,已有兩千年的使用歷史,主要用于治療麻痹、精神病、風(fēng)濕、癱瘓、高血壓和腦神經(jīng)疼痛,是鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)靜藥,無副作用。
2.從天麻塊莖之中,云南植物研究所胡忠等人于1988年分離出的一種分子量為14kD蛋白(天麻抗真菌蛋白Gastrodia antifungal protein,GAFP或天麻素Gastrodianin),除抗真菌活性之外,并未證明有其它生物活性。
3.在比利時Katholieke University Leuven的Peumans W.J.和Van DammeE.J.M等人在蘭科的許多種植物中分離出一系列生物活性各異的凝集素,其中有的對真菌菌絲生長有抑制作用,有的對同翅目昆蟲具殺傷作用,還有的能對人類逆轉(zhuǎn)錄病毒(HIV)等的侵染有相當(dāng)?shù)囊种谱饔谩?br>
發(fā)明的目的1、分離和純化植物體內(nèi)特異的抗真菌類蛋白質(zhì),對它們進行生理生化特性以及結(jié)構(gòu)和功能的研究分析,主要是拮抗機理的闡明,這在植物基因工程和植物病理學(xué)領(lǐng)域具有重要的理論和應(yīng)用價值。
2、闡明蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能在很大程度上要依賴于蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的分析,通過與已知蛋白質(zhì)序列的比較可直接推斷出未知蛋白的結(jié)構(gòu)功能域,從而得知它的生物學(xué)特性;通過遺傳密碼反推出編碼該蛋白質(zhì)的基因的核苷酸序列,從而為克隆出該蛋白的基因、研究基因的表達與調(diào)控提供分子生物學(xué)基礎(chǔ),同時為獲得轉(zhuǎn)基因抗真菌農(nóng)作物打下了物質(zhì)基礎(chǔ)。
實施例1.抗真菌蛋白GAFP-1的分離純化之一取100g保存在-70℃冰箱中的天麻次生塊莖,清水洗凈后取表皮及皮層部組織50g,切成約為1cm的小塊,加入4℃ 100ml磷酸緩沖液50mMpH6.5,含0.2MNaCl,在組織勻漿機中勻漿,每次勻漿30sec,停30sec,共20次。
用四層紗布將勻漿物濾過后,于40℃ 6000×g離心20分鐘。上清液用45%飽和度的硫酸銨沉淀8小時,4℃。10000×g離心20分鐘后取上清液,加入硫酸銨到80%飽和度,4℃過夜沉淀。沉淀被收集后,溶解于50mM,pH5.0的醋酸鈉緩沖液之中。離心去除不溶物后,上清液上Sephadex G-25凝膠過濾柱(C26/40),有活性的部分被收集后上DEAE-纖維素柱(36mm×20cm),未被吸附的樣品收集起來,用70ml超濾罐(Sigma)在PTGC膜(分子量截流值為10.0KD)上,于4℃進行超濾。
蛋白質(zhì)濃縮液用Sephadex G-50凝膠過濾柱(C16/70)進行分離后,收集活性部分,上CM-Sepharose Fast Flow離子交換柱,洗脫方式為用含0~0.3M氯化鈉的醋酸鈉緩沖液(50mM,pH5.0)線性洗脫。收集有活性部分,用4M硫酸銨溶液與它等體積混合,用Phenyl-Superose HR10/10柱在FPLC系統(tǒng)(Pharmacia)上以含2~0M硫酸銨的醋酸鈉緩沖液(50mM,pH5.0)線性洗脫,有活性組分用PD-10 Sephadex G-25M柱進行脫鹽。此法可得14mg GAFP-1。
2.抗真菌蛋白GAFP-1的分離純化之二按方法一,向經(jīng)45%硫酸銨沉淀后的上清液加入1M醋酸鈉緩沖液(pH5.0)使?jié)舛葹?0mM,流經(jīng)DEAE-Sepharose Fast Flow(C10/20)后,直接上Mannose-Sepharose 6B(甘露糖偶聯(lián)的瓊脂糖凝膠6B)(C10/20),經(jīng)過含2M硫酸銨的醋酸鈉緩沖液(pH5.0,50mM)洗脫和含1.5M硫酸銨的醋酸鈉緩沖液(pH5.0,50mM)洗脫,含有GAFP-1組分可用含0.2M硫酸銨的醋酸鈉緩沖液(pH5.0,50mM)洗脫下來。此組分用Phenyl-Superose HR10/10柱在FPLC系統(tǒng)(Pharmacia)進一步純化,同方法一。
3.抗真菌蛋白GAFP-1的分子特征經(jīng)SDS-PAGE電泳分析及Superose12凝膠過濾分析GAFP-1的分子量為10kD。經(jīng)聚丙烯凝膠等電聚焦電泳分析,GAFP-1是一個等電點pI=8.45的堿性蛋白。
經(jīng)BECKMAN 121MB Amino Acid Analyzer(氨基酸分析儀)測定GAFP-1的氨基酸組成為<
<p>*色氨酸殘基數(shù)通過與酪氨酸比較消光值(A288,A280)而測得。
**經(jīng)巰基保護后測得半胱氨酸的殘基數(shù)為4。
經(jīng)Protein Sequencer(ABI491,USA)蛋白質(zhì)測序儀測定GAFP-1的N端氨基酸序列為SDRLNSGHQLDTGGSLAQGGYLFI通過國際計算機聯(lián)網(wǎng)系統(tǒng),與美國的國家生物信息中心(NCBI)中的多肽序列庫比較結(jié)果,GAFP-1與蘭科的二葉蘭(Listera ovata)中的一種甘露糖結(jié)合蛋白有75%的相同性,可以推測它們生理功能有很大的相似或相關(guān)性。
權(quán)利要求
1.一種天麻抗真菌蛋白質(zhì)GAFP-1及其制備方法,其特征在于氨基酸的組成為
*色氨酸殘基數(shù)通過與酪氨酸比較消光值(A288,A280)而測得。**經(jīng)巰基保護后測得半胱氨酸的殘基數(shù)為4。其分子量為10kD;等電點pI=8.45的堿性蛋白;在含2M硫酸銨的溶液中能結(jié)合甘露糖,幾丁質(zhì),N乙酰葡萄糖胺;其N端氨基酸序列為SDRLNSGHQLDTGGSLAQGGYLFI
2.一種從天麻中提取的抗真菌蛋白質(zhì)GAFP-1及其制備方法,其特征在于所述方法包括(1)抗真菌蛋白GAFP-1的分離純化之一取100g保存在-70℃冰箱中的天麻次生塊莖,清水洗凈后取表皮及皮層部組織50g,切成約為1cm的小塊,加入4℃ 100ml磷酸緩沖液50mM pH6.5,含0.2M NaCl,在組織勻漿機中勻漿,每次勻漿30sec,停30sec,共20次;用四層紗布將勻漿物濾過后,于4℃ 6000×g離心20分鐘。上清液用45%飽和度的硫酸銨沉淀8小時,4℃;10000×g離心20分鐘后取上清液,加入硫酸銨到80%飽和度,4℃過夜沉淀;沉淀被收集后,溶解于50mM,pH5.0的醋酸鈉緩沖液之中。離心去除不溶物后,上清液上Sephadex G-25凝膠過濾柱(C26/40),有活性的部分被收集后上DEAE-纖維素柱(36mm×20cm),未被吸附的樣品收集起來,用70ml超濾罐(Sigma)在PTGC膜(分子量截流值為10.0KD)上,于4℃進行超濾;蛋白質(zhì)濃縮液用Sephadex G-50凝膠過濾柱(C16/70)進行分離后,收集活性部分,上CM-Sepharose Fast Flow離子交換柱,洗脫方式為用含0~0.3M氯化鈉的醋酸鈉緩沖液(50mM,pH5.0)線性洗脫;收集有活性部分,用4M硫酸銨溶液與它等體積混合,用Phenyl-Superose HR10/10柱在FPLC系統(tǒng)(Pharmacia)上以含2~0M硫酸銨的醋酸鈉緩沖液(50mM,pH5.0)線性洗脫,有活性組分用PD-10 Sephadex G-25M柱進行脫鹽。此法可得14mg GAFP-1;(2)抗真菌蛋白GAFP-1的分離純化之二按方法一,向經(jīng)45%硫酸銨沉淀后的上清液加入1M醋酸鈉緩沖液(pH5.0)使?jié)舛葹?0mM,流經(jīng)DEAE-Sepharose Fast Flow(C10/20)后,直接上Mannose-Sepharose 6B(甘露糖偶聯(lián)的瓊脂糖凝膠6B)(C10/20),經(jīng)過含2M硫酸銨的醋酸鈉緩沖液(pH5.0,50mM)洗脫和含1.5M硫酸銨的醋酸鈉緩沖液(pH5.0,50mM)洗脫,含有GAFP-1組分可用含0.2M硫酸銨的醋酸鈉緩沖液(pH5.0,50mM)洗脫下來;此組分用Phenyl-Superose HR10/10柱在FPLC系統(tǒng)(Pharmacia)進一步純化,同方法一。
全文摘要
利用生物技術(shù)的方法,主要是液相色譜技術(shù)及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析技術(shù),天麻中分離純化出一種抗真菌的蛋白質(zhì)名為GAFP-1,其分子量為10kD,等電點為8.45。從氨基酸組成上看,它富含天門冬氨酸(酰胺)Asx(22.1%)、甘氨酸Gly(10.0%)、亮氨酸Leu(9.4%),只含一個Met,不含Pro。GAFP-1的N端氨基酸序列為SDRLNSGHQLDTGGSLAQGGYLFI。根據(jù)這個序列可以合成DNA探針或引物,可克隆出GAFP-1基因,為獲得轉(zhuǎn)基因抗真菌農(nóng)作物打下了物質(zhì)基礎(chǔ)。
文檔編號C07K1/36GK1217340SQ98120239
公開日1999年5月26日 申請日期1998年10月6日 優(yōu)先權(quán)日1998年10月6日
發(fā)明者陳章良, 徐慶 申請人:北京大學(xué)