專利名稱：人參皂草苷代謝物的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從下列操作中收集原人參二醇(protopanaxadio1)皂草苷的代謝物的制備方法，在本發(fā)明的技術(shù)方案中，將普雷沃氏菌屬種(Prevotella sp.)S-1菌株(擬桿菌科(Bacteroidaceae)，(KFCC-10923，相當(dāng)按布達佩斯條約的保藏號KCCM-10103)在補充人參皂草苷的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，這時含于培養(yǎng)基中的原人參二醇皂草苷得以生成和積聚。
長期來高麗人參由于具各種治療作用，被認(rèn)為是治療一些內(nèi)科疾病的萬能藥。但是，當(dāng)人參用于治療各種疾病時，其缺點在于a)皂草苷，這一種治療組份，被腸道菌所代謝，b)由于腸道菌群易受到人體的身體結(jié)構(gòu)和其進食的生活方式的影響，皂草苷代謝會有個體差異，這樣在長期的應(yīng)用中會影響治療效果。根據(jù)此情況，發(fā)明人對人參皂草苷代謝物在體內(nèi)的治療作用作了廣泛的研究，現(xiàn)了解到被腸道菌代謝的皂草苷是從腸道吸收的物質(zhì)，這樣它顯示出包括對腫瘤血管化和癌細(xì)胞外滲的抑制作用的免疫增強作用。在這樣的思想指導(dǎo)下，發(fā)明人開發(fā)人參皂草苷作為皂草苷被吸收的物質(zhì)用作新穎的抗癌劑，它不受個體腸道菌群的差異所影響(參見韓國專利申請4217號，1996提交)。
業(yè)已報道通過使用一些衍生自黑曲霉(Aspergillus niger)(糞便菌株，大鼠和人體的糞便)的腸道菌產(chǎn)生的一些酶制備上述人參皂草苷代謝物，即，20-O-β-D-吡喃葡糖基-20(s)-原人參二醇，即化合物K和20-O-[α-L-吡喃阿拉伯糖基(1→6)-β-D-吡喃葡糖基]-20(s)-原人參二醇，即化合物Y[參見Yoshioka，I.化學(xué)藥學(xué)通報(Chem.Pharm.Bull.)，20，2418(1972)，Kamida等藥理學(xué)雜志(Pharmacology Journal)95，246(1975)。Takino等藥用人參1989(PublicPublications Go.，Ltd.)，267(1989)，Kaneoka等日本植物藥雜志，11.241(1994)]。另外，發(fā)明者也報道了用衍生自人體糞便的腸道菌制備20-O-[α-L-吡喃阿拉伯糖基(arabinopuranosyl)(1→6)-β-D-吡喃葡糖基]-20(s)-原人參二醇，即人參苷(ginsenoside)Mc的另一種制備方法(參見韓國專利4217，1996提交)。
用糞便菌株方法產(chǎn)生化合物K需要多于2周的培養(yǎng)。此外，在用黑曲霉產(chǎn)生的粗制的橙皮苷酶(Hesperidinase)的酶處理方法中，它是一種β-葡糖苷酶，會產(chǎn)生化合物K，因為人參皂草苷的代謝途徑中的腸道菌會產(chǎn)生不同的酶，但由于生成了人參苷F2而幾乎不產(chǎn)生化合物Y和人參苷Mc。
此外，用衍生自人體糞便的腸道菌處理的方法可生成的代謝物范圍擴大了，從化合物Y和人參苷Mc到化合物K，因而它們的選擇性很低。這樣，常規(guī)的制備方法被認(rèn)為有這樣的不足a)生產(chǎn)效率很低，b)由于除β-葡糖苷酶外另外還有糖的裂解酶形成，故選擇性生成的活性很低級。在這樣的情況下，以前的技術(shù)不能有效地制備本發(fā)明的代謝物，化合物K、化合物Y和人參苷Mc。
為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺點并以保證其高效率和選擇性生成的方式來制備人參皂草苷的代謝物，本發(fā)明者廣泛地研究了酶誘導(dǎo)方法，通過該方法，衍生自人體糞便的腸道菌群在含人參苷Rb1的培養(yǎng)基中連續(xù)繼代培養(yǎng)，促使產(chǎn)生β-葡糖苷酶的細(xì)菌生長，結(jié)果，成功地分離了菌株S-1(1996，11，8提交韓國微生物保藏中心保藏；其保藏號KFCC-10923，并在1997，7，11轉(zhuǎn)換為按布達佩斯條約的國際保藏機構(gòu)的保藏號KCCM-10103)，次代培養(yǎng)的細(xì)菌產(chǎn)生β-葡糖苷酶的活性更大。通過對菌株S-1的形態(tài)和生化外觀進行仔細(xì)的研究，其性質(zhì)與文獻中所述的性質(zhì)進行了比較(Holdeman，L.V.，Bergey的系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(Bergey’sMannual of Systematic Bacteriology)，Williams和Wilkins，第1卷，616-617(1984)Shar，H.N.，Int.J.Syst.Bateriol.40，205-208(1990))。這樣，現(xiàn)已注意到，屬于擬桿菌科的普雷沃氏菌屬種的菌株S-1類似于普雷沃氏菌(Prevotellaoris)。進一步的是，對S-1菌株(KFCC-10923，按布達佩斯條約的保藏號為KCCM-10103)和普雷沃氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株JCN 8540(由日本理化研究所微生物保藏機構(gòu)轉(zhuǎn)讓)生成與人參皂草苷有關(guān)的代謝物進行研究的結(jié)果顯示標(biāo)準(zhǔn)菌株不顯示任何代謝活性，但S-1菌株能有效地代謝得到原人參二醇皂草苷，結(jié)果可以確保高效、選擇性生成的方式生成化合物K、化合物Y和人參苷Mc。既然用S-1菌株的方法被證明在制備本發(fā)明代謝物中相當(dāng)有用，那么本發(fā)明便得以完成。
本發(fā)明的一個目的是提供用普雷沃氏菌屬種菌株(KFCC-10923，其布達佩斯保藏號為KCCM-10103)制備化合物K、化合物Y和人參苷Mc的方法，其特征在于1)菌株是專性的、無孢子的革蘭氏陰性桿菌。
2)菌株沒有還原乙酸和生成吲哚活性的部分。
3)菌株主要從葡萄糖產(chǎn)生琥珀酸，但不產(chǎn)氣。
4)菌株的生長在含20％膽汁的蛋白胨-酵母培養(yǎng)基中受到抑制。
5)菌株在血瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)時不產(chǎn)生任何色素。
6)菌株水解淀粉和七葉苷。
7)菌株由L-阿拉伯糖、D-木糖、D-葡萄糖、D-甘露糖、D-果糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖和淀粉中產(chǎn)生某些酸，但從海藻糖、D-山梨糖醇、D-甘露醇、肌醇和L-鼠李糖不產(chǎn)生某些酸。
8)菌株水解人參苷Rb1和Rd，它主要生成化合物K。進一步的是，人參苷Rb2和Rc水解的主要產(chǎn)物分別是化合物Y和人參苷Mc。但是人參苷Rc和Rg1幾乎不降解。
進一步的是，本發(fā)明也包括通過酶誘導(dǎo)方法制備代謝人參苷Rb1的細(xì)菌的另一種方法；即衍生自人糞的腸道菌群用補充約0.1％人參苷Rb1的培養(yǎng)基中進行連續(xù)繼代培養(yǎng)，這樣能增加β-葡糖苷酶的產(chǎn)生，β-葡糖苷酶可選擇性地水解糖鏈末端的葡萄糖。用諸如慶大霉素、新霉素、卡那霉素等的氨基糖苷抗生素處理次代培養(yǎng)的菌群后，在代謝人參苷Rb1的細(xì)菌對這些抗生素產(chǎn)生耐藥性的基礎(chǔ)上可分離出普雷沃氏菌屬種S-1菌株。進一步的是，從存在于一些動物(大鼠、小鼠等)的腸道細(xì)菌中可分離出該菌株。
本發(fā)明的新的普雷沃氏菌屬種S-1菌株于1996，11，8保藏在韓國微生物保藏中心(KCCM)，其保藏號為KFCC-10923，它按布達佩斯條約由國際保藏機構(gòu)KCCM轉(zhuǎn)換為保藏號KCCM-10103。
進一步的是，本發(fā)明的人參皂草苷代謝物如下制備將普雷沃氏菌屬種S-1菌株(KFCC-10923，按布達佩斯條約它苯轉(zhuǎn)換為保藏號KCCM-10103)加人補充原人參二醇皂草苷[通過公知的方法從高麗人參(Panaxginseng C.A.Meyer)的地上莖和地下莖得到]和它的組織培養(yǎng)物的液體培養(yǎng)基。然后，反應(yīng)混合物在約37℃厭氧培養(yǎng)2-4天，在與每一皂草苷的3-位和20-位上的羥基相連的糖中，其末端葡萄糖可通過酶水解選擇性地除去。所得的經(jīng)培養(yǎng)的溶液用以水飽和的正丁醇萃取兩次，正丁醇部分用水洗滌后，萃取液用活性炭處理脫色和脫臭，減壓濃縮。殘留物溶于乙酸乙酯，用硅膠柱層析純化(如，Merck Co.Ltd.制備的硅膠，60-230目；洗脫溶劑∶乙酸乙酯/氯仿∶乙酸乙酯∶乙醇(60∶30∶10，下層)，和Merck Co.Ltd.制備的硅膠RP-8；洗脫溶劑80-85％甲醇)得到化合物K、化合物Y和人參苷Mc。
通過上述方法，也可從人參屬植物，如Panax pseudo-ginseng Wall，Panaxnotoginseng Burk.，西洋參(Panax quinquefolium L.)，Panax japonicus C.A.Meyer，Panax pseudo-ginseng Wall.subsp.Himalaicus或Panax vietnamensis Ha etGurshv.中得到人參皂草苷代謝物。也可從含具有20(s)-原人參二醇皂草苷主結(jié)構(gòu)的相似糖苷的皂草苷的其它植物[如，葫蘆科中的Amachazuru(絞股蘭屬Gynostemma pentaphyllum Makino和其接近相關(guān)植物)]得到它們。
將通過下列實施例對根據(jù)本發(fā)明，用普雷沃氏菌屬種S-1菌株(KFCC-10923/KCCM-10103)制備人參皂草苷代謝物的方法作更詳盡的闡述，但本發(fā)明不為這些實施例所限定。
參照實施例將從健康成年男性收集的1克糞便懸浮在普通的厭氧培養(yǎng)基中(如，GAM液體培養(yǎng)基，30毫升)，在約37℃厭氧培養(yǎng)過夜。衍生自人體糞便的腸道菌每隔2天或3天的加到含人參苷Rb1(0.1％)的GAM液體培養(yǎng)基中進行連續(xù)繼代培養(yǎng)。10個月后，稀釋的次代培養(yǎng)液被加到補充慶大霉素(100微克/毫升)的GAM瓊脂培養(yǎng)基上，并在37℃厭氧培養(yǎng)2天。所有生長的細(xì)菌集落用接種環(huán)按形態(tài)類型進行收集，從中分離出由普雷沃氏菌屬種S-1菌株(1996，11，8保藏于KCCM，其保藏號為KFCC-10023，并按布達佩斯條約轉(zhuǎn)換為保藏號KCCM-10103)代謝的人參苷Rb1。
實施例1將預(yù)先在GAM液體培養(yǎng)基(100毫升)中培養(yǎng)過夜的普雷沃氏菌屬種S-1菌株溶液加到補充人參苷Rb1(0.2％)的Mueller-Hinton液體培養(yǎng)基(3升)中，然后在氮氣氛下于約37℃厭氧培養(yǎng)2天。這樣培養(yǎng)的溶液用以水飽和的正丁醇(1升)萃取兩次，正丁醇部分用水(1升)洗滌后，萃取液用活性炭處理進行脫色和脫臭，并減壓濃縮。殘留物溶于乙酸乙酯(500毫升)在硅膠(Merck Co.；60-230目，150克)柱層析純化。所得的殘留物用乙酸乙酯(1升)洗滌，用洗脫溶劑(氯仿∶乙酸乙酯∶乙醇＝60∶30∶10，500毫升下層)洗脫。減壓除去溶劑得到粗制的代謝物(2.1克)。粗制的代謝物經(jīng)反相硅膠柱層析[250克硅膠RP-8，Merck Co.制備；洗脫溶劑(85％甲醇)]分離成純凈物形式，得到化合物K(1.6克)。
實施例2將預(yù)先在GAM液體培養(yǎng)基(100毫升)中培養(yǎng)過夜的普雷沃氏菌屬種S-1菌株溶液加到補充人參苷Rb2(0.2％)的Mueller-Hinton液體培養(yǎng)基(3升中)，然后在氮氣氛下于約37℃厭氧培養(yǎng)2天。這樣培養(yǎng)的溶液用以水飽和的正丁醇(1升)萃取兩次，正丁醇部分用水(1升)洗滌后，萃取液用活性炭處理進行脫色和脫臭，并減壓濃縮。殘留物溶于乙酸乙酯(500毫升)并在硅膠(Merck Co.；60-230目，150克)柱層析純化。所得的殘留物用乙酸乙酯(1升)洗滌，用洗脫溶劑(氯仿∶乙酸乙酯∶乙醇＝60∶30∶10，500毫升下層)洗脫。減壓除去溶劑得到粗制的代謝物(3.6克)。粗制的代謝物經(jīng)反相硅膠柱層析[250克硅膠RP-8，Merck Co.制備；洗脫溶劑(85％甲醇)]分離成純凈物形式得到化合物Y(3.1克)。
實施例3將預(yù)先在GAM液體培養(yǎng)基(100毫升)中培養(yǎng)過夜的普雷沃氏菌屬種S-1菌株溶液加到補充人參苷Rc(0.2％)供給的Mueller-Hinton液體培養(yǎng)基(3升)中，然后在氮氣氛下于約37℃厭氧培養(yǎng)2天。這樣培養(yǎng)的溶液用以水飽和的正丁醇(1升)萃取兩次，正丁醇部分用水(1升)洗滌后，萃取液用活性炭處理進行脫色和脫臭，并減壓濃縮。殘留物溶于乙酸乙酯(500毫升)并在硅膠(Merck Co.；60-230目，150克)柱層析上純化。所得的殘留物用乙酸乙酯(1升)洗滌，用洗脫溶劑(氯仿∶乙酸乙酯∶乙醇＝60∶30∶10，500毫升下層)洗脫。減壓除去溶劑得到粗制的代謝物(3.6克)。粗制的代謝物經(jīng)反相硅膠柱層析[250克硅膠RP-8，Merck Co.制備；洗脫溶劑(85％甲醇)]分離成純凈物形式，得到化合物Mc(3.6克)。
實施例4將預(yù)先在GAM液體培養(yǎng)基(30毫升)中培養(yǎng)過夜的普雷沃氏菌屬種S-1菌株溶液加到補充原人參二醇皂草苷(0.3％)的Mueller-Hinton液體培養(yǎng)基(1升)中，然后在氮氣氛下于約37℃厭氧培養(yǎng)2天。這樣培養(yǎng)的溶液用以水飽和的正丁醇(1升)萃取兩次，正丁醇部分用水(300毫升)洗滌后，萃取液用活性炭處理進行脫色和脫臭，并減壓濃縮。殘留物溶于乙酸乙酯(200毫升)在硅膠(Merck Co.；60-230目，50克)柱層析上純化。所得的殘留物用乙酸乙酯(300毫升)洗滌，用洗脫溶劑(氯仿∶乙酸乙酯∶乙醇＝60∶30∶10，500毫升下層)洗脫。減壓除去溶劑得粗制的代謝物(1.1克)。粗制的代謝物經(jīng)反相硅膠柱層析[250克硅膠RP-8，MerckCo.制備；洗脫溶劑(80-85％甲醇)]分離成純凈物形式，按順序得到化合物K(0.6克)、化合物Y(0.1克)和人參苷Mc(0.2克)。
如上述實施例所述，用普雷沃氏菌屬種S-1菌株(KFCC-10923/KCCM-10103)制備人參皂草苷代謝物的方法被證明是相當(dāng)有效的，原人參二醇皂草苷代謝物-化合物K、化合物Y和人參苷Mc-可用這類方法制備以確保其高效地選擇性地生成。
權(quán)利要求
1.一種新穎的微生物KFCC-10923(它相當(dāng)于按布達佩斯條約的保藏號KCCM-10103)，普雷沃氏菌屬種(Prevotella sp.)S-1菌株。
2.一種制備原人參二醇皂草苷代謝物的方法，其中普雷沃氏菌屬種S-1菌株(擬桿菌科，KFCC-10923/KCCM-10103)在補充人參皂草苷的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，這時含于培養(yǎng)基中的原人參二醇皂草苷代謝物，即20-O-β-D-吡喃葡糖基-20(s)原人參二醇、20-O-[α-L-吡喃阿拉伯糖基(1→6)-β-D-吡喃葡糖基]-20(s)-原人參二醇和20-O-[α-L-吡喃阿拉伯糖基(arabinopuranosyl)(1→6)-β-D-吡喃葡糖基]-20(s)-原人參二醇得以生成和積聚。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備原人參二醇皂草苷代謝物的方法，其中它們的含人參皂草苷的源植物選自人參(Panax ginseng C.A.Meyer)，Panax pseudo-ginseng Wall，Panax notoginseng Burk.，西洋參(Panax quinquefolium L.)，Panaxjaponicus C.A.Meyer，Panax pseudo-ginseng Wall.subsp.Himalaicus或Panaxvietnamensis Ha et Gurshv.，或葫蘆科中的Amachazuru皂草苷。
全文摘要
根據(jù)本發(fā)明,普雷沃氏菌屬種(Prevotella sp.)S－1菌株(擬桿菌科,KFCC－10923,其按布達佩斯條約下的保藏號為KCCM－10103)在補充人參皂草苷的培養(yǎng)基中培養(yǎng),收集培養(yǎng)基中產(chǎn)生和積聚的皂草苷的代謝物,這樣能確保高效、選擇性地生成代謝物。本發(fā)明涉及制備原人參二醇皂草苷代謝物的方法,其中普雷沃氏菌屬種在上述培養(yǎng)基上培養(yǎng),然后含于培養(yǎng)基中的原人參二醇皂草苷代謝物得以生成和積聚。
文檔編號C07J17/00GK1184851SQ9712260
公開日1998年6月17日 申請日期1997年11月28日 優(yōu)先權(quán)日1996年11月29日
發(fā)明者成鐘煥, 許才斗, 長谷用秀夫, 松宮智之, 內(nèi)山雅守 申請人:株式會社一和, 株式會社快樂世界