專利名稱：經(jīng)修飾的多不飽和脂肪酸的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及具有抗瘧活性和/或嗜中性白細胞刺激活性的新多不飽和脂肪酸。本發(fā)明進一步涉及一組修飾的多不飽和脂肪酸，它們有抑制細胞因子產(chǎn)生和細胞因子作用的能力。當與天然產(chǎn)生的多不飽和脂肪酸比較時，該脂肪酸有增強的穩(wěn)定性。本發(fā)明進一步涉及包含所述多不飽和脂肪酸為活性成分的組合物和包括服用該組合物在內(nèi)的抗瘧、抗感染或抗炎治療或預防方法。
超過半數(shù)的世界人口遭受患瘧疾的危險，其中每年記錄約5億急性感染以及大約1百萬死亡。(Tropical Disease Progress in International Research.1987-1988.Ninth Programme Report.UNDP/World Bank/WHO.Geneva.43-49Stevenson MM Preface In；Stevenson MM.Ed.Ma lar ia；Host reponses toInfect ion.CRC Press.Inc.)。因為增加的抗藥性和毒副作用，抗瘧藥的使用伴隨著較多的問題。大多數(shù)現(xiàn)用的抗瘧藥不適宜用于兒童(大多數(shù)遭受潛在地致命的腦瘧危險)、懷孕婦女和老年人。
炎癥可以由細菌、病毒和/或其它感染劑、機會感染(可能是免疫降低狀態(tài)的必然結果，如由癌癥或治療，特別是細胞毒藥物治療或放療造成)、自身免疫性或其它方面造成。膿毒性休克是包含炎癥的疾病的例證。許多革蘭氏陰性膿毒性休克的臨床特征可以通過給動物服用LPS在動物身上重現(xiàn)，LPS可以促使嚴重的能致死的代謝和生理變化。廣泛促炎細胞因子，如腫瘤壞死因子α(TNFα)與LPS的注射有關聯(lián)。長期暴露于TNF或白介素6的特征是產(chǎn)生惡病質，其是晚期惡性腫瘤和嚴重感染的普遍癥狀。其特征是非正常的蛋白和葡萄糖代謝及身體逐漸衰竭。給小鼠、大鼠和/或人長期服用TNF IL-1，在7～10天內(nèi)造成厭食、體重下降和身體脂肪及蛋白耗竭(Cerami等，1985，Immunol.Lett.11.173；Fong等，1989，J.Exp.Med.170，1627；Moldawer等，Am.J.Phusiol.，254 G450-G456，1988；Fong等，Am.J.Physiol.256，R659-R665(1989)；McCarthy等，Am.J.Clin.Nature，42，1179-1182，1982)。測定了患有癌癥和與惡質病有關的慢性疾病的病人的TNF水平。
TNFα和白介素-1，具有如致熱性、致睡眠性和做為炎癥介質的普通功能活性，已經(jīng)影響除毒性休克及與癌癥相關的惡病質外的與慢性感染相關的其它疾病的病理學。在帶有類風濕和活性關節(jié)炎的病人的滑液的液體中以及在帶有類風濕關節(jié)炎的病人的血液中檢測到了TNF(Saxne等，1988，Arthrit Rheumat 31，1041)。在腎移植病人急性排斥發(fā)作期間檢測到TNF的水平升高(Manury和Teppo 1987，J.Exp.Med.166，1132)。在動物中，TNF顯示其與同種異體骨髓移植后在皮膚和內(nèi)臟中產(chǎn)生的移植物抗宿主疾病的病原有關。
服用兔抗鼠TNF抗體，顯示阻止與移植物抗宿主疾病有關的組織學變化并減少死亡率(Piquet等，1987，J.Exp.Med.166，1220)。TNF也顯示出對瘧疾的病理貢獻顯著(Clark等，1987，Am.J.Pathol.129，192-199)。進一步，已有報道在瘧疾病人中TNF的血清水平升高(Scuderi等，1986，Lancet 2，1364-1365)。
多發(fā)性硬化(MS)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)慢性脫髓鞘病并是年輕青年人的最普遍的慢性neut roligical疾病。MS的發(fā)生率和其傳播類型幾十年無改變。該病仍基本不能治愈。
MS影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)白質的多重區(qū)域，最經(jīng)常地影響preventricual白質、腦干、脊髓和視神經(jīng)。初步的作用是破壞髓鞘，并最終殺死少突神經(jīng)膠質細胞，產(chǎn)生MS的特征噬斑。
噬斑的早期發(fā)展以血管周炎癥的發(fā)展，隨后淋巴細胞、血漿細胞和巨噬細胞進入損害處為特點。隨后是星形細胞神經(jīng)膠質增生和少突神經(jīng)膠質細胞的脫神經(jīng)髓鞘作用的企圖。噬斑被淋巴細胞包圍。抗T細胞劑如抗CD4療法是有效的。此藥物抑制T-細胞的繁殖。
盡管MS的病原學仍是未知的，但是形成似乎有理的假說的研究努力集中于那些免疫調節(jié)異常，包括自身免疫和基因素質(predisposition)，兩者都在疾病的實際發(fā)展中起作用。TNFβ(淋病毒素)和TNFα都被認為在病理生理學上起作用。
在處于疾病急性期的病人身上能再現(xiàn)地發(fā)現(xiàn)多重免疫學異常。免疫球蛋白的合成，盡管在外周部正常，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)則升高，而且產(chǎn)生的抗體具有特有帶型。不知道這些抗體的抗原專一性，且仍不清楚它們在疾病的進程中是否起作用。
已知各種能激活免疫系統(tǒng)的應激物，如病毒感染或外傷也會產(chǎn)生MS的加劇。其它激活劑，如γ-干擾素，當用藥時產(chǎn)生相似的作用。另外，例如用皮質類固醇的免疫抑制抗炎治療，能產(chǎn)生有節(jié)制的緩和或至少減輕一段時間。
脊髓病，一種脊髓障礙，可有多種不同的病因，大多數(shù)由炎癥引起，包括如下神經(jīng)梅毒；b12或葉酸缺乏；肉樣瘤??；橫向骨髓炎；arachidonits；頸脊椎炎；運動神經(jīng)元疾病；神經(jīng)纖維瘤病；由腫瘤、脊面(disc)或關節(jié)炎引起的脊髓壓迫；脊髓紅斑狼瘡；以及腦脊髓炎發(fā)生慢性炎癥或如更普遍知道的慢性免疫系統(tǒng)激活作用是對持續(xù)抗原的應答，所述抗原來源可以是外源的或由自身免疫狀態(tài)造成。這樣的炎癥導致局部組織破壞，并且依賴于炎癥的類型，由于炎性介質的持續(xù)產(chǎn)生能導致全身的影響。此炎癥介質包括細胞因子，它是由激活的淋巴細胞和巨噬細胞產(chǎn)生的可溶介質，并影響細胞的溝通和生理學反應。感染性疾病，如慢性疲勞綜合癥或中毒性休克綜合癥或通過導致此情況的自身免疫機理，如類風濕關節(jié)炎，炎性腸疾病，節(jié)段性回腸炎和其它如移植物抗宿主疾病，可導致慢性免疫激活作用。
類風濕關節(jié)炎(Marrow等，I“Autoimmune Rheumatic Disease”，BlackwellScientific Publ.Oxford，UK.Chapter 4 pp148-207(1987))是一種特征為慢性炎癥和侵蝕關節(jié)炎的疾病，影響達3％的人，包括兒童。類風濕關節(jié)炎的癥狀包括初期僵直，在運動時至少一個關節(jié)腫脹以及關節(jié)痛和腫脹。包括嗜睡、厭食和虛弱以及發(fā)燒和淋巴結病(免疫激活的特征)的非專一癥狀可先于關節(jié)發(fā)生。類風濕關節(jié)炎關節(jié)外的表現(xiàn)有脈管炎、白內(nèi)障、眼色素層炎、間質纖維化、心包炎和心肌炎、外周神經(jīng)痛、骨髓沉積、慢性貧血和皮下及肺結。
基因因素和包括細菌、真菌、支原體以及病毒在內(nèi)的感染劑與類風濕關節(jié)炎的發(fā)展有關。輕度類風濕關節(jié)炎可以用非類固醇抗炎藥物治療，而嚴重情況需要全身皮質類固醇，抗代謝劑或細胞毒藥物。抗CD4單克隆抗體和抗TNFα抗體已試驗性地用于治療類風濕關節(jié)炎(Horneff等，細胞因子3 266-267(1991)；Horneff等，Arth.Rheum.34 129-140(1991)和Shoenfeld等，Clin.Exp.Rheum.9,663-673(1991)；Williams等，1992 PNAS 89,9784)。
炎性腸疾病(IBD)和節(jié)段性回腸炎是慢性炎癥的一種情況，它們滿足一些自身免疫疾病的標準(Snook，Gut 31 961-963(1991))。炎癥和組織損害包含中性白細胞、巨噬細胞和淋巴細胞的補充和激活(MacDermott等，Adv.Immunol.42285-328(1988))，它們產(chǎn)生細胞因子和炎癥前分子，如前列腺素和白三烯(MacDermott，Mt.Sinai J.Med.57 273-278(1990))。做為免疫活性細胞慢性激活的結果，IL-1，IL-6(Starter，Immunol.Res.10273-278(1990)；Fiocchi，Immunol.Res.19 239-246(1991))和TNFα(MacDermott，Mt.Sinai J.Med.57273-278(1990))都在IBD和節(jié)段性回腸炎病人身上得到提高。
用于治療IBD和節(jié)段性回腸炎的藥物包括抗炎劑如柳氮磺胺吡啶(5-ASA)，皮質類固醇，環(huán)孢多肽A和咪唑硫嘌呤(Hanauer.Scand J.Gastroenterol 25(Supl.175)97-106(1990)；Peppercorn.Annal.Intern.Med.112 50-60(1990))。試驗性地，抗CD4和抗TNF單克隆抗體已成功地用于治療潰瘍性結腸炎(Emmerich等，Lancet 338 570-571(1991))。
當宿主對親緣不相容的移植物發(fā)生反應，產(chǎn)生宿主抗移植物反應時，免疫活性移植(如骨髓或腸組織)會反抗宿主導致移植物抗宿主疾病。這些反應是通過直接對抗外來MHC分子的同種異體反應來介導的，并在與體外通過混合的淋巴細胞反應(MLR)模擬。移植/宿主相互作用在移植組織周圍造成慢性炎癥，伴隨如在ADS中所見的免疫活性標志物的升高(Grant.Immunol.Today 12171-172(1991))。移植/宿主相互作用的治療目前包括咪唑硫嘌呤，環(huán)孢多肽A或甲基潑尼松，以及最近的雷怕霉素(Spekowski等，Transplantation 53 258-264(1992)；Huber等，Bibliotheca Cardiologica，43 103-110(1988))。對CD3(Wissing等，Clin ExpImmunol.83 333-337(1991))，CD4(Reinke等，Lancet 338 702-703(1991))和TNFα特異的單克隆抗體已試驗性地用于抑制移植/宿主反應。
如上所述，各種PUFA有一個有效的生物活性范圍(例如見國際專利申請Nos.WO93/00084和WO 95/00607及其引用的文獻)。不幸的是，由于它們在體內(nèi)有限的穩(wěn)定性，PUAF做為治療藥物未得到廣泛的應用。本發(fā)明已研制了替代的PUFA，它在保持生物活性的同時，在體內(nèi)具有增加的穩(wěn)定性即更慢的代謝循環(huán)。這些新的多不飽和脂肪酸(PUFA)化合物有直接抗瘧活性。除了其直接的抗瘧活性，此新的PUFA激活人中性白細胞造成顆粒內(nèi)容物的釋放，并在產(chǎn)生超氧化物中與TNF顯示協(xié)同作用。人中性白細胞被PUFA激活導致這些細胞殺死紅血細胞內(nèi)的瘧原蟲(P.falciparum)并且也提高了殺死金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的能力。
進一步，本發(fā)明也已發(fā)現(xiàn)某些多不飽和脂肪酸和新的多不飽和脂肪酸以及它們的羥基和氫過氧基衍生物抑制細胞因子的產(chǎn)生。
這些新的PUFAs包括至少一個β氧雜、β硫雜、γ氧雜或γ硫雜取代。盡管飽和的β氧雜脂肪酸可以用醚合成的標準方法，通過鹵代烷與α-羥基酸的二價陰離子反應或通過α-鹵代酸與去質子醇反應得到，但本發(fā)明的不飽和β氧雜脂肪酸用普通的方法不易得到。以此方法獲得不飽和化合物的企圖僅導致分解產(chǎn)物，由在烯屬的和烯丙基屬的碳上的不期望的副反應造成。
在標準方法的新近變動中，由不太劇烈條件下的親核取代反應，通過三氟化硼乙醚配合物活化的重氮基乙酸酯與醇反應，得到了飽和β-氧雜脂肪酸。然而，已知三氟化硼乙醚會造成烯的異構化，所以不適合用于不飽和β-氧雜脂肪酸的合成中。
本發(fā)明者現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，通過在醇的O-H鍵中插入卡賓，能以好的產(chǎn)率獲得不飽和β-氧雜脂肪酸。其它卡賓的插入反應沒有引起復雜情況出現(xiàn)，并且特別重要的是，烯屬部分在反應條件下不受影響。
卡賓可以從相應的重氮基乙酸酯或重氮基烷烴，通過用催化劑如銠鹽處理而生成。卡賓與補充的醇反應提供了不飽和β-氧雜脂肪酸，此醇或是α-羥基乙酸的衍生物或是不飽和脂肪醇。在優(yōu)選的實施方案中，醇是通過天然產(chǎn)生的不飽和脂肪酸或相應酯的還原得到的，并與重氮基乙酸的酯反應提供不飽和β-氧雜脂肪酸。
本發(fā)明者也證明，β-氧雜和β-硫雜取代的脂肪酸都不能進行β-氧化。另外，某些新化合物表現(xiàn)與天然PUFA不同的其它性質，包括增加的溶解性，改變的氧化還原電位以及不同的電荷和極性。
因此，在第一個方面中，本發(fā)明涉及具有抗瘧和/或中性白細胞刺激活性的多不飽和脂肪酸化合物。該多不飽和脂肪酸含18-25個碳和1-6個雙鍵，其中該多不飽和脂肪酸化合物含有一個或兩個選自β-氧雜、γ-氧雜、β-硫雜和γ-硫雜的取代基。
在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，多不飽和脂肪酸化合物含有選自羥基、氫過氧基、過氧基和羧甲基取代的進一步取代。在另一實施方案中，該取代的脂肪酸共價連接到氨基酸上。
在本發(fā)明進一步優(yōu)選的實施方案中，多不飽和脂肪酸化合物含有20-25個碳原子和3-6個雙鍵，優(yōu)選是n-3到n-6脂肪酸。
在本發(fā)明另一個優(yōu)選的實施方案中，多不飽和脂肪酸化合物是含有β-氧雜或β-硫雜取代的有3-4個雙鍵的21個碳，含有γ-硫雜或β-氧雜取代的有3-4個雙鍵的22個碳，含有β-硫雜取代的有3-4個雙鍵的23個碳，含有γ-硫雜取代的有3-4個雙鍵的24個碳，含有β-氧雜取代的有3-6個雙鍵的25個碳，含有β-硫雜取代的有3-6個雙鍵的25個碳，或含有β-硫雜和α-羧甲基取代的有3-6個雙鍵的23個碳。
在本發(fā)明另一個更優(yōu)選的實施方案中，多不飽和脂肪酸化合物有一個ω羥基取代。
在本發(fā)明另一優(yōu)選的形式中，多不飽和脂肪酸化合物與氨基酸結合，優(yōu)選天冬氨酸或甘氨酸。
在第二個方面中，本發(fā)明涉及一種制備不飽和氧雜取代脂肪酸的方法，包括不飽和脂肪酸醇與卡賓反應，使卡賓插入到醇的O-H鍵中。
在本發(fā)明這方面的優(yōu)選實施方案中，不飽和脂肪酸含有18-25個碳原子和1-6個雙鍵。
在本發(fā)明這方面進一步優(yōu)選的實施方案中，卡賓通過重氮化合物的乙酸銠催化來合成。
在本發(fā)明這方面另一個優(yōu)選的實施方案中，制備不飽和β氧雜取代脂肪酸。
在第三個方面中，本發(fā)明涉及一種治療患者炎癥的方法，該方法包括給患者服用治療有效量的抗炎組合物，該組合物包括含有18-24個碳原子碳鏈和1-6個順式或反式雙鍵的多不飽和脂肪酸之至少一個羥基、氫過氧基或過氧基衍生物。
在本發(fā)明這方面的優(yōu)選實施方案中，多不飽和脂肪酸可以在碳鏈中含有氧或硫原子做為氧雜或硫雜衍生物。
在本發(fā)明這方面的進一步優(yōu)選實施方案中，多不飽和脂肪酸選自C204n-6(5，8，11，14-二十碳四烯酸)、C205n-3(5，8，11，14，17-二十碳五烯酸)、C226n-3(4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酸)和花生四烯酸。
中性白細胞/巨噬細胞刺激劑應用于其它感染的治療，包括sp.念球菌、錐蟲屬、血吸蟲病、結核病，病毒如皰疹、山得別斯病毒、軍團菌、李司忒氏菌病、肺囊蟲、假單孢菌屬。它們也可用于免疫受損個體，包括那些經(jīng)受癌癥化療和移植接受者及燒傷病人的輔助治療。另外，還可對那些所謂已知具有弱吞噬細胞的細胞活性的正常個體進行治療，如老人、兩歲下兒童、酗酒者。
為了使本發(fā)明的性質被更清晰地理解，其優(yōu)選的形式現(xiàn)在將參考下面的實施例和圖例做描述，其中

圖1a顯示花生四烯酸5，8，11，14-二十碳四烯酸圖1b顯示5-氫過氧基-6E，8Z，11Z，14Z-二十碳四烯酸圖1c顯示9-氫過氧基-5Z，7E，11Z，14Z-二十碳四烯酸圖1d顯示8-氫過氧基-5Z，9E，11Z，14Z-二十碳四烯酸圖1e顯示12-氫過氧基-5Z，8Z，10E，14Z-二十碳四烯酸圖1f顯示11-氫過氧基-5Z，8Z，12E，14Z-二十碳四烯酸圖1g顯示15-氫過氧基-5Z，8Z，11Z，13E-二十碳四烯酸圖1h顯示5-羥基-6E，8Z，11Z，14Z-二十碳四烯酸圖li顯示9-羥基-5Z，7E，11Z，14Z-二十碳四烯酸圖1j顯示8-羥基-5Z，9E，11Z，14Z-二十碳四烯酸圖1k顯示12-羥基-5Z，8Z，10E，14Z-二十碳四烯酸圖1l顯示11-羥基-5Z，8Z，12E，14Z-二十碳四烯酸圖1m顯示15-羥基-5Z，8Z，11Z，1 3E-二十碳四烯酸圖1n到圖1z顯示取代的PUFAs的范圍，其中Y是羥基、氫過氧基或過氧基。
圖2a顯示β-氧雜23∶4(n-6)圖2b顯示β-氧雜21∶3(n-6)圖2c顯示β-氧雜21∶3(n-3)圖2d顯示β-氧雜25∶6(n-3)圖2e顯示β-氧雜21∶4(n-3)圖2f顯示β-硫雜23∶4(n-6)圖2g顯示β-硫雜21∶3(n-6)圖2h顯示β-硫雜21∶3(n-3)圖2i顯示β-硫雜25∶6(n-3)圖2j顯示α-羧甲基-β-硫雜23∶4(n-6)圖2k顯示γ-硫雜24∶4(n-6)圖21顯示γ-硫雜22∶3(n-6)圖2m顯示γ-硫雜22∶3(n-3)圖2n顯示16-OH-β-氧雜22∶3(n-6)圖2o顯示16-OH-β-氧雜22∶3(n-3)圖3顯示20∶4，20∶4甲酯(ME)，20∶4氫過氧基(HP)和20∶4羥基(H)對通過促分裂原PHA刺激，由人外周血單核細胞(PBMC)產(chǎn)生的細胞因子的影響。
圖4顯示22∶6，22∶6HP，22∶6H，20∶5，20∶5HP和20∶5H對PHA誘導的細胞因子生成的影響。這些化合物體外抑制來自巨噬細胞及T細胞的細胞因子的產(chǎn)生。
圖5顯示20∶4，20∶4氫過氧基(HP)和20∶4羥基(OH)抑制TNFα誘導的通過人臍血管內(nèi)皮細胞的E-選擇素的表達。
圖6顯示脂肪酸刺激的嗜中性嗜苯胺藍顆粒的釋放。
圖7顯示脂肪酸刺激的嗜中性特異性顆粒的釋放。
圖8顯示脂肪酸對中性白細胞介導的殺死金黃色葡萄球菌的增強。
圖9(a)顯示花生四烯酸與β-氧雜23∶4(n-3)相比發(fā)生β-氧化的能力。
圖9(b)顯示化合物不象花生四烯酸發(fā)生β-氧化，因此不會干擾正常細胞的新陳代謝。
表1顯示新的脂肪酸對氯喹敏感的P.faciparum的直接抗瘧活性。
表2顯示該新的脂肪酸激活中性白細胞殺死P.faciparum的能力。
表3顯示新的脂肪酸對氯喹耐藥株P.faciparum的直接作用。
表4顯示脂肪酸對促分裂原刺激的外周血單核細胞增殖的抑制作用。
表5顯示脂肪酸對PHA刺激的TNFα生成的抑制作用。
表6顯示脂肪酸對金黃色葡萄球菌刺激的干擾素γ生成的抑制作用。方法TNF誘導的BLAM-1和ICAM-1的檢測人臍內(nèi)皮細胞(5×104第一代)接種于96孔板的中央60孔內(nèi)，剩余的孔加滿無熱原的蒸餾水以減少含細胞孔的蒸發(fā)。每隔一天細胞加入新鮮培養(yǎng)基(補充以20％FCS和內(nèi)皮細胞生長補充物的M199)直到細胞鋪滿。測試前一天細胞用HBSS洗并重加培養(yǎng)基。測試時吸出培養(yǎng)基。在介質中制備的脂肪酸加入到每一個孔中并在37℃ 5％CO2下如圖所示溫育不同時間。細胞溫育后進行洗滌并用TNF或PMA處理，然后用PBS洗三次并固定(100μl溶于PBS的0.025％戊二醛，4C過夜)。各孔用PBS洗并加入抗ELAM(Becton-Dickinson，100μl，1/1000在含20％FCS的M199中)或抗ICAM(Immunotech，100μl，12/2500含20％FCS的M199)之一，室溫溫育1小時后，孔用PBS洗并加入100μl兔抗鼠Ig-HRP偶聯(lián)物(1/1.000，Dako)。進一步在室溫溫育1小時，隨后在加入100μl底物(ABTS)前把板洗三次，在微板讀數(shù)儀上于410nm測量顯色。單核細胞繁殖實驗如Ferrante和Thong(1978……)所述，單核細胞從正常人的末梢血分出。該單核細胞重懸于含20％人AB血清的RPMI-1640中并放置在96孔板內(nèi)(每孔50μl，細胞密度4×106細胞/ml)。然后加入50μl脂肪酸(66μm)并在37℃，5％CO2預溫育細胞30分鐘。加入100μl促細胞分裂劑(PHA，ConA，PWM，金黃色葡萄球菌)，在加入氚代胸腺嘧啶核苷(1μCi/孔)前于37℃、5％CO2下溫育細胞66小時。在培養(yǎng)基中總共72小時后，收集細胞并繁殖(插入胸腺嘧啶核苷)并測定上清液細胞因子的存在。細胞因子測定培養(yǎng)基上清液中細胞因子水平通過特異ELISA用抗細胞因子抗體測定。測定了下列細胞因子TNFα、TNFβ、干擾素-γ、IL-1β、IL-2。脂肪酸膠束的制備和中性白細胞的預處理為了克服脂肪酸在水性溶液中的不溶解，在HBSS中用超聲處理制備混合的二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPC，400μg)脂肪酸(100μg)膠束。中性白細胞在37℃預處理30分鐘。在一些實驗中PUFA溶于乙醇中。瘧疾生長抑制測定等份的RBC(5×106含305％寄生蟲血癥)與中性白細胞(106)在96孔板中混合，然后在加入1μCi 3H-次黃嘌呤前在37℃、5％CO2下在空氣中溫育2小時。然后96孔板溫育過夜。各孔內(nèi)含物被收集到玻璃濾紙上，在液閃計數(shù)儀上測定摻入的3H。然后計算寄生蟲的生長抑制百分率。中性白細胞化學發(fā)光測定向100μl在HBSS中的中性白細胞(1×106)中加入100μl脂肪酸膠束或只加入DPC并補加300μlHBSS。隨后立即加入500μl光澤精(0.25 mg/ml PBS液)。在照度計上隨時間測定產(chǎn)生的光輸出(mv)。實驗用來自不同個體的細胞重復進行三次，產(chǎn)生的數(shù)值代表反應的峰值。脫粒作用的測定通過測定維他命B12結合蛋白(如Gottleib等所述，1965，Blood 25875-883)和β-葡糖苷酸酶釋放(如Kolodeney和Mumford所述，1976，Clin.Chem.Acta70247-257)來測定脫粒作用。殺菌測定根據(jù)Ferrante和Abell，1988，Infect.Immun.51607的描述，測定中性白細胞對金黃色葡萄球菌的殺菌活性。化學合成β-氧雜脂肪酸的合成
aR ＝ CH3(CH2)4(CHcis＝CHCH2)4(CH2)3-bR ＝ CH3(CH2)4(Chcis＝CHCH2)3(CH2)4-cR ＝ CH3CH2(CHcis＝CHCH2)3(CH2)7-dR ＝ CH3CH2(CHcis＝CHCH2)6(CH2)2-eR ＝ CH3CH2(CHcis＝CHCH2)4(CH2)5-試劑花生四烯醇(1a)-Nu Chek Prep.，Elysian，MN，USAγ-亞麻醇(1b)-Nu Chek Prep.，Elysian，MN，USA亞麻醇(1c)-Nu Chek Prep.，Elysian，MN，USA二十二碳六烯醇(1d)-Nu Chek Prep.，Elysian，MN，USAZ，Z，Z，Z-6，9，12，15-十八碳四烯醇(1e)-用氫化鋁鋰還原6，9，12，15-十八碳四烯醇甲酯合成Z，Z，Z，Z-6，9，12，15-十八碳四烯醇甲酯-Sigma Chemical Company乙酸銠二聚體-Aldrich Chemical Company重氮基乙酸叔丁酯(2)-從乙酰乙酸叔丁酯按照Regitz，M；Hocher，J；Leidhegener，A.Organic Syntheses Coll.Vol.5，179合成乙酰乙酸叔丁酯-Fluka AG三氟乙酸-Aldrich Chemical Company所有溶劑用前重蒸。
柱層析在正氮氣壓下在Merck Silica Gel 60(230-400目)，Art.9385上進行。步驟烷氧基乙酸叔丁酯3相應的脂肪醇1(1mol當量)稱重放入干燥氮氣下的兩口圓底燒瓶中并溶解于二氯甲烷。向此攪拌溶液中加入乙酸銠二聚體(0.5mol％)，隨后用注射器滴加重氮基乙酸叔丁酯2(2.5mol當量)的二氯甲烷溶液。加完后反應混合物于氮氣下室溫攪拌2小時。粗產(chǎn)物干燥氮氣流下濃縮，殘留物硅膠柱純化，用己烷/乙醚(9∶1)洗脫，給出相應的油狀烷氧基乙酸叔丁酯3。烷氧基乙酸4相應的烷氧基乙酸叔丁酯3(約100mg，1mol當量)稱重放入干燥氮氣下的兩口圓底燒瓶中并加入二氯甲烷(約4ml)溶解。向此攪拌溶液中加入三氟乙酸(1ml)，反應混合物室溫氮氣下攪拌2小時。粗反應混合物在干燥氮氣流下濃縮，殘渣硅膠柱純化，用己烷/乙醚/乙酸(40∶60∶2)洗脫，給出相應的油狀烷氧基乙酸4。(5，8，11，14-二十碳四烯氧基)乙酸叔丁酯(3a)[t-Buβ-氧雜23∶4(n-6)]1H n.m.r.(200MHz，CDCL3)δ 0.89(3H，t，J6.7Hz，C20′-H3)，1.25-1.38(8H，m，C3′-H2，C17′-H2，C18′-H2，C19′-H2)，1.49(9H，s，C(CH3)3)，1.56-1.69(2H，m，C2′-H2)，2.01-2.15(4H，m，C4′-H2，C16′-H2)，2.79-2.87(6H，m，C7′-H2，C10′-H2，C13′-H2)，3.52(2H，t，J6.6Hz，C1′-H2)，3.94(2H，s，C2-H2)，5.32-5.45(8H，m，C5′-H，C6′-H，C8′-H，C9′-H，C11′-H，C12′-H，C14′-H，C15′-H)；
13C n.m.r.(50MHz，CDCl3)δ169.82s，130.48d，129.97d，128.55d，128.42d，128.08d，128.02d，127.96d，127.59d，81.40s，71.63t，68.83t，31.58t，29.29t，29.07t，28.14q，27.23t，27.01t，26.09t，25.66t，22.57t，14.09q.(6，9，12-十八碳三烯氧基)乙酸叔丁酯(3b)[t-Buβ-氧雜21∶3(n-6)]1H n.m.r.(200MHz，CDCL3)δ 0.89(3H，t，J6.7Hz，C18′-H3)，1.25-1.45(10H，m，C3′-H2，C4′-H2，C15′-H2，C16′-H2，C17′-H2)，1.48(9H，s，C(CH3)3)，1.56-1.68(2H，m，C2′-H2)，2.01-2.13(4H，m，C5′-H2，C14′-H2)，2.77-2.84(4H，m，C8′-H2，C11′-H2)，3.51(2H，t，J6.6Hz，C1′-H2)，3.94(2H，s，C2-H2)，5.27-5.48(6H，m，C6′-H，C7′-H，C9′-H，C10′-H，C12′-H，C13′-H)；13C n.m.r.(50MHz，CDCl3)δ169.82s，130.41d，130.10d，128.33d，128.21d，127.87d，127.64d，81.39s，71.72t，68.82t，31.52t，29.57t，29.49t，28.12q，27.18t，25.74t，25.63t，22.56t，14.04q.Z，Z，Z-(9，12，1 5-十八碳三烯氧基)乙酸叔丁酯(3c)[t-Buβ-氧雜21∶3(n-3)]1H n.m.r.(200MHz，CDCL3)δ0.98(3H，t，J7.5Hz，C18′-H3)，1.25-1.40(10H，m，C3′-H2，C4′-H2，C5′-H2，C6′-H2，C7′-H2)，1.48(9H，s，C(CH3)3)，1.51-1.67(2H，m，C2′-H2)，2.01-2.15(4H，m，C8′-H2，C17′-H2)，2.75-2.86(4H，m，C11′-H2，C14′-H2)，3.50(2H，t，J6.6Hz，C1′-H2)，3.95(2H，s，C2-H2)，5.31-5.43(6H，m，C9′-H，C10′-H，C12′-H，C13′-H，C15′-H，C16′-H)；13C n.m.r.(50MHz，CDCl3)δ169.84s，131.94d，130.35d，128.27d，127.66d，127.13d，81.36s，71.83t，68.82t，29.64t，29.45t，29.25t，28.12q，27.24t，26.04t，25.62t，25.53t，20.53t，14.25q.Z，Z，Z，Z，Z，Z-(4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯氧基)乙酸叔丁酯(3d)[t-Buβ-氧雜25∶6(n-3)]1H n.m.r.(200MHz，CDCL3)δ0.98(3H，t，J7.5Hz，C22′-H3)，1.48(9H，s，C(CH3)3)，1.58-1.76(2H，m，C2′-H2)，2.00-2.21(4H，m，C3′-H2，C21′-H2)，2.79-2.87(10H，m，C6′-H2，C9′-H2，C12′-H2，C15′-H2，C18′-H2)，3.52(2H，t，J6.6Hz，C1′-H2)，3.95(2H，s，C2-H2)，5.28-5.46(12H，m，C4′-H，C5′-H，C7′-H，C8′-H，C10′-H，C11′-H，C13′-H，C14′-H，C16′-H，C17′-H，C19′-H，C20′-H)；13C n.m.r.(50MHz，CDCl3)δ169.76s，132.03d，129.41d，128.57d，128.39d，128.36d，128.24d，128.21d，128.16d，128.12d，128.02d，127.88d，127.02d，81.40s，71.08t，68.83t，29.53t，28.12q，25.63t，25.59t，25.54t，23.72t，20.55t.14.25q.Z，Z，Z，Z-(6，9，12，15-十八碳四烯氧基)乙酸叔丁酯(3e)[t-Buβ-氧雜21∶4(n-3)]1H n.m.r.(200MHz，CDCL3)δ0.98(3H，t，J7.5Hz，C18′-H3)，1.21-1.52(4H，m，C3′-H2)，1.48(9H，s，C(CH3)3)，1.53-1.66(2H，m，C2′-H2)，2.01-2.15(4H，m，C5′-H2，C17′-H2)，2.77-2.87(6H，m，C8′-H2，C11′-H2，C14′-H2)，3.51(3H，t，J6.6Hz，C1′-H2)，3.95(2H，s，C2-H2)，5.28-5.47(8H，m，C6′-H，C7′-H，C9′-H，C10′-H，C12′-H，C13′-H，C15′-H，C16′-H)；13C n.m.r.(50MHz，CDCl3)δ169.82s，132.00d，130.15d，128.49d，128.42d，128.01d，127.96d，127.78d，127.05d，81.39s，71.72t，68.81t，29.57t，29.49t，28.12q，27.18t，25.74t，25.63t，25.54t，20.55t，14.25q.Z，Z，Z，Z-(5，8，11，14-二十碳四烯氧基)乙酸(4a)[β-氧雜23∶4(n-3)]1H n.m.r.(200MHz，CDCL3)δ0.89(3H，t，J6.7Hz，C20′-H3)，1.25-1.49(8H，m，C3′-H2，C17′-H2，C18′-H2，C19′-H2)，1.57-1.74(2H，m，C2′-H2)，2.00-2.14(4H，m，C4′-H2，C16′-H2)，2.78-2.85(6H，m，C7′-H2，C10′-H2，C13′-H2)，3.58(2H，brt，J6.0Hz，C1′-H2)，4.08(2H，s，C2-H2)，5.29-5.46(8H，m，C5′-H，C6′-H，C8′-H，C9′-H，C11′-H，C12′-H， C14′-H，C15′-H)；13C n.m.r.(50MHz，CDCl3)δ173.37s，130.47d，129.64d，128.55d，128.24d，128.13d，128.02d，127.86d，127.152d，71.81t，31.49t，29.49t，29.21t，27.20q，26.88t，26.03t，25.63t，25.63t，22.54t，14.02q.Z，Z，Z-(6，9，12-十八碳三烯氧基)乙酸(4b)[β-氧雜21∶3(n-6)]1H n.m.r.(200MHz，CDCL3)δ0.89(3H，t，J6.8Hz，C18′-H3)，1.23-1.43(10H，m，C3′-H2，C4′-H2，C15′-H2，C16′-H2，C17′-H2)，1.51-1.71(2H，m，C2′-H2)，2.00-2.10(4H，m，C5′-H2，C14′-H2)，2.75-2.86(4H，m，C8′-H2，C11′-H2)，3.60(2H，t，J6.6Hz，C1′-H2)，4.17(2H，s，C2-H2)，5.26-5.47(6H，m，C6′-H，C7′-H，C9′-H，C10′-H，C12′-H，C13′-H)；13C n.m.r.(50MHz，CDCl3)δ171.74s，130.45d，129.84d，128.40d，128.20d，128.10d，127.59d，71.13d，31.51d，29.36d，29.31d，27.20d，27.10d，25.62d，22.57d，22.55d，14.04q.Z，Z，Z-(9，12，15-十八碳三烯氧基)乙酸(4c)[β-氧雜21∶3(n-3)]1H n.m.r.(200MHz，CDCL3)δ0.97(3H，t，J7.5Hz，C18′-H3)，1.25-1.43(10H，m，C3′-H2，C4′-H2，C5′-H2，C6′-H2，C7′-H2)，1.51-1.63(2H，m，C2′-H2)，2.01-2.15(4H，m，C8′-H2，C17′-H2)，2.75-2.86(4H，m，C11′-H2，C14′-H2)，3.55(2H，t，J6.5Hz，C1′-H2)，4.12(2H，s，C2-H2)，5.28-5.46(6H，m，C9′-H，C10′-H，C12′-H，C13′-H，C15′-H，C16′-H)；13C n.m.r.(50MHz，CDCl3)δ 174.73s，131.93d，130.29d，128.25d，127.68d，127.11d，72.16t，29.60t，29.41t，29.20t，2 7.21t，25.88t，25.60t，22.52t，20.53t，14.24q.Z，Z，Z，Z，Z，Z-(4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯氧基)乙酸(4d)[β-氧雜25∶6(n-3)]1H n.m.r.(200MHz，CDCL3)δ 0.97(3H，t，J7.5Hz，C22′-H3)，1.65-1.78(2H，m，C2′-H2)，2.01-2.21(4H，m，C3′-H2，C21′-H2)，2.75-2.92(10H，m，C6′-H2，C9′-H2，C12′-H2，C15′-H2，C18′-H2)，3.57(2H，t，J6.4Hz，C1′-H2)，4.12(2H，s，C2-H2)，5.28-5.46(12H，m，C4′-H，C5′-H，C7′-H，C8′-H，C10′-H，C11′-H，C13′-H，C14′-H，C16′-H，C17′-H，C19′-H，C20′-H)，10.22(1H，br.CO2H)；13C n.m.r.(50MHz，CDCl3)δ 172.99s，132.04d，128.98d，128.75d，128.59d，128.49d，128.38d，128.28d，128.22d，128.17d，128.08d，127.86d，127.01d，71.48s，29.26t，25.64t，25.59t，25.54t，23.55t，14.25q.Z，Z，Z，Z-(6，9，12，15-十八碳四烯氧基)乙酸(4e)[β-氧雜21∶4(n-3)]1H n.m.r.(200MHz，CDCL3)δ 0.97(3H，t，J7.5Hz，C18′-H3)，1.33-1.40(4H，m，C3′-H2，C4′-H2)，1.54-1.68(2H，m，C2′-H2)，2.00-2.15(4H，m，C5′-H2，C17′-H2)，2.77-2.87(6H，m，C8′-H2，C11′-H2，C14′-H2)，3.56(3H，t，J6.6Hz，C1′-H2)，4.1 1(2H，s，C2-H2)，5.24-5.45(8H，m，C6′-H，C7′-H，C9′-H，C10′-H，C12′-H，C13′-H，C15′-H，C16′-H)；13C n.m.r.(50MHz，CDCl3)δ172.05s，132.03d，139.92d，128.53d，128.35d，128.08d，128.01d，127.94d，127.04d，71.10t，29.34t，27.10t，25.64t，25.55t，20.55t，14.25q.β和γ硫雜酯肪酸的合成
aR ＝ CH3(CH2)4(CHcis＝CHCH2)4(CH2)3-bR ＝ CH3(CH2)4(CHcis＝CHCH2)3(CH2)4-cR ＝ CH3CH2(CHcis＝CHCH2)3(CH2)7-dR ＝ CH3CH2(CHcis＝CHCH2)6(CH2)2-試劑脂肪溴(1a-1d)-通過在二氯甲烷中用三苯基膦和四溴化碳處理相應的脂肪醇合成而得花生四烯醇-Nu Chek Prep.γ-亞麻醇-Nu Chek Prep.亞麻醇-Nu Chek Prep.二十二碳六烯醇-Nu Chek Prep.巰基乙酸-Aldrich Chemical Company巰基丙酸-Aldrich Chemical Company所有溶劑用前重蒸。
柱層析在正氮氣壓下在Merck Silica Gel 60(230-400目)，Art.9385上進行。步驟烷硫基乙酸3a-d在干燥氮氣下，在兩口圓底燒瓶中鈉(3mol當量)溶于甲醇，并向此攪拌的溶液中加入巰基乙酸(12.mol當量)。當最初形成的白色沉淀溶解后，通過注射器加入溶于乙醚的相應溴化物1(1mol當量)的溶液，此混合物在氮氣和室溫條件下攪拌16小時。粗反應混合物傾入等體積的鹽酸中(10％v/v)并用乙醚萃取。得到的萃取物在干燥氮氣流下濃縮并用硅膠閃式層析純化，用己烷/乙醚/乙酸(40∶60∶2)洗脫，得到相應的油狀烷硫基乙酸3。烷硫基丙酸5a-c烷硫基丙酸5a-c是脂肪溴1a-c分別與烷硫基丙酸4用同以上描述的制備烷硫基乙酸3a-d類似的方式通過堿縮合合成的。Z，Z，Z，Z-(5，8，11，14-二十碳四烯硫基)琥珀酸7a(5，8，11，14-二十碳四烯硫基)琥珀酸7a在鈉(4.5mol當量)存在下用同以上描述的制備烷硫基乙酸3a-d類似的方式，通過脂肪溴1a(1mol當量)與巰基琥珀酸6(1.2mol當量)縮合合成的。Z，Z，Z，Z-(5，8，11，14-二十碳四烯硫基)乙酸(3a)[β-硫雜23∶4(n-6)]1H n.m.r.(200MHz，CDCL3)δ0.89(3H，t，J6.7Hz，C20′-H3)，1.2 5-1.54(8H，m，C3′-H2，C17′-H2，C18′-H2，C19′-H2)，1.57-1.72(2H，m，C2′-H2)，2.01-2.14(4H，m，C4′-H2，C16′-H2)，2.67(2H，t，J 7.2Hz，C1′-H2)，2.7 3-2.88(6H，m，C7′-H2，C10′-H2，C13′-H2)，3.25(2H，s，C2′-H2)，5.27-5.4 7(8H，m，C5′-H，C6′-H，C8′-H，C9′-H，C11′-H，C12′-H，C14′-H，C15′-H)；13C n.m.r.(50MHz，CDCl3)δ175.69s，130.49d，129.54d，128.56d，128.27d，128.15d，127.89d，127.55d，33.45t，32.70t，31.51t，30.38t，29.32t，28.62t，28.46t，27.23t，26.73t，25.65t，22.57t，14.05q.Z，Z，Z，Z-(6，9，12-十八碳三烯硫基)乙酸(3b)[β-硫雜21∶3(n-6)]1H n.m.r.(200MHz，CDCL3)δ 0.89(3H，t，J6.6Hz，C18′-H3)，1.23-1.48(10H，m，C3′-H2，C4′-H2，C15′-H2，C16′-H2，C17′-H2)，1.52-1.70(2H，m，C2′-H2)，1.89-2.15(4H，m，C5′-H2，C14′H2)，2.63(2H，t，J7.0Hz，C1′-H2)，2.70-2.87(4H，m，C8′-H2，C11′-H2)，3.26(2H，s，C2-H2)，5.29-5.47(6H，m，C6′-H，C7′-H，C9′-H，C10′-H，C12′-H，C13′-H)；13C n.m.r.(50MHz，CDCl3)δ176.54s，130.41d，129.86d，128.367d，128.11d，128.03d，128.59d，33.49t，32.74t，31.52t，30.36t，29.31t，29.14t，28.81t，28.34t，27.21t，27.05t，25.63t，22.55t，14.04q.Z，Z，Z-(9，12，15-十八碳三烯硫基)乙酸(3c)[β-硫雜21∶3(n-3)]1H n.m.r.(200MHz，CDCL3)δ 0.89(3H，t，J6.7Hz，C18′-H3)，1.21-1.52(10H，m，C3′-H2，C4′-H2，C5′-H2，C6′-H2，C7′-H2)，1.54-1.72(2H，m，C2′-H2)，2.01-2.15(4H，m，C8′-H2，C17′-H2)，2.67(2H，t，J7.2Hz，C1′-H2)，2.73-2.87(4H，m，C11′-H2，C14′-H2)，3.25(2H，s，C2-H2)，5.27-5.48(6H，m，C9′-H，C10′-H，C12′-H，C13′-H，C15′-H，C16′-H)；13C n.m.r.(50MHz，CDCl3)δ176.21s，131.94d，130.29d，128.26d，127.69d，127.11d，33.49t，32.82t，30.39t，29.60t，29.36t，29.20t，29.12t，28.89t，28.70t，27.21t，25.61t，25.52t，20.53t，14.25q.Z，Z，Z，Z，Z，Z，Z-(9，12，15-十八碳三烯硫基)乙酸(3d)[β-硫雜25∶6(n-3)]1H n.m.r.(200MHz，CDCL3)δ 0.99(3H，t，J 7.5Hz，C22′-H3)，1.62-1.77(2H，m，C2′-H2)，2.02-2.24(4H，m，C3′-H2，C21′-H2)，2.68(2H，t，J7.4Hz，C1′-H2)，2.83-2.85(10H，m，C6′-H2，C9′-H2，C12′-H2，C15′-H2，C18′-H2)，3.26(2H，s，C2-H2)，5.29-5.47(12H，m，C4′-H，C5′-H，C7′-H，C8′-H，C10′-H，C11′-H，C13′-H，C14′-H，C16′-H，C17′-H，C19′-H，C20′-H)；13C n.m.r.(50MHz，CDCl3)δ176.37s，132.01d，128.94d，128.68d，128.55d，128.24d，128.18d，128.12d，128.07d，127.85d，126.99d，3 3.41t，32.21t，28.67t，26.12t，25.64t，25.22t，20.53t，14.24q.Z，Z，Z，Z-(5，8，11，14-二十碳四烯硫基)丙酸(5a)[γ-硫雜24∶4(n-6)]1H n.m.r.(300MHz，CDCL3)δ0.89(3H，t，J6.8Hz，C20′-H3)，1.26-1.38(6H，m，C17′-H2，C18′-H2，C19′-H2)，1.41-1.51(2H，m，C3′-H2)，1.56-1.66(2H，m，C2′-H2)，2.02-2.12(4H，m，C4′-H2，C16′-H2)，2.54(2H，t，J7.3Hz，C1′-H2)，2.66(2H，t，J6.6Hz，C3′-H2)，2.78(2H，t，J6.6Hz，C2-H2)，2.78-2.86(6H，m，C7′-H2，C10′-H2，C13′-H2)，5.29-5.44(8H，m，C5′-H，C6′-H，C8′-H，C9′-H，C11′-H，C12′-H，C14′-H，C15′-H)；13C n.m.r.(50MHz，CDCl3)δ178.22s，130.37d，129.58d，128.46d，128.19d，128.10d，128.03d，127.81d，127.48d，34.68t，32.046t，31.44t，29.25t，29.01t，28.67q，27.15t，26.70t，26.54t，25.57t，22.50t，13.98q.Z，Z，Z-(6，9，12-十八碳三烯硫基)丙酸(5b)[γ-硫雜22∶3(n-6)]1H n.m.r.(200MHz，CDCL3)δ 0.89(3H，t，J6.8Hz，C18′-H3)，1.25-1.42(10H，m，C3′-H2，C4′-H2，C15′-H2，C16′-H2，C17′-H2)，1.53-1.65(2H，m，C2′-H2)，2.01-2.10(4H，m，C5′-H2，C14′-H2)，2.53(2H，t，J7.3Hz，C1′-H2)，2.66(2H，t，J6.8Hz，C3′-H2)，2.78(2H，t，J6.8Hz，C2-H2)，2.74-2.83(4H，m，C8′-H2，C11′-H2)，5.26-5.47(6H，m，C6′-H，C7′-H，C9′-H，C10′-H，C12′-H，C13′-H)；13C n.m.r.(50MHz，CDCl3)δ178.14s，130.38d，129.90d，128.33d，128.10d，127.97d，127.5 8d，34.69t，32.13t，31.49t，29.41t，29.29t，29.18t，28.46t，27.19t，27.06t，26.58t，25.61t，14.03q.Z，Z，Z-(9，12，15-十八碳三烯硫基)丙酸(5c)[γ-硫雜22∶3(n-3)]1H n.m.r.(200MHz，CDCL3)δ0.98(3H，t，J7.5Hz，C18′-H3)，1.26-1.35(10H，m，C3′-H2，C4′-H2，C5′-H2，C6′-H2，C7′-H2)，1.51-1.65(2H，m，C2′-H2)，1.98-2.1 5(4H，m，C8′-H2，C17′-H2)，2.53(2H，t，J7.3Hz，C1′-H2)，2.66(2H，t，J6.7Hz，C3′-H2)，2.78(2H，t，J7.3Hz，C1′-H2)，2.66(2H，t，J6.7Hz，C3′-H2)，2.78(2H，t，J6.7Hz，C2-H2)，2.75-2.84(4H，m，C11′-H2，C14′-H2)，5.27-5.46(6H，m，C9′-H，C10′-H，C12′-H，C13′-H，C15′-H，C16′-H)；13C n.m.r.(50MHz，CDCl3)δ178.03s，131.92d，130.28d，128.24d，127.66d，127.10d，34.67t，32.19t，29.58t，29.50t，29.37t，29.20t，29.16t，28.81t，27.19t，26.59t，25.59t，25.50t，20.52t，14.245q.Z，Z，Z，Z-(5，8，11，14-十八碳四烯硫基)琥珀酸(7a)[α-羧甲基-β-硫雜23∶4(n-6)]1H n.m.r.(300MHz，CDCL3)δ0.89(3H，t，J6.8Hz，C20′-H3)，1.23-1.53(8H，m，C3′-H2，C17′-H2，C18′-H2，C19′-H2)，1.56-1.70(2H，m，C2′-H2)，2.03-2.13(4H，m，C4′-H2，C16′-H2)，2.65-2.86(9H，m，C7′-H2，C10′-H2，C13′-H2，C1′-H2，CHHCO2H)，3.01(1H，dd，J12.1，17.6Hz，CHHCO2H)，3.64(1H，dd，J4.0，12.1Hz，C2-H)，5.32-5.43(8H，m，C5′-H，C6′-H，C8′-H，C9′-H，C11′-H，C12′-H，C14′-H，C15-H，)；羥基和氫過氧基衍生物的合成花生四烯酸(圖1b-1g)的氫過氧化衍生物分別從圖1a的酶催化反應獲得，或做為圖1a自身氧化的混合物。圖1b-1g自身氧化混合物的成分按比例依賴于反應條件而變化，它們可以由硅膠高效液相色譜分離。圖1b-1g的氫過氧化物的還原，或單獨地或做為混合物生成圖1h-1m相應的醇。通過用各種試劑包括相應的烷基或芳基次鹵酯(ROX)的處理，這些化合物可被轉變成圖1n(R-烷基或芳基)相應的過氧化物，它們具有如圖1b-1g氫過氧化物和圖1h-1m醇的同樣取代類型。圖1h-1m醇或圖1n過氧化物的混合物也能夠用高效液相色譜分離。
在相似的方式中，其它天然產(chǎn)生的不飽和脂肪酸(如22∶6(n-3))，和修飾的脂肪酸如圖1o-1x(Y-H)以及由有關的除花生四烯酸外的酸精制加工制備的化合物也能夠用于制備類似于圖1b-1n的圖1o-1x(Y＝OOH，OH，OOR)的氫過氧化、羥基和過氧化衍生物，其中圖1b-1n的取代類型由烯丙基氧化測定。圖1o到圖1p(Y＝H)的酸可以通過圖1a相應醛的醇醛縮合制備，圖1p也可以通過相同醛或相應鹵化物的Wittig反應制備，而圖1q的酸可以通過相應C19醛或鹵化物的Wittig反應制備。圖1r的酸可以通過圖1a相應酯的醇醛縮合制備，而圖1s-1x通過醚或硫醚經(jīng)親核取代或金屬催化的偶聯(lián)反應合成獲得，圖1v-1x的硫醚可以被氧化成相應亞砜或砜。圖1y和圖1z的氨基酸衍生物可以通過相應脂肪酸(圖1a)分別與甘氨酸及天冬氨酸縮合獲得。羥基β-氧雜脂肪酸的合成
試劑β-氧雜脂肪酸(1，3)-從相應脂肪醇通過乙酸銠催化與重氮乙酸酯縮合合成。三苯基膦-Aldrich Chemical Company磷酸二氫鉀-Ajax Chemicals大豆15-脂肪氧合酶-Aldrich Chemical Company所有溶劑用前重蒸。
制備薄層層析在含石膏的Merck Silica Gel 60 PF254Art.7749上進行。步驟羥基β-氧雜脂肪酸2和4相應脂肪酸1和3(約50mg)在30℃溶于磷酸緩沖液(0.1M，pH＝9.0，約45ml)。加入溶于磷酸緩沖液(約5ml)的大豆15-脂肪氧合酶(約8mg)并鼓泡氧氣到攪拌溶液10分鐘。加入溶于二氯甲烷(約50ml)的三苯基膦(約50mg)隨后加入乙酸(0.2M，約20ml)，溶液在0℃攪拌20分鐘。粗反應混合物用二氯甲烷萃取，生成的萃取物在干燥氮氣流下濃縮。殘留物用硅膠制備薄層層析純化，用乙酸乙酯/己烷/乙酸(80∶20∶0.1)洗脫，得到油狀相應羥基β-氧雜脂肪酸2或4。Z，Z，E-(13-羥基-6，9，11-十八碳三烯氧基)乙酸(2)[16′-OH-β-氧雜21∶3(n-6)]1H n.m.r.(300MHz，CDCL3)δ 0.89(3H，t，J6.8Hz，C18′-H3)，1.25-1.45(10H，m，C3′-H2，C4′-H2，C15′-H2，C16′-H2，C17′-H2)，1.59-1.73(2H，m，C2′-H2)，2.01-2.12(4H，m，C5′-H2，C14′-H2)，2.81(2H，t，J5.8Hz，C8′-H2)，3.52-3.60(2H，m，C1′-H2)，4.10(2H，s，C2-H2)，4.20(1H，dt，J6.0，6.7Hz，C13′-H)，5.29-5.45(3H，m，C6′-H，C7′-H，C9′-H)，5.70(1H，dd，J6.7，15.2Hz，C12′-H)，5.99(1H，dd，J10.9Hz，C10′-H)，6.55(1H，dd，J10.9，15.2Hz，C11′-H)。Z，E，Z-(13-羥基-9，11，15-十八碳三烯氧基)乙酸(4)[16′-OH-β-氧雜21∶3(n-6)]1H n.m.r.(300MHz，CDCL3)δ 0.95(3H，t，J7.6Hz，C18′-H3)，1.17-1.40(10H，m，C3′-H2，C4′-H2，C5′-H2，C6′-H2，C7′-H2)，1.48-1.63(2H，m，C2′-H2)，1.99-2.12(2H，m，C8′-H2)，2.13-2.22(2H，m，C14′-H2)，2.28-2.37(2H，m，C17′-H2)，3.44-3.50(2H，m，C1′-H2)，3.80-3.92(2H，s，C2′-H2)，4.14-4.20(1H，dt，J6.4，14.9Hz，C13′-H)，5.30-5.60(3H，m，C9′-H，C15′-H，C16′-H)，5.67(1H，dd，J6.4，14.9Hz，C12′-H)，5.95(1H，dd，J11.1，J11.1Hz，C10′-H)，6.49(1H，dd，J11.1，14.9Hz，C11′-H)。新的脂肪酸對酯酰-輔酶A-氧化酶作用的影響脂肪酸的β-氧化β-氧化是脂肪酸(1)主要的氧化代謝歸宿，其凈過程特征為脂肪酸碳鏈兩個碳原子的降解，并伴隨等摩爾量的乙酰-輔酶A產(chǎn)生(圖式1)。
圖式1脂酰-輔酶A-氧化酶β-氧化途徑的第一步由脂酰-輔酶A-氧化酶控制。在過氧化物酶體中，脂酰-輔酶A-氧化酶催化脂酰-輔酶A硫酯與氧反應產(chǎn)生烯酰輔酶A硫酯。在過氧化物酶存在下，伴隨產(chǎn)生的過氧化氫被循環(huán)回氧，并相對于每摩爾氧化的脂酰-輔酶A-硫酯凈生成一摩爾水。新的脂肪酸期望β-位含有一個封閉基團的脂肪酸對β-氧化的通常過程為惰性的。因此合成了在β-位含有雜原子的新脂肪酸。用于本研究的化合物為花生四烯氧乙酸[β-氧雜23∶4(n-6)]，γ-亞麻氧乙酸[β-氧雜21∶3(n-6)]，亞麻氧乙酸[β-氧雜21∶3(n-3)]，和花生四烯硫乙酸[β-硫雜23∶4(n-6)]。還研究了花生四烯硫丙酸[γ-硫雜22∶4(n-6)]的氧化以評價脂肪酸γ-位的封閉基團對β-氧化的影響。脂酰-輔酶A氧化酶實驗節(jié)細菌(Arthrobacter)的脂酰-輔酶A氧化酶從Boehringer Mannheim以穩(wěn)定片劑形式得到，并普遍與脂酰-輔酶A合成酶一起使用來測量血清或血漿中的游離酸。實驗原理在脂酰-輔酶A合成酶(acyl CS)的存在下，游離脂肪酸被5′-三磷酸腺苷(ATP)和輔酶A(CoA)轉化為脂酰-輔酶A(脂酰-CoA)，導致產(chǎn)生5′-單磷酸腺苷(AMP)和焦磷酸鹽。
脂酰-CoA在脂酰-CoA-氧化酶(ACOD)的存在下與氧(O2)反應，形成2，3-烯酰-輔酶A(烯酰-CoA)，同時產(chǎn)生過氧化氫。
生成的過氧化氫(H2O2)在過氧化酶(POD)存在下把4-氨基安替比林(4-AA)和2，4，6-三溴-3-羥基苯甲酸(TBHB)轉變?yōu)榧t色染料。在546nm可見光區(qū)測定該染料。實驗步驟波長546nm微量樣品池 1cm光程溫度25℃(±1℃)實驗體積1.15ml反應混合物的測量隔絕空氣加入到樣品池1.00ml 反應混合液KH2PO4(87mmol/l)，Mg2+(1.3mmol/l)，ATP(1.5mmol/l)，CoA(0.26mmol/l)，POD(21.7 kU/l)，脂酰CS(165U/l)0.05ml游離脂肪酸樣品溶液[空白測試用0.05ml蒸餾水代替]樣品混合并在25℃加熱約10分鐘。隨后加入0.05mlN-乙基順丁烯二酰亞胺溶液(0.86mmol/l)在加入0.05mlACOD溶液(8.7kU/l)后，于546nm測定溶液的吸光值(A1)。
在t＝反應混合液中加入ACOD后10秒鐘時，測定20分鐘內(nèi)溶液在546nm可見吸光值的變化。實驗定標/鑒定樣品濃度依賴性用以下濃度測定花生四烯酸(20∶4(n-6)，10)4.3mM，2.1mM，0.99mM，0.49mM，0.25mM和0mM(空白)。
圖1中各圖的測試顯示速度對脂肪酸濃度的依賴性。酶(ACOD)濃度依賴性用如下脂酰-CoA氧化酶濃度測定在0.99mM濃度的花生四烯酸(20∶4(n-6)，10)樣品溶液。200kU/l，100kU/l和50kU/l。
圖2中各圖的測試顯示速度對酶(ACOD)濃度的依賴性。新脂肪酸的測試用濃度100kU/l的脂酰-CoA氧化酶測試濃度分別為1.0mM，1.0mM，1.0mM，1.0mM和1.1mM的新化合物溶液。
圖3-6各圖的分別測試表明β-氧雜化合物和β-硫雜化合物都不是脂酰-CoA氧化酶的底物(圖11A)。新化合物對通過脂酰-CoA氧化酶的花生四烯酸代謝的影響含有等摩爾濃度花生四烯酸(10)及各新化合物的樣品溶液用100kU/l濃度的脂酰-CoA氧化酶進行測定。
實驗顯示新化合物對脂酰-CoA氧化酶攝取花生四烯酸沒有影響。
而且，含有新化合物與花生四烯酸相對濃度為4∶1和16∶1的樣品被測定后表明對脂酰-CoA氧化酶攝取花生四烯酸沒有可觀的影響(未示)。脂肪酸對氨基酸的共價偶聯(lián)多不飽和脂肪酸(1.80mmol)，HOSu(0.41g，3.60mmol)和氨基酸叔丁基酯(3.60mmol)一起溶于二甲基甲酰胺(3mL)，并且該混合物在冰浴中冷卻。加入溶于DMF(0.3mL)的二環(huán)己基碳二亞胺(0.44g，2.16mmol)和N-甲基嗎啡啉(0.73g，7.20mmol)。該混合物攪拌20小時，此后仍存留一些未反應的多不飽和脂肪酸。再加入DCC(0.10g)，混合物再攪拌20小時。濾去DCU，通過反相HPLC分離產(chǎn)物。純化的產(chǎn)物濃縮成油狀并加入三氟乙酸(30ml)。攪拌1小時后蒸除三氟乙酸，剩下的產(chǎn)物為棕色油狀，再將其溶于CH3CN(6ml)，并用反相HPLC純化。得到的純組分合并，濃縮并冷凍干燥(在叔丁醇中)，剩下棕色油狀的產(chǎn)物。表1新脂肪酸的直接抗瘧活性化合物 EC50(μM)β-氧雜21∶3(n-6)＜30β-氧雜21∶3(n-3)30β-氧雜21∶4(n-3)40β-硫雜21∶3(n-6)30-50β-硫雜21∶3(n-3)30-35β-氧雜25∶6(n-3)＜60γ-硫雜22∶9(n-6)45γ-硫雜22∶3(n-6)45β-氧雜23∶4(n-6)＜30β-硫雜23∶4(n-6)15-30γ-硫雜24∶4(n-6)15β-硫雜25∶6(n-3)25α-羧甲基-β-硫雜23∶4(n-6) 5016-OH-β-氧雜21∶3(n-6) 5016-OH-β-氧雜21∶3(n-3) 40表2脂肪酸激活中性白細胞介導的抗瘧活性化合物 相對于22∶6在16μM的百分抑制率β-氧雜21∶3(n-3) 45β-氧雜21∶4(n-3) 85β-硫雜21∶3(n-6) 85β-硫雜21∶3(n-3) 73β-硫雜23∶4(n-6) 150γ-硫雜24∶4(n-6) 91β-硫雜25∶6(n-3) 4716-OH-β-氧雜21∶3(n-6) 33表3MP8，MP11，MP14對KI氯喹耐藥株P.FALCIPARUM的作用化合物 百分生長抑制率氯喹 12.4β-硫雜23∶4(n-6)97γ-硫雜24∶4(n-6)97β-硫雜25∶6(n-3)98表4脂肪酸對促細胞分離劑誘導的末梢血單核細胞繁殖的作用化合物20μMPUFA誘導的繁殖百分抑制率β-氧雜21∶3(n-6) 17β-硫雜21∶3(n-3) 28β-硫雜25∶6(n-3) 9716-OH-β-氧雜21∶3(n-6) 50表5PUFA對PHA誘導的TNFα生產(chǎn)的作用化合物細胞因子生產(chǎn)的百分抑制率(20μM PUFA)β-氧雜21∶3(n-6) 38β-氧雜21∶3(n-3) 39β-硫雜21∶3(n-6) 17β-硫雜21∶3(n-3) 17γ-硫雜22∶3(n-6) 41γ-硫雜22∶3(n-3) 25β-氧雜23∶4(n-6) 25β-硫雜23∶4(n-6) 35γ-硫雜24∶4(n-6) 34β-硫雜25∶6(n-3) 9016-OH-β-氧雜21∶3(n-6)7116-OH-β-氧雜21∶3(n-3)68表6PUFA對金黃色葡萄球菌誘導的由末梢血單核細胞生產(chǎn)的干擾素γ的作用化合物 百分抑制率(20μM PUFA)β-氧雜21∶3(n-6) 89β-硫雜21∶3(n-6) 45β-氧雜25∶6(n-3) 44β-氧雜23∶4(n-6) 89β-硫雜23∶4(n-6) 64β-硫雜25∶6(n-3) 9616-OH-β-氧雜21∶3(n-6)7716-OH-β-氧雜21∶3(n-3)6權利要求
1.具有抗瘧和/或中性白細胞激活活性的多不飽和脂肪酸化合物，該多不飽和脂肪酸含有18-25個碳和1-6個雙鍵，其中在多不飽和脂肪酸化合物上有一個或兩個選自β氧雜、γ氧雜、β硫雜和γ硫雜基團的取代基。
2.權利要求1的多不飽和脂肪酸化合物，其中該多不飽和脂肪酸化合物包括選自含有羥基、氫過氧基、過氧基、羧甲基取代基團的進一步的取代或連接到一個氨基酸上。
3.權利要求1或2的多不飽和脂肪酸化合物，其中該多不飽和脂肪酸化合物含有20-25個碳原子和3-6個雙鍵。
4.權利要求1-3任一個的多不飽和脂肪酸化合物，其中多不飽和脂肪酸化合物是一個n-3到n-6脂肪酸。
5.權利要求1-4任一個的多不飽和脂肪酸化合物，其中多不飽和脂肪酸化合物是含有β氧雜或β硫雜取代的、有3-4個雙鍵的21碳。
6.權利要求1-4任一個的多不飽和脂肪酸化合物，其中多不飽和脂肪酸化合物是含有γ硫雜或β氧雜取代的、有3-4個雙鍵的22碳。
7.權利要求1-4任一個的多不飽和脂肪酸化合物，其中多不飽和脂肪酸化合物是含有β硫雜取代的、有3-4個雙鍵的23碳。
8.權利要求1-4任一個的多不飽和脂肪酸化合物，其中多不飽和脂肪酸化合物是含有γ硫雜取代的、有3-4個雙鍵的24碳。
9.權利要求1-4任一個的多不飽和脂肪酸化合物，其中多不飽和脂肪酸化合物是含有β氧雜取代的、有3-6個雙鍵的25碳。
10.權利要求1-4任一個的多不飽和脂肪酸化合物，其中多不飽和脂肪酸化合物是含有β硫雜取代的、有3-6個雙鍵的25碳。
11.權利要求1-10任一個的多不飽和脂肪酸化合物，其中多不飽和脂肪酸化合物有ω羥基取代。
12.權利要求1-4任一個的多不飽和脂肪酸化合物，其中多不飽和脂肪酸化合物含有β硫雜和α-羧甲基基團的3-6個雙鍵的23碳。
13.權利要求1-4任一個的多不飽和脂肪酸化合物，其中多不飽和脂肪酸化合物是通過羧基端與氨基酸共價連接。
14.權利要求13的多不飽和脂肪酸化合物，其中多不飽和脂肪酸化合物共價連接到天冬氨酸或甘氨酸上。
15.一種制備不飽和的、氧雜取代的脂肪酸的方法，它包括不飽和脂肪酸醇與卡賓反應使卡賓插入到醇的O-H鍵中。
16.權利要求15的方法，其中不飽和脂肪酸醇含有18-25個碳原子和1-6個雙鍵。
17.權利要求15或16的方法，其中卡賓通過乙酸銠催化的重氮化合物合成。
18.權利要求15-17任一個的方法，其中生產(chǎn)不飽和β氧雜取代的脂肪酸。
18.治療患者炎癥的方法，該方法包括給患者服用治療有效量的一種抗炎組合物，該組合物含有至少一個多不飽和脂肪酸的羥基、氫過氧基、或過氧基的衍生物，該多不飽和脂肪酸衍生物含有18-24個碳原子碳鏈和1-6個順式或反式雙鍵。
19.權利要求18的方法，其中多不飽和脂肪酸在碳鏈上含有氧或硫原子做為氧雜或硫雜衍生物。
20.權利要求18的方法，其中多不飽和脂肪酸選自C204n-6(5，8，11，14-二十碳四烯酸)、C205n-3(5，8，11，14，17-二十碳五烯酸)、C226n-3(4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酸)和花生四烯酸。
全文摘要
本發(fā)明提供了具有抗瘧和/或中性白細胞刺激活性的多不飽和脂肪酸化合物。該多不飽和脂肪酸含有18-25個碳和1-6個雙鍵，其特征在于它們有一個或兩個選自β氧雜、γ氧雜、β硫雜和γ硫雜的取代基。多不飽和脂肪酸化合物還優(yōu)選包括自羥基、氫過氧基、過氧基、羧甲基基團的進一步取代或連接到一個氨基酸上。本發(fā)明也提供了一種制備不飽和氧雜取代脂肪酸的方法，它包括不飽和脂肪酸醇與卡賓反應，使卡賓插入到醇的O-H鍵中。本發(fā)明進一步提供了一種用組合物治療炎癥的方法，該組合物含有至少一個具有C
文檔編號C07C235/00GK1163609SQ95196205
公開日1997年10月29日 申請日期1995年10月13日 優(yōu)先權日1994年10月13日
發(fā)明者安東尼奧·費蘭特, 阿爾弗雷德·保羅斯, 克里斯托弗·約翰·伊斯頓, 邁克爾·約瑟夫·皮特, 托馬斯·阿里斯泰爾·羅伯遜, 德博拉·安·拉思簡 申請人:肽技術有限公司, 阿德萊德婦幼醫(yī)院