專利名稱：從體液中提取纖維結(jié)合蛋白的生產(chǎn)工藝的制作方法
纖維結(jié)合蛋白(Fibronectin，F(xiàn)n)，又名纖維連接蛋白，纖粘素等。文獻中也使用以下名稱CIG，anti-gelatin factor，microfibrillar protein，opsonic protein，fibroblast surface antigen(FSA)，soluble fibroblast antigen(SF-antigen)，galactoprotein a，cell surface protein(CSP)，cell attachment factor (CAF)，cell spreading factor，large external transformation-sensisive(LEFS)protein，Zeta(Z)等。
纖維結(jié)合蛋白是一種高分子量冷凝蛋白，分子量約45K，存在于人及動物的體液(血液、羊水、組織液)及細胞表面及間質(zhì)中，具有誘導細胞分化、增殖、連接細胞和間質(zhì)、參與血液凝固、傷口愈合和機體防御等多種功能，是機體的重要組分。
對近20年(1972～1992)國際國內(nèi)專利文獻及科學文獻的查新表明，以往已有一些提取纖維結(jié)合蛋白的方法(Ruoslahti E等Methods in Enzymol 1982;82803及Isumera M等 J Biochem 1981;901)，國外已有二個專利(Ep38462-A，1986;WO63483，1988)。國內(nèi)尚無與本發(fā)明類似的專利申請。
現(xiàn)有的提取纖維結(jié)合蛋白的方法在提取中，使用多種大量的蛋白酶抑制劑，同時，采用三步或三步以上的層析步驟，使所用試劑藥品增加，成本上升，而且提取手續(xù)繁雜，纖維結(jié)合蛋白的產(chǎn)生率不高?，F(xiàn)有的提取方法局限于血液，原料來源受到限制。
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供一種從體液中提取纖維結(jié)合蛋白的生產(chǎn)工藝。本發(fā)明不僅降低了成本，簡化了提取步驟，增加了產(chǎn)品的產(chǎn)出率，而且提高了產(chǎn)品的純度。本發(fā)明可廣泛應(yīng)用于人及多種動物的多種體液(包括血液、羊水和組織液)，開拓了更廣泛更廉價的原料來源。
為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明者采取的生產(chǎn)工藝是(1)獲取體液;(2)加入苯甲磺酰氟，低溫超速離心;(3)加樣于預制好的溴化氰瓊脂糖凝膠白明膠層析柱，緩沖液洗脫纖維結(jié)合蛋白;(4)提取的纖維結(jié)合蛋白過濾、測量、無菌凍干;(5)提取的纖維結(jié)合蛋白生物學功能檢測。本發(fā)明者注意到，纖維結(jié)合蛋白在進化過程中表現(xiàn)出很強的穩(wěn)定性，人及各種動物體液中纖維結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)近似，主要的生物學功能相同。這為本發(fā)明的纖維結(jié)合蛋白的獲取提供了廣泛的價廉的原料。本發(fā)明根據(jù)纖維結(jié)合蛋白的分子量、冷凝性質(zhì)。以及纖維結(jié)合蛋白與纖維蛋白、白明膠、原膠元有強烈親和能力的理化特性，設(shè)計了本發(fā)明的生產(chǎn)工藝。
首先采集人和多種動物，如?；蝰R或豬或其他動物的體液，如血液或羊水或組織液，立即加入1/10的3～10%的枸椽鈉抗凝(血液)，同時用0.1～0.3mol/L的苯甲磺酰氟(市售)抑制蛋白酶活性，保持在0～4℃低溫下，并低溫超速離心，0±1℃，7，500～25，000 RPM，10～40分鐘，取上清液。
上清液加樣于緩沖液A(主要含0.5～1mol/L Ttris-HCL，0.1～0.2mol/L PMSF，0.5～5%NaCl(溶液)平衡的白明膠瓊脂糖凝膠層析柱上，瓊脂糖凝膠和白明膠為市售產(chǎn)品。層析柱預先以溴化氰活化，活化液中主要含四硼酸鈉0.1～0.2mol/L，偶聯(lián)緩沖液主要含乙醇胺0.5～2mol/L，疊氮鈉0.1～1mol/L，以上試劑均為市售產(chǎn)品。以ZY-1型紫外分光光度計(280nm)監(jiān)測，以含脲緩沖液B洗，含脲緩沖液B主要含Tris-HCl 0.5～1mol/L，PMSF 0.1～0.2mol/L，脲3-8mol/L。在兩小時中，50ml容積的瓊脂糖凝膠白明膠親和層析柱可以加入350～500ml樣品。再用含高濃度Na+的緩沖液B洗下纖維結(jié)合蛋白。整個親和層析過程應(yīng)在0～5℃進行。提取的纖維結(jié)合蛋白可達電泳純，儲存于3～8mol/L的脲緩沖液B中。纖維結(jié)合蛋白經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾除菌，用分光光度計測定，280nm處吸收，計算纖維結(jié)合蛋白產(chǎn)量，分裝，無菌冷凍干燥。
提取的纖維結(jié)合蛋白以1～1.5%瓊脂糖恒壓5～8V/cm電泳，結(jié)果呈單一電泳帶，證明此提取的纖維結(jié)合蛋白純度達電泳純，經(jīng)SDS連續(xù)梯度電泳證明其分子量為45K。分別用抗人及抗馬、抗牛的纖維結(jié)合蛋白血清進行免疫擴散試驗，結(jié)果抗原抗體間呈現(xiàn)清晰的沉淀線，證明提取物為纖維結(jié)合蛋白。應(yīng)用多種細胞活性實驗，包括多種細胞培養(yǎng)、巨噬細胞吞噬活性檢測、細胞動態(tài)形態(tài)計量等方法證明其生物學功能。
本發(fā)明生產(chǎn)工藝較現(xiàn)有技術(shù)方法簡單易行、成本低廉、重復性好、提取率高。血漿纖維結(jié)合蛋白提取率為50mg/100ml。
許多研究發(fā)現(xiàn)，機體內(nèi)纖維結(jié)合蛋白水平失常，可導致許多疾病發(fā)生，如腫瘤、肝臟病、關(guān)節(jié)病、糖尿病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病以及敗血癥，彌慢性血管內(nèi)凝血、休克等。纖維結(jié)合蛋白還在傷口的愈合中起關(guān)鍵性作用。實驗動物模型已證明，纖維結(jié)合蛋白在創(chuàng)傷治療中有明顯效果。如Nishida將少量纖維結(jié)合蛋白涂于大鼠實驗性皮膚傷口表面，傷口愈合速度明顯增快。用纖維結(jié)合蛋白眼藥水滴眼治療角膜漬瘍，用藥第二天表皮大量生長，三周后潰瘍愈合，無疤痕遺留，也無其他副作用。此外，纖維結(jié)合蛋白的凝血作用、治療彌慢性血管內(nèi)凝血(DIC)、敗血癥的作用也非常明顯。因此，纖維結(jié)合蛋白有巨大的開發(fā)利用價值和應(yīng)用前景。
本發(fā)明提取的纖維結(jié)合蛋白可作為生物學醫(yī)學的研究、教學、臨床檢驗的診斷試劑，也可作為細胞培養(yǎng)的重要介質(zhì)。本發(fā)明提取的纖維結(jié)合蛋白可用于治療外傷、燒傷、敗血癥和腫瘤等疾病，還可用于美容護膚及口腔保健牙膏中等。目前國內(nèi)尚無纖維蛋白批量生產(chǎn)和出售。
權(quán)利要求
1.一種從體液中提取纖維結(jié)合蛋白的生產(chǎn)工藝，包括獲取體液，蛋白酶抑制及超速低溫離心，瓊脂糖凝膠白明膠親和層析，提取的纖維結(jié)合蛋白過濾、計量、無菌凍干，及纖維結(jié)合蛋白的生物學功能檢測，其特征在于(1)獲取體液后，立即加入1/10的3-10%枸櫞酸鈉溶液抗凝，同時用0.1～0.3mol/L的苯甲磺酰氟抑制蛋白酶活性，并保持在0.4℃，然后在0±1℃，以7，500～25，000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速，超速離心10～40分鐘，取上清液。(2)將白明膠偶聯(lián)于溴化氰活化的瓊脂糖凝膠上，活化液主要含0.1～0.2mol/L四硼酸鈉，然后用主要含0.5～1mol/L Tris-HCl，0.1～0.2mol/L PMSF和0.5～5%NaCl溶液的緩沖液A平衡瓊脂糖凝膠白明膠親和層析柱。加樣品于親和層析柱。紫外分光光度計監(jiān)測，用含3～8mol/L脲的緩沖液B洗脫纖維結(jié)合蛋白。整個親和層析過程應(yīng)在0～5℃進行。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從體液中提取纖維結(jié)合蛋白的生產(chǎn)工藝，其特征在于采集人和多種動物，如馬或羊或豬或牛的體液，如血液或羊水或組織液作為原料。
全文摘要
本發(fā)明屬生物學醫(yī)學中提取纖維結(jié)合蛋白的生產(chǎn)工藝。本發(fā)明應(yīng)用單獨的苯甲磺酰氟抑制蛋白酶活性，并用瓊脂糖凝膠白明膠親和層析技術(shù)一步層析，從人及動物體液(血液、羊水、組織液)中提取可應(yīng)用于生物學醫(yī)學研究、實驗、醫(yī)學臨床及化妝美容的大分子糖蛋白——纖維結(jié)合蛋白(Fibronectin，F(xiàn)n)。本發(fā)明的生產(chǎn)工藝提取纖維結(jié)合蛋白，成本低廉，產(chǎn)品純度高，生產(chǎn)工藝簡單穩(wěn)定，提取率高。
文檔編號C07H15/14GK1088584SQ92113640
公開日1994年6月29日 申請日期1992年12月22日 優(yōu)先權(quán)日1992年12月22日
發(fā)明者向明明, 楊恬 申請人:向明明