專利名稱：載脂蛋白a的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種液相色譜儀分離物質(zhì)的方法，是醫(yī)學(xué)界用于載脂蛋白A1、A2(APOA1、APOA2)的高壓液相色譜儀(HPLC)分離方法。
近年來，各國醫(yī)學(xué)界對載脂蛋白的研究十分活躍，因為它影響到脂蛋白的合成、分泌和代謝，其測定、分離又對冠心病的預(yù)防、診斷和治療，具有重要的臨床價值，所以正受到人們的高度重視和關(guān)注。
自一九八三年日本學(xué)者首次提出使用高壓液相色譜儀分離載脂蛋白以來，迄今為止用該法測定APOA1、APOA2均采用連續(xù)漂浮超速離心法，即將經(jīng)過多次超速離心(轉(zhuǎn)速在5萬轉(zhuǎn)/分以上)的血清HDL上清液進行過濾后，再與洗脫液充分混合，在60℃溫度下加熱5分鐘，而后注入高壓液相色譜儀，分離出APOA1、APOA2，但目前這種測定方法仍停留在研究室中未能全面推廣，其主要原因是血清在進入高壓液相分析柱前必須先由超速離心機分離為HDL、LDL、VLDL，再分別這樣，這一步驟需要儀器昂貴(僅超速離心機的價格就為5萬美元/臺)，耗時長(54-72小時)，手續(xù)復(fù)雜，又因血清離心后的上清液與沉淀物液相界面不清晰，故脂蛋白提取不完全，這對測定精度有一定的影響本發(fā)明的目的在于利用APOA1、APOA2熱凝固點高于血清中其它蛋白的溫度差，建立一種采用加熱法沉淀其它蛋白，經(jīng)普通離心后的上清液直接進樣，一次即可分離APOA1、APOA2的HPLC分離法。本發(fā)明將比原連續(xù)漂浮超速離心法對其它蛋白沉淀更加完全，測定精度更高，由于簡化了操作手續(xù)，故采用普通離心即可完成進一步的分離，且測定時間短，投資費用低。
本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的將裝在密封試管中的血清標(biāo)本，首先在沸水中加熱，取其經(jīng)離心、過濾的上清液與洗脫液充分混合后，直接注入HPLC，一次分離APOA1、APOA2，洗脫液由0.05MNa2SO4、0.02MNaH2PO4、0.1%S.D.S(十二烷基磺酸鈉)、0.05%NaN3組成，其PH＝6.8。
本發(fā)明使用的儀器1、高壓液相柱包括BiO-Sil TSK予柱75×7.5mm，Bil-Sil TSK250凝膠分離柱300×7.5mm，Bil-Sil TSK400凝膠分離柱300×7.5mm，上述三柱連接使用。
2、高壓液相儀高壓液相泵資料處理儀、分光光度儀、離心機。
試劑與標(biāo)準用于凝膠分離柱分子量試劑為純APOA1標(biāo)準品、純APOA2標(biāo)準品。
操作步驟血清在沸水中(100℃)加熱5分鐘，然后經(jīng)4000轉(zhuǎn)(11600g)離心10分鐘，其上清液經(jīng)0.22mm過濾片過濾后與洗脫液充分混合，直接注入分離柱，過柱后使用紫外可見光檢測器，波長(A)280mm，流速1-2ml/分，用純APOA1、APOA2標(biāo)準品作外標(biāo)定量。


圖1、對數(shù)分子量和保留時間曲線圖2、純APOA1、APOA2高壓液相圖譜圖3、HDL高壓液相圖譜圖4、血清加熱100℃、5分鐘，上清液高壓液相圖譜圖5、APOA1加入量和測得濃度相關(guān)關(guān)系圖。
圖6、APOA2加入量和實測濃度相關(guān)關(guān)系圖。
APOA1、APOA2波峰的確認在分離APOA1、APOA2相同條件下，利用分子量標(biāo)準品以對數(shù)分子量為縱坐標(biāo)，保留時間為橫坐標(biāo)，標(biāo)出兩者線性關(guān)系圖(如圖1曲線所示)，現(xiàn)將將圖1中的標(biāo)號分述如下(表一)表一標(biāo)號 分子量 對數(shù)分子量 保留時間(道爾頓) (分)A1(甲狀腺球蛋白) 670000 5.826 11.491A2(r-球蛋白) 158000 5.198 15.081A3牛白蛋白 44000 4.68 17.475A4肌球蛋白 17000 4.23 19.441A5VitB121350 3.13 27.608XlAPOA128000 4.45 17.95X2APOA217000 4.23 19.44APOA1標(biāo)準分子量為28000(道爾頓)、APOA2標(biāo)準分子量為17000(道爾頓)，該兩物質(zhì)在上述液相條件下理論出峰時間(保留時間)應(yīng)分別為18分鐘和20分鐘左右。
對比法分別對純APOA1、APOA2的高壓液相圖譜(圖2)、HDL高壓液相圖譜(圖3)、血清APOA1、APOA2高壓液相圖譜(圖4)進行對照，其圖形相似，且保留時間均為18和20分鐘左右。(見表二)表二保留時間(出峰時間)圖譜名稱 APOA1APOA2純APOA1、APOA218.138分 20.168分高壓液相圖譜HDL高壓液相圖譜 18.837分 20.170分血清加熱100℃5分鐘上清液APOA1、 18.064分 20.410分APOA2高壓液相圖譜免疫擴散法用血清經(jīng)本發(fā)明分離法在高壓液相色譜儀中保留時間為18分鐘和20分鐘時的提取液，經(jīng)濃縮滴入RIM APOA免疫擴散藥盒后，它們均呈陽性反應(yīng)，18分鐘時提取液在RIM APOA1免疫擴散藥盒中呈陽性反應(yīng)，20分鐘時提取液在RIM APOA1免疫擴散藥盒中呈陰性反應(yīng)。該免疫擴散法可證明在18分鐘和20分鐘保留時間的提取液中均存在APOA成份，其中18分鐘提取液為APOA1，而20分鐘提取液中可能是APOA2。
回吸收率試驗(1)、分別在三個試管中各加入血清A IML，第一管中加入洗脫液150μL，第二管加入APOA1(200μg/dI)150μL，第三管中加入APOA2(100μg/dI)150μL，100℃加熱5分鐘后進樣，其結(jié)果見純APOA1、APOA2標(biāo)準試劑回收率表格(表三)。
表三APOA1μg/dI APOA2μg/dI實際值 預(yù)期值 回吸收率 實際值 預(yù)期值 回吸收率血清AIML+洗脫液150 173.29 91.31μL血清AIML+APOA1207、87199.37 104.26%(200μg/dI)×150μL血清AIML+APOA2(100μg/dI) 105.45 104.36 101.07%×150μL其APOA1的回吸收率為104.26%，APOA2的回吸收率為101.04%。
(2)用任一血清B的APOA1、APOA2作為“標(biāo)準血清”，并以各種比例加入另一血清C，其測定結(jié)果見血清B加入各種比例血清C回收率表格(表四)。

如按表四數(shù)值將APOA1、APOA2加入量為縱軸，實際測得APOA1、APOA2濃度為橫軸，可以畫出兩條相關(guān)曲線，APOA1曲線r＝0.999，y＝70.03+0.766x(圖5)，APOA2曲線r＝0.991，y＝30.88+0.691x(圖6)。
精密度試驗同一份樣品分成10管同樣處理和進樣，APOA1的結(jié)果為192.1±1.68μg/dL，變異系數(shù)為0.88%，APOA2結(jié)果為93.4±1.52μg/dL，變異系數(shù)為1.63%(見表五)。
表五試管序號 APOA1mg/dL APOA1mg/dL1 191.2 92.32 190.6 92.83 190.7 91.64 191.4 91.25 191.2 93.06 192.0 93.87 191.3 93.38 192.7 94.59 195.4 95.410 194.8 95.8
試管序號 APOA1mg/dL APOA2mg/dL結(jié)果 192.1 93.4誤差 ±1.68 ±1.52變異系數(shù) 0.88% 1.63%用高壓液相色譜儀分離血清載脂蛋白必須解決二個問題一是血中含有大量蛋白，特別是球蛋白，其分子量從10000-40000左右，且濃度遠高于APOA1、APOA2，如果用血清直接進樣，APOA1、APOA2峰值將被高濃度球蛋白所掩蓋，無法定性、定量。如前所述采用超高速離心提取HDL、LDL、VLDL同時離心掉多余蛋白，但儀器昂貴、手續(xù)復(fù)雜。本發(fā)明采用加熱法，經(jīng)離心后亦能除去絕大部分的血清蛋白，僅存下APOA1、APOA2液相圖象清晰，無干擾，便于定量，用加熱后的血清蛋白電泳也證實了這一點?；匚章试囼灡砻?，加熱對APOA1、APOA2含量無甚影響，其方法簡便。
二是APOA1、APOA2在血清中和脂肪結(jié)合，如有脂肪同時進入分離柱，必然影響結(jié)果，日本學(xué)者用加熱60℃法脫脂并認為效果理想。本發(fā)明用加熱血清至100℃脫脂更完全。
本發(fā)明人用加熱后血清進行蛋白電泳，然后再用脂肪紅7B染色(FafRad7B)證明去脂完全，即加熱100℃不僅去除蛋白，同時起到脫脂作用，一舉兩得，可獲得理想結(jié)果。
在實驗方法時，使用過多種不同洗脫液，如6M尿素、洗脫液濃度太高難以完成溶解，無法實際使用。0.1M磷酸洗脫液效果理想，但易造成柱內(nèi)結(jié)晶沉淀影響柱效和柱壽命。本法選用0.2M磷酸二氫鈉和0.05M硫酸二鈉，加入0.1%S.D.S(十二烷基磺酸鈉)后，峰形改善，為了防腐，洗脫液中加入0.1%NaN3。各不同的pH值，APOA1、APOA2峰面積比例有所變化，根據(jù)純APOA1、APOA2標(biāo)準品，以pH＝6.8時兩者峰面積比例接近于加入標(biāo)準品的比例。
TSK250適用分子量1000-20000蛋白質(zhì)分離，TSK400適用于分子量5000-40000蛋白質(zhì)分離，兩柱子聯(lián)用效果較單根柱子為好，其洗脫液流速為1mL/分，溫度常溫。全部過程約在30分鐘內(nèi)完成。
發(fā)明人對60℃～100℃不同加熱血清溫度和自3分-10分鐘不同時間進行了試驗，發(fā)現(xiàn)100℃時去蛋白效應(yīng)最佳且易掌握，加熱時間亦以5分鐘為最佳。
綜上所述，利用加熱法處理血清標(biāo)本，其上清液再由HPLC分析，可分離出APOA1、APOA2其方法簡便易行，回吸收率及重復(fù)性好，便于在臨床實驗室推廣，本分離法原理可完全用于APOA1、APOA2的測定和制備，其不同點僅在于高壓液相泵的容量及分離柱的內(nèi)徑有所差別，其分離步驟是一致的。
目前從國外進口1mgAPOA1約117美元，APOA2約145美元，本發(fā)明的實現(xiàn)可為國家節(jié)約大量外匯，并能爭取向國外輸出，如從100mL血清(人民幣80元)中就可提出APOA1121mg，APOA237mg，由此可見，采用本發(fā)明的分離法，其APOA1、APOA2的提取成本將比連續(xù)漂浮超速離心法成本大大降低，因此，本發(fā)明進一步促進了冠心病的預(yù)防、診斷和治療的臨床工作。
權(quán)利要求
1.一種載脂蛋白A1、A2高壓液相色譜儀分離法，其特征在于將裝在密封試管中的血清標(biāo)本，首先在沸水中加熱，取其經(jīng)離心、過濾的上清液與洗脫液充分混合后，直接注入高壓液相色譜儀，一次分離APOA1、APOA2，洗脫液由0.05MNa2SO40.02MNaH2PO4、0.1%S.D.S(十二烷基磺酸鈉)、0.05%NaN3組成，其PH=6.8。
2.按照權(quán)利要求1所述的分離法，其特征在于高壓液相柱包括Bio-Sil TSK予柱75×7.5mm，Bil-Sil TSK250凝膠分離柱300×7.5mm，Bil-Sil TSK400凝膠分離柱300×7.5mm，上述三柱連接使用。
3.按照權(quán)利要求1所述的分離法，其特征在于測定儀器包括高壓液相泵、資料處理儀、分光光度儀。
4.按照權(quán)利要求1所述的分離法，其特征在于血清標(biāo)本，加熱(100℃)時間為5分鐘，在4000轉(zhuǎn)(11600g)離心10分鐘，上清液采用0.22mm過濾片過濾。
全文摘要
一種載脂蛋白A
文檔編號C07K1/16GK1053068SQ9010520
公開日1991年7月17日 申請日期1990年1月3日 優(yōu)先權(quán)日1990年1月3日
發(fā)明者鄒雄 申請人:山東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院