一種孕酮人工抗原合成方法
【專利摘要】一種孕酮人工抗原合成方法，屬于生物化工【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明利用孕酮類似物17α-甲基-17β-羥基雄甾-4-烯-3-酮上特有的羥基作為反應(yīng)基團，和2-溴乙酸反應(yīng)得到孕酮半抗原，采用混合酸酐法將半抗原與載體蛋白BSA相連合成孕酮人工抗原或?qū)肟乖c載體蛋白OVA相連合成包被原。本方法成功的合成孕酮人工抗原，合成過程簡單，合成產(chǎn)物充分的暴露多種激素甾體環(huán)結(jié)構(gòu)相同的部分，用于免疫分析中，可以得到群選性孕酮單克隆抗體，滿足國家孕激素多重檢測的需要。
【專利說明】一種孕酮人工抗原合成方法 【技術(shù)領(lǐng)域】
[〇〇〇1] 本發(fā)明涉及一種孕酮人工抗原合成方法，得到的新型人工抗原可以用到免疫分析 領(lǐng)域，屬于生物化工【技術(shù)領(lǐng)域】。 【背景技術(shù)】
[0002] 孕酮（Progesterone, P)屬于天然孕激素，是由卵巢黃體分泌，維持妊娠所必須，又 稱為黃體酮，是一種助孕素。臨床醫(yī)學(xué)方面主要用于習(xí)慣性流產(chǎn)、痛經(jīng)、經(jīng)血過多或血崩癥、 閉經(jīng)等。大量口服也用于經(jīng)前綜合征、排卵停止所致月經(jīng)紊亂、良性乳腺病、絕經(jīng)前和絕經(jīng) 期等。孕酮屬于內(nèi)源性激素，機體可以產(chǎn)生，孕早期大量的攝入可導(dǎo)致胎兒脊柱、肛門、四 肢等部位發(fā)生畸形的概率增加?，F(xiàn)有的檢測孕酮方法是儀器檢測，其中包括高效液相色譜 法（HPLC)、液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS)、氣質(zhì)聯(lián)用（GC-MS)等。這些方法檢測結(jié)果準(zhǔn)確，靈敏度高，但 是樣品前處理過程繁瑣，檢測耗時，不能滿足現(xiàn)場大批量快速檢測的需求。相比較，酶聯(lián)免 疫分析技術(shù)（ELISA)可以在短時間內(nèi)完成現(xiàn)場快速大批量檢測。ELISA最關(guān)鍵的步驟就 是免疫原的設(shè)計與合成，目前合成孕酮免疫原的方法都是在孕酮原有的結(jié)構(gòu)上引入或者改 變基團，得到的多數(shù)是特異性抗體。本發(fā)明利用孕酮的類似物17 α -甲基-17 β -羥基雄 甾-4-烯-3-酮D環(huán)17位碳上的羥基，修飾帶有羧基連接蛋白，充分暴露孕激素的共同結(jié) 構(gòu)，使得篩選高效群選性孕酮單克隆抗體成為可能。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的是為了避免改造孕酮和其他孕激素的共同結(jié)構(gòu)，提供了一種新型的 孕酮半抗原和人工抗原的合成方法，為制備群選性孕酮單克隆抗體奠定基礎(chǔ)。
[0004] 本發(fā)明的技術(shù)方案，一種孕酮人工抗原合成方法，以孕酮類似物17α-甲 基-17 β -羥基雄留-4-烯-3-酮為原料，通過氫氧化鉀和2-溴乙酸進行取代，得到孕酮半 抗原，利用混合酸酐法將其與載體蛋白BSA偶聯(lián)，得到孕酮人工抗原，用紫外鑒定結(jié)果。 [〇〇〇5] 具體合成步驟如下： (1)孕酮半抗原的制備：17 α -甲基-17 β -輕基雄甾-4-烯-3-酮34. 4mg (0. lmmol) 溶解于3 mL無水二甲亞砜中，加入氫氧化鉀粉末208. 5mg (1.5mmol),充分溶解后溶液為 淡黃色，稱為A液。2-溴乙酸27. 8mg (0. 2mmol)溶解于1.4mL無水二甲亞砜中，緩慢的滴 加到A液中，顏色逐漸變?yōu)樯铧S色，室溫反應(yīng)4h。用50mL冰水終止反應(yīng)，乙酸乙酯萃取三 遍，合并水相，將水相用2mol/L鹽酸酸化得黃色沉淀，水洗四遍至中性，干燥后得到黃色孕 酮半抗原（P-hapten)粉末。產(chǎn)物溶解于甲醇后用LC-MS鑒定。
[0006] (2)孕酮人工抗原的制備：稱取孕酮半抗原4. 02mg (0· Olmmol，Mw=402)溶 解于600 μ L無水N，N-二甲基甲酰胺（DMF)，置于4 °C冰浴中攪拌，溶液預(yù)冷后加入 5. 94μ L (0. 025mmol，Mw=185. 35, P =0. 78)三正丁胺，冰浴條件攪拌 30min，加入 3. 24μ L (0. 025mmol，Mw=136. 6, Ρ =1. 053)氯甲酸異丁酯，繼續(xù)冰浴攪拌2h，得活化后小分子溶液Β 液。稱取載體蛋白BSA 10. 6mg (0· 00016mmol，Mw=64000)溶解于pH 9. 6的碳酸鹽緩沖液 (CBS)中，得蛋白溶液。在冰浴條件下，將小分子溶液B液逐滴滴加到蛋白溶液中，反應(yīng)8h。 反應(yīng)結(jié)束后，將溶液離心，取上清，得到產(chǎn)品孕酮人工抗原混合液。
[0007] 將透析袋剪取約8. 0cm，煮沸l(wèi)Omin，沖洗多次，將孕酮人工抗原混合液移入到透 析袋中，用〇. 〇1Μ、ρΗ 7. 4的磷酸鹽緩沖液（PBS)透析三天，6-8h更換一次透析液，透析結(jié)束 后取出孕酮人工抗原分裝在lmL的無菌的離心管，在-20°C保存，備用。
[0008] 該孕酮人工抗原作為免疫原。將載體蛋白換為0VA，方法不變，合成的完全抗原為 包被原。
[〇〇〇9] 合成路線如下：
【權(quán)利要求】
1. 一種孕酮人工抗原合成方法，其特征在于：以孕酮類似物17 α -甲基-17 β -羥基雄 甾-4-烯-3-酮為原料，通過氫氧化鉀和2-溴乙酸進行取代，得到孕酮半抗原，然后利用混 合酸酐法將其與載體蛋白BSA偶聯(lián)，得到孕酮人工抗原； 具體步驟為： (1) 孕酮半抗原的制備：取17 α -甲基-17 β -輕基雄甾-4-烯-3-酮0. lmmol溶解于 3mL無水二甲亞砜中，加入氫氧化鉀粉末1. 5_〇1，充分溶解后溶液為淡黃色，命名為A液； 取2-溴乙酸0. 2mmol充分溶解于1.4mL無水二甲亞砜中，緩慢的滴加到A液中，顏色逐漸 變?yōu)樯铧S色，室溫反應(yīng)4h ;用50mL冰水終止反應(yīng)，乙酸乙酯萃取三遍，合并水相，將水相用 2mol/L鹽酸酸化得黃色沉淀，水洗四遍至中性，干燥后得到黃色孕酮半抗原P-hapten粉 末，產(chǎn)物溶解于甲醇后用LC-MS鑒定； (2) 孕酮人工抗原的制備：稱取步驟（1)制備的孕酮半抗原0. Olmmol，溶解于600μ L無 水Ν，Ν-二甲基甲酰胺DMF中，置于4°C冰浴中攪拌，溶液預(yù)冷后加入0. 025mmol三正丁胺， 冰浴條件攪拌30min，加入0. 025mmol氯甲酸異丁酯，繼續(xù)冰浴攪拌2h，得活化后小分子溶 液B液；稱取載體蛋白BSA 0. 00016_〇1溶解于pH 9. 6的碳酸鹽緩沖液CBS中，得蛋白溶 液；在冰浴條件下，將小分子溶液B液逐滴滴加到蛋白溶液中，反應(yīng)8h ;反應(yīng)結(jié)束后,將溶液 離心，取上清，即得到產(chǎn)品孕酮人工抗原混合液； 將孕酮人工抗原混合液移入到透析袋中，用〇. 01M、pH7. 4的磷酸鹽緩沖液PBS透析 三天，6-8h更換一次透析液，透析結(jié)束后取出孕酮人工抗原分裝在lmL的無菌的離心管， 在-20°C保存，備用。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述孕酮人工抗原合成方法，其特征在于：將步驟（2)中所用載體蛋 白替換為OVA,合成的完全抗原為包被原。
【文檔編號】C07K14/765GK104086647SQ201410334350
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年7月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月15日
【發(fā)明者】胥傳來, 孔娜, 匡華, 徐麗廣, 馬偉, 劉麗強, 宋珊珊, 吳曉玲 申請人:江南大學(xué)