雙水相系統(tǒng)萃取血清中抗體的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種雙水相系統(tǒng)萃取血清中抗體的方法，為一種新的取血清中抗體的方法，克服了傳統(tǒng)取血清中抗體的方法得率低、含雜質(zhì)多、制備繁瑣、活性低等特點(diǎn)。采用乙酸鈉作為鹽水相中的鹽使用。既提高了抗體的得率而且為今后乙酸鈉在工業(yè)生產(chǎn)提供依據(jù)。提取設(shè)備要求簡(jiǎn)單，室溫下可操作；所提取的抗體純度較高，活性無影響；得率大大提高；萃取時(shí)間大大縮短；可用于擴(kuò)大生產(chǎn)。擴(kuò)大生產(chǎn)后得率不改變。
【專利說明】雙水相系統(tǒng)萃取血清中抗體的方法
[0001]【技術(shù)領(lǐng)域】:
本發(fā)明公開一種雙水相系統(tǒng)萃取血清中抗體的方法，涉及雙水相系統(tǒng)萃取生物活性大分子蛋白，特別適用于對(duì)免疫血清中抗體的萃取，以及對(duì)萃取后的抗體進(jìn)行處理，處理后的抗體可直接作為抗體藥用于治療相應(yīng)疾病，屬于生物工程提取【技術(shù)領(lǐng)域】。
[0002]【背景技術(shù)】:
抗體(Antibody)又稱免疫球蛋白(Immune globulin),具有抗菌、抗病毒、中和毒素等免疫活性。還能夠調(diào)理、凝集和沉淀抗原，激活補(bǔ)體。在疫病爆發(fā)時(shí)可用于緊急治療。因此大量生產(chǎn)抗體對(duì)于治療免疫疾病具有重要的價(jià)值和廣闊的市場(chǎng)前景。由于此類蛋白大分子作為藥物用于治療時(shí)，其治療效果與其生物活性密切相關(guān)，因此在提取時(shí)必須確保其生物活性的穩(wěn)定。
[0003]傳統(tǒng)血清中提取抗體的方法為鹽析法，該方法提取抗體在實(shí)驗(yàn)室水平經(jīng)檢測(cè)得率在48%，在藥廠大批生產(chǎn)應(yīng)用時(shí)經(jīng)檢測(cè)得率在40%左右，不但影響抗體分子的免疫活性，得率不足一半導(dǎo)致抗體分子在提取過程中的嚴(yán)重浪費(fèi)，也使得抗體藥物價(jià)格昂貴而不能廣泛應(yīng)用。
[0004]經(jīng)檢索采用雙水相系統(tǒng)萃取血清中抗體的方法未見文獻(xiàn)報(bào)道，特別是雙水相萃取技術(shù)中涉及的“乙酸鈉”只是人們用來作為食品的風(fēng)味劑，促進(jìn)蛋白的吸收提高食物口感而增加食欲或作為防腐劑可以殺滅酶菌提高食物的保存時(shí)間。而“乙酸鈉”作為雙水相系統(tǒng)的一種鹽溶液來萃取血清中的抗體未見文獻(xiàn)報(bào)道。
[0005]
【發(fā)明內(nèi)容】
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本發(fā)明公開一種雙水相系統(tǒng)萃取血清中抗體的方法，為一種新的取血清中抗體的方法，克服了傳統(tǒng)取血清中抗體的方法得率低、含雜質(zhì)多、制備繁瑣、活性低等特點(diǎn)。
[0006]本發(fā)明所述的雙水相系統(tǒng)萃取血清中抗體的方法，其特征在于包括以下步驟:
1)制備免疫血清；
2)制備雙水相系統(tǒng):
先配好濃度為50% (w/w)的聚乙二醇(分子量為3350)儲(chǔ)存液；濃度為40% (w/w)鹽溶液(其中硫酸銨與乙酸鈉質(zhì)量比為3:1)；
將聚乙二醇儲(chǔ)存液、鹽溶液、血清按體積比4.5:4.5:1混合；體系PH定為7.0 ;
3)室溫靜止至雙水相系統(tǒng)分層，待雙水相系統(tǒng)明顯分層后轉(zhuǎn)入尚心機(jī)1400r/min，尚心15分鐘；
4)離心后雙水相系統(tǒng)明顯分三層，上層為聚乙二醇層，下層為鹽水相層；中間層為抗體層；排除下層和上層后，取出中間層的抗體，經(jīng)檢測(cè)得率為85%-90% ；
5)對(duì)抗體進(jìn)行透析除鹽；
6)將透析后的抗體加入5%的蔗糖進(jìn)行凍干保存，延長(zhǎng)了抗體的保存時(shí)間及對(duì)抗體進(jìn)行濃縮。
[0007]在本發(fā)明中，雙水相萃取系統(tǒng)由于其水分含量在90%以上，且具有溫和非致變性的萃取條件，特別適用生物大分子蛋白的萃取；本發(fā)明提取抗體確保了所提抗體蛋白具有高活性；雙水相系統(tǒng)組成為聚乙二醇聚合物和鹽水相，特別是鹽水相位硫酸銨和乙酸銨的混合物。在雙水相系統(tǒng)中，使用乙酸銨作為一種鹽溶液來萃取血清中的抗體，不僅可以很好地成相而且對(duì)于抗體的萃取率有極大的提聞。
[0008]本發(fā)明操作工藝簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉、抗體得率在85%_90% ;室溫下可操作性強(qiáng)、設(shè)備要求不高、可擴(kuò)大生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)而有望成為工業(yè)大批生產(chǎn)抗體的新技術(shù)。使用傳統(tǒng)方法提取抗體在實(shí)驗(yàn)室水平經(jīng)檢測(cè)得率在48%，在藥廠大批生產(chǎn)應(yīng)用時(shí)經(jīng)檢測(cè)得率在40%左右。雙水相系統(tǒng)萃取技術(shù)與傳統(tǒng)方法相比得到極大的提高。因此研究開發(fā)新型方法萃取血清中的抗體具有越來越重要的價(jià)值，為工業(yè)生產(chǎn)提供理論依據(jù)。
[0009]本發(fā)明的積極效果在于:采用乙酸鈉作為鹽水相中的鹽使用。既提高了抗體的得率而且為今后乙酸鈉在工業(yè)生產(chǎn)提供依據(jù)。提取設(shè)備要求簡(jiǎn)單，室溫下可操作；所提取的抗體純度較高，活性無影響；得率大大提高；萃取時(shí)間大大縮短；特別是本發(fā)明提取方法主要成本消耗在聚合物上，而聚合物可回收利用，大大節(jié)約成本。可用于擴(kuò)大生產(chǎn)。擴(kuò)大生產(chǎn)后得率不改變。

【具體實(shí)施方式】
[0010]本發(fā)明專利不僅限用于以下所例舉的實(shí)施方式，還包括【具體實(shí)施方式】間的任意組合。
[0011]實(shí)施例1
1、制備免疫血清。
[0012]用滅活的水貂細(xì)小病毒免疫健康馬。經(jīng)而免后抗體效價(jià)達(dá)到所需值后對(duì)免疫的馬采血。采集的血液靜止放置沉淀出血清，此血清即為免疫血清；
2、制備雙水相系統(tǒng)；
先配好濃度為50% (w/w)的聚乙二醇(分子量為3350)儲(chǔ)存液；濃度為40% (w/w)鹽溶液(其中硫酸銨與乙酸鈉質(zhì)量比為3:1);取4.5ml聚乙二醇儲(chǔ)存液、4.5ml鹽溶液、Iml血清混勻，PH定為7.0 ;
3、室溫靜止使雙水相完全分層。分層后置于離心機(jī)內(nèi)1500r/min離心15分鐘。離心后的雙水相系統(tǒng)分為三層，上層PEG層，下層為鹽水相層，中間層即為抗體，經(jīng)檢驗(yàn)抗體得率 85.7% ；
4、收集中間層抗體；
對(duì)收集的抗體進(jìn)行透析處理后加入0.05%的蔗糖作為保護(hù)劑進(jìn)行凍干保存。
[0013]實(shí)施例2
1、制備免疫血清；
用滅活的水貂細(xì)小病毒免疫健康馬。經(jīng)而免后抗體效價(jià)達(dá)到所需值后對(duì)免疫的馬采血。采集的血液靜止放置沉淀出血清，此血清即為免疫血清；
2、制備雙水相系統(tǒng)；
先配好濃度為50% (w/w)的聚乙二醇(分子量為3350)儲(chǔ)存液；濃度為40% (w/w)鹽溶液(其中硫酸銨與乙酸鈉質(zhì)量比為3:1);取451111聚乙二醇儲(chǔ)存液、45ml鹽溶液、1ml血清混勻，PH定為7.0 ;
3、室溫靜止使雙水相完全分層。分層后置于離心機(jī)內(nèi)1500r/min離心15分鐘。離心后的雙水相系統(tǒng)分為三層，上層PEG層，下層為鹽水相層，中間層即為抗體，經(jīng)檢驗(yàn)抗體得率 83.4% ；
4、收集中間層抗體；
對(duì)收集的抗體進(jìn)行透析處理后加入0.05%的蔗糖作為保護(hù)劑進(jìn)行凍干保存。
[0014]實(shí)施例3
1、制備免疫血清；
用滅活的水貂細(xì)小病毒免疫健康馬。經(jīng)而免后抗體效價(jià)達(dá)到所需值后對(duì)免疫的馬采血。采集的血液靜止放置沉淀出血清，此血清即為免疫血清；
2、制備雙水相系統(tǒng)；
先配好濃度為50% (w/w)的聚乙二醇(分子量為3350)儲(chǔ)存液；濃度為40% (w/w)鹽溶液(其中硫酸銨與乙酸鈉質(zhì)量比為3:1);取450ml聚乙二醇儲(chǔ)存液、450ml鹽溶液、10ml血清混勻，PH定為7.0 ;
3、室溫靜止使雙水相完全分層。分層后置于離心機(jī)內(nèi)1500r/min離心15分鐘；離心后的雙水相系統(tǒng)分為三層，上層PEG層，下層為鹽水相層，中間層即為抗體，經(jīng)檢驗(yàn)抗體得率89.1% ；
4、收集中間層抗體 ；
對(duì)收集的抗體進(jìn)行透析處理后加入0.05%的蔗糖作為保護(hù)劑進(jìn)行凍干保存。
[0015]實(shí)施例4
1、制備免疫血清；
用滅活的狂犬病毒免疫健康馬。經(jīng)而免后抗體效價(jià)達(dá)到所需值后對(duì)免疫的馬采血。采集的血液靜止放置沉淀出血清，此血清即為免疫血清
2、制備雙水相系統(tǒng)
先配好濃度為50% (w/w)的聚乙二醇(分子量為3350)儲(chǔ)存液；濃度為40% (w/w)鹽溶液(其中硫酸銨與乙酸鈉質(zhì)量比為3:1);取4.5ml聚乙二醇儲(chǔ)存液、4.5ml鹽溶液、Iml血清混勻，PH定為7.0
3、室溫靜止使雙水相完全分層。分層后置于離心機(jī)內(nèi)1500r/min離心15分鐘離心后的雙水相系統(tǒng)分為三層，上層PEG層，下層為鹽水相層，中間層即為抗體，經(jīng)檢驗(yàn)抗體得率87.4%
4、收集中間層抗體
對(duì)收集的抗體進(jìn)行透析處理后加入0.05%的蔗糖作為保護(hù)劑進(jìn)行凍干保存。
【權(quán)利要求】
1.一種雙水相系統(tǒng)萃取血清中抗體的方法，其特征在于包括以下步驟: 1)制備免疫血清； 2)制備雙水相系統(tǒng): 先配好濃度為50% (w/w)分子量為3350的聚乙二醇儲(chǔ)存液；濃度為40% (w/w)鹽溶液:硫酸銨與乙酸鈉質(zhì)量比為3:1 ； 將聚乙二醇儲(chǔ)存液、鹽溶液、血清按體積比4.5:4.5:1混合；體系PH定為7.0 ; 3)室溫靜止至雙水相系統(tǒng)分層，待雙水相系統(tǒng)明顯分層后轉(zhuǎn)入尚心機(jī)1400r/min，尚心15分鐘； 4)離心后雙水相系統(tǒng)明顯分三層，上層為聚乙二醇層，下層為鹽水相層；中間層為抗體層；排除下層和上層后，取出中間層的抗體，經(jīng)檢測(cè)抗體效價(jià)在85%-90% ； 5)對(duì)抗體進(jìn)行透析除鹽； 6)將透析后的抗體加入5%的蔗糖進(jìn)行凍干保存，延長(zhǎng)了抗體的保存時(shí)間及對(duì)抗體進(jìn)行濃縮 。
【文檔編號(hào)】C07K16/06GK104072610SQ201410315177
【公開日】2014年10月1日 申請(qǐng)日期:2014年7月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月4日
【發(fā)明者】雷連成, 馮新, 杜崇濤, 黃盼盼, 肖鋒, 侯春苗, 孫長(zhǎng)江, 孫瑩瑩, 王彬 申請(qǐng)人:吉林大學(xué)