美國(guó)癌癥數(shù)據(jù)庫(kù)化合物在抗艾滋病毒1型蛋白酶活性上的新用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及美國(guó)癌癥數(shù)據(jù)庫(kù)NCI(National?Cancer?Institute)的化合物的新用途，更具體地說(shuō)，涉及編號(hào)NSC111887和NSC121217化合物在抗艾滋病毒HIV-1蛋白酶活性的新用途。本發(fā)明通過(guò)整合現(xiàn)有的抗HIV-1蛋白酶藥物和抑制劑數(shù)據(jù)、計(jì)算模擬和體外化合物篩選方法，首次找到具有三肽衍生物結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的NSC111887和NSC121217化合物分子，具有一定抗HIV-1蛋白酶活性的能力，半抑制濃度分別為62μM和162μM。
【專利說(shuō)明】美國(guó)癌癥數(shù)據(jù)庫(kù)化合物在抗艾滋病毒1型蛋白酶活性上的新用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及美國(guó)癌癥數(shù)據(jù)庫(kù)(NCI)化合物在抗艾滋病毒I蛋白酶(HIV-1Protease)活性上的新用途。
【背景技術(shù)】
[0002]艾滋病極大威脅著人類健康，全球現(xiàn)有200多萬(wàn)年齡在10歲和19歲之間的青少年攜帶艾滋病病毒，由于缺乏有效的、可接受的支持服務(wù)，使青少年群體報(bào)告發(fā)生的與艾滋病相關(guān)的死亡數(shù)上升了 50%，而且HIV具有高變異性，其耐藥性和藥物毒副作用等問(wèn)題日趨嚴(yán)重，抗艾滋病研究在當(dāng)今生命科學(xué)領(lǐng)域具有重大意義。
[0003]人類免疫缺陷病毒I型(HIV-1)蛋白酶是HIV-1基因組復(fù)制過(guò)程中的關(guān)鍵酶之一，因此成為抗HIV-1藥物研究的重要靶點(diǎn)。HIV-1蛋白酶作用于未成熟多聚蛋白的gag和gag-pol位點(diǎn)從而將多蛋白加工形成具有侵染性的病毒核心的結(jié)構(gòu)蛋白等成熟蛋白，是病毒成熟過(guò)程中所必需的結(jié)構(gòu)和功能蛋白，在病毒生命周期中起關(guān)鍵的作用。HIV-1蛋白酶抑制劑(PD作用于HIV病毒蛋白酶，使HIV病毒在被感染的細(xì)胞中無(wú)法生成成熟的具有感染性的病毒顆粒，因而成為AIDS患者中的抗病毒治療的有希望的治療目標(biāo)。
[0004]艾滋病毒I蛋白酶(HIV-1Protease)屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒天冬氨酸蛋白酶(retroviral asparty l protease)家屬成員之一。分子量為10~12KD,由兩條均含有99個(gè)氨基酸的肽鏈組成的C2同源二聚體，其活性中心由位于對(duì)稱亞基間空腔底物兩個(gè)天冬氨酸催化殘基(Asp25/Asp25’ )和結(jié)合腔頂部的相互靠近的兩個(gè)柔性擋板上的異亮氨酸殘基(Ile50/Ile50’ )組成。沒(méi)有底物與HIV-1蛋白酶結(jié)合時(shí)，HIV-1蛋白酶是動(dòng)態(tài)的，兩個(gè)柔性擋板是開(kāi)放的。當(dāng)?shù)孜锱cHIV — I蛋白酶結(jié)合后，兩個(gè)柔性擋板閉合，Ile50/Ile50’殘基與底物通過(guò)水分子介導(dǎo)或直接形成氫鍵結(jié)合。
[0005]HIV-1蛋白酶抑制劑(PIs)是治療感染有人類免疫缺陷病毒(HIV)的患者的有效的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥。經(jīng)美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)上市的HIV-1蛋白酶抑制劑有9種，沙奎那韋、茚地那韋、利托那韋、奈非那韋、胺普那韋、羅匹那韋、阿扎那韋、替拉那韋和達(dá)蘆那韋。HIV-1蛋白酶抑制劑是目前所報(bào)道的最有效的抗AIDS藥物，也是高活性抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療(HAART)的主要成分。臨床上抗HIV-1蛋白酶藥物(除替拉那韋外)多以HIV—IPR切割HIV前提蛋白上的位點(diǎn)序列為藍(lán)本，根據(jù)過(guò)渡態(tài)模擬概念而被開(kāi)發(fā)，并含有作為模擬HIV-1蛋白酶底物過(guò)渡態(tài)的核心支架的多種不可裂解的二肽等排體，設(shè)計(jì)并合成一系列個(gè)別位點(diǎn)突變的擬肽類分子，擬肽類分子可與HIV-1PR結(jié)合，但不被蛋白酶水解，從而產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用。
[0006]但HIV-1蛋白酶易突變而出現(xiàn)耐藥和交叉耐藥性問(wèn)題，是抗病毒治療失敗的主要因素。通常，在藥物存在下，靶蛋白中的突變使蛋白保留原有的功能時(shí)，就會(huì)出現(xiàn)耐藥性，當(dāng)?shù)鞍酌敢种苿┐嬖诘那闆r下，HIV-1蛋白酶至少在9個(gè)不同位置上裂解Gal和Pol多肽，使病毒突變從而出現(xiàn)耐藥性。在接受治療的HIV患者中耐藥病毒突變體的相對(duì)快速的出現(xiàn)可歸因于病毒的高速?gòu)?fù)制，以及HIV逆轉(zhuǎn)錄酶的失真導(dǎo)致的高度的內(nèi)在突變速度。因此發(fā)展抗HIV-1蛋白酶耐藥株的新型蛋白酶抑制劑，對(duì)目前的蛋白酶耐藥性HIV-1毒株更有活性的藥物成為抗艾滋病藥物研究的主要方向。
[0007]NSC111887 化合物(methyl N - [ (benzyloxy) carbonyl]sery lpheny lalany 11 eucinate)來(lái)自于美國(guó)癌癥數(shù)據(jù)庫(kù)(Nat1nal Cancer Institute),編號(hào)NSC111887化合物目前被用來(lái)體內(nèi)抗腫瘤活性篩選，其中用于篩選的腫瘤模型包括 rad50strain、mec2—lstrain、sgslmgtlstrain、cln2radl4strain、bub3strain、mlhlradl8strain和L1210白血病(B6D2F1 (BDFl)老鼠)。并且Pubchem實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證實(shí)NSCl11887化合物對(duì)上述幾種癌癥均無(wú)活性抑制作用。本發(fā)明通過(guò)整合現(xiàn)有抗HIV-1蛋白酶藥物和抑制劑數(shù)據(jù)、計(jì)算模型和體外化合物篩選，首次發(fā)現(xiàn)NSCl 11887具有抑制HIV-1蛋白酶活性作用，半抑制濃度IC50為62 μ M。
[0008]NSC121217 化合物(methyl n-[ (benzyloxy) carbonyl] serylleucyltyrosinate)來(lái)自于美國(guó)癌癥數(shù)據(jù)庫(kù)(Nat1nal Cancer Institute),該化合物目前被用來(lái)體內(nèi)抗腫瘤活性篩選，但沒(méi)有數(shù)據(jù)顯示該化合物對(duì)某類腫瘤具有抑制作用。本發(fā)明通過(guò)整合現(xiàn)有抗HIV-1蛋白酶藥物和抑制劑數(shù)據(jù)、計(jì)算模型和體外化合物篩選，首次發(fā)現(xiàn)NSC121217化合物具有一定的抗HIV-1蛋白酶活性作用，半抑制濃度IC50為162 μ M。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的目的是提供來(lái)自于美國(guó)癌癥數(shù)據(jù)庫(kù)(Nat1nal Cancer Institute)的 NSCl11887 (methyl N-[(benzyloxy)carbonyl]serylphenylalanylleucinate)，NSC121217 (methyl n-[ (benzyloxy) carbonyl] serylleucyl tyrosinate)分子具有一定的抑制HIV-1蛋白酶活性作用，半抑制濃度IC50分別為62 μ M和162 μ Μ。
[0010]本發(fā)明的 NSC111887 (methyl N-[ (benzyloxy) carbonyl]serylphenylalanylleucinate)化合物結(jié)構(gòu)如下圖1所不:
[0011]NSC111887 分子式:C27H35N307。
[0012]NSCl11887 分子量:514。
[0013]NSCl11887化合物是一個(gè)三肽衍生物，含有三個(gè)肽鍵，一個(gè)自由羥基，分子兩端含有疏水性的芐基和異丁基結(jié)構(gòu)，同時(shí)分子結(jié)構(gòu)中部含有一個(gè)S構(gòu)型的手性碳，手性碳上連
有一個(gè)芐基基團(tuán)。
[0014]NSC111887化合物對(duì)HIV-1蛋白酶靶點(diǎn)的不同濃度下的抑制率曲線如下圖2所示:
[0015]NSCl11887化合物能夠與底物分子競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合艾滋病毒HIV-1蛋白酶活性口袋，從而占據(jù)結(jié)合位點(diǎn)，但該化合物不被HIV-1蛋白酶水解，進(jìn)而產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用，使得HIV-1蛋白酶無(wú)法水解底物物質(zhì)。
[0016] NSCl11887化合物顯示出一定的抗HIV-1蛋白酶活性的作用，其抗HIV-1蛋白酶活性的作用是通過(guò)自身的分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)決定的。NSC111887結(jié)構(gòu)中羥基基團(tuán)與HIV-1蛋白酶活性口袋內(nèi)催化殘基Asp25形成氫鍵作用，是發(fā)揮抗HIV-1蛋白酶活性的關(guān)鍵性因素。NSCl11887分子骨架上的酰胺鍵上羰基能夠與HIV-1蛋白酶結(jié)合腔頂部的Ile50/Ile50’形成分子間氫鍵作用，兩個(gè)柔性擋板相互靠近，進(jìn)而使HIV-1蛋白酶結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)閉合狀態(tài)。芐基基團(tuán)插入到HIV-1蛋白酶的疏水性口袋，從而加強(qiáng)了化合物NSC111887與HIV-1蛋白酶間的親和力。
[0017]本發(fā)明的 NSC121217 (methyl n-[ (benzyloxy) carbonyl]serylleucyltyrosinate)化合物結(jié)構(gòu)如下圖3所不:
[0018]NSC121217 分子式:C27H35N308。
[0019]NSC121217 分子量:530。
[0020]NSC121217化合物是一個(gè)三肽衍生物，含有三個(gè)肽鍵，一個(gè)自由羥基，分子兩端分別含有疏水性的芐基和一個(gè)親水性的苯酚結(jié)構(gòu)，同時(shí)分子結(jié)構(gòu)中部含有一個(gè)S構(gòu)型的手性碳，手性碳上連有一個(gè)異丁基。
[0021]NSC121217化合物對(duì)HIV-1蛋白酶靶點(diǎn)的不同濃度下的抑制率曲線如下圖4所示:
[0022]NSC121217化合物能夠與底物分子競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合艾滋病毒HIV-1蛋白酶活性口袋，從而占據(jù)結(jié)合位點(diǎn)，但該化合物不被HIV-1蛋白酶水解，進(jìn)而產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用，使得HIV-1蛋白酶無(wú)法水解底物物質(zhì)。
[0023]NSC121217化合物顯示出一定的抗HIV-1蛋白酶活性的作用，其抗HIV-1蛋白酶活性的作用是通過(guò)自身的分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)決定的。NSC121217結(jié)構(gòu)中羥基基團(tuán)與HIV-1蛋白酶活性口袋內(nèi)催化殘基Asp25形成氫鍵作用，是發(fā)揮抗HIV-1蛋白酶活性的關(guān)鍵性因素。NSC121217分子骨架上的酰胺鍵上羰基能夠與HIV-1蛋白酶結(jié)合腔頂部的Ile50形成分子間氫鍵作用，兩個(gè) 柔性擋板相互靠近，進(jìn)而使HIV-1蛋白酶結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)閉合狀態(tài)。另外，NSC121217結(jié)構(gòu)中異丁基插入到HIV-1蛋白酶的疏水性口袋，從而加強(qiáng)了化合物NSC121217與HIV-1蛋白酶間的親和力。
【具體實(shí)施方式】
[0024]為了理解本發(fā)明，下面以實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但不意于限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0025]本研究利用突光共振能量轉(zhuǎn)移(Fluorescenceresonance energy transfer,FRET)原理，在HIV-1蛋白酶底物兩端分別偶聯(lián)2個(gè)熒光探針供體和受體作為FRET對(duì)，即傳遞激發(fā)狀態(tài)的能量由處于較短波長(zhǎng)的供體(donor)到覆蓋供體波長(zhǎng)的受體(acceptor)，使得距離依賴性反應(yīng)的供體的散發(fā)光子淬滅。底物在艾滋病毒I蛋白酶的作用下，在酪氨酸(Tyr)和脯氨酸(Pro)殘基處切離，淬滅基團(tuán)與熒光發(fā)光基團(tuán)分離，釋放出強(qiáng)烈熒光的供體，在熒光酶標(biāo)儀下(激發(fā)波長(zhǎng)490nm，散發(fā)波長(zhǎng)530nm)，來(lái)定量檢測(cè)HIV-1蛋白酶的活性。
[0026]FRET多肽底物來(lái)源于HIV-1蛋白酶prgag的p17/p24裂解位點(diǎn)，底物濃度為100 μ Mo陽(yáng)性對(duì)照物胃酶抑素A (P印Statin A)是一個(gè)五肽衍生物，分子量為686，IC50值為1.1 μ Mo 蛋白酶濃度為 0.25mg/ml，蛋白酶溶液成分:20mM acetate，200mM NaCl，ImM EDTA，
0.5mM DTT, PH5.0.10 % glycerol。
[0027]1.實(shí)驗(yàn)前，取出_20°C冰箱里的試劑(HIV-1Protease和HIV-1Substrate)置入冰槽里
[0028]2.熒光酶標(biāo)儀溫度設(shè)置為25°C，激發(fā)波長(zhǎng)為490nm，散發(fā)波長(zhǎng)530nm。
[0029]3.在黑色96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記:零抑制對(duì)照、完全抑制對(duì)照和待測(cè)抑制劑樣品NSCl11887 和 NSC121217,并做復(fù)孔。
[0030]4.用溶劑DMSO將化合物NSCl 11887和NSC121217依次稀釋成以下濃度:0.I μ Μ,1.0 μ Μ, 3 μ Μ, 10 μ Μ, 30 μ Μ, 100 μ Μ, 300 μ Μ, ImM。
[0031]5.避光環(huán)境下，取I μ I HIV-1底物液和0.2 μ I的HIV-1蛋白酶液和100 μ I的緩沖液加到步驟3中帶有標(biāo)記的黑色96孔板每孔中。
[0032]6.分別取4μ I步驟4中不同濃度的化合物NSC111887和NSC121217相應(yīng)加到標(biāo)記為不同濃度待測(cè)抑制劑樣品的黑色96孔板每孔中，每個(gè)濃度做兩個(gè)復(fù)孔。
[0033]7.取4 μ I陽(yáng)性對(duì)照抑制劑(P印statinA)加到標(biāo)記為完全抑制對(duì)照的黑色96孔板中，做兩個(gè)復(fù)孔。
[0034]8.取相應(yīng)劑量4 μ I的去離子水加到標(biāo)記為零抑制對(duì)照孔的黑色96孔板中，做兩個(gè)復(fù)孔。
[0035]9.輕輕混勻，即刻將96孔板放進(jìn)熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)，獲得相對(duì)熒光讀數(shù)RFU (Relative Fluorescence Unit),每10分鐘讀數(shù)一次，收集60min內(nèi)的突光讀數(shù)。
[0036]10.相對(duì)熒光 讀數(shù)RFU值越高，表明酶活性越高；相反，相對(duì)熒光讀數(shù)RFU值越低，表明酶活性被抑制的程度越大。
[0037]11.抑制率計(jì)算公式:
[0038]抑制率=(陰性對(duì)照孔信號(hào)值-待測(cè)樣品孔信號(hào)值)/ (陰性對(duì)照孔信號(hào)值-陽(yáng)性樣品孔信號(hào)值)。
[0039]根據(jù)蛋白酶與不同濃度底物反應(yīng)的熒光強(qiáng)度，計(jì)算各濃度的抑制率并繪制出該化合物對(duì)蛋白酶活性的抑制率曲線，并計(jì)算得到該化合物對(duì)蛋白酶的半抑制濃度IC50值。
【權(quán)利要求】
1.一種如下式所述的化合物，
2.一種如下式所述的化合物，
3.根據(jù)權(quán)利要求1和權(quán)利要求2所述化合物，其中羥基基團(tuán)與HIV-1蛋白酶活性口袋內(nèi)催化殘基Asp25形成氫鍵作用，是發(fā)揮抗HIV-1蛋白酶活性的關(guān)鍵性因素。
4.根據(jù)權(quán)利要求1和權(quán)利要求2所述化合物，其中分子骨架上的酰胺鍵上羰基能夠與HIV-1蛋白酶結(jié)合腔頂部的Ile50/Ile50’形成分子間氫鍵作用，兩個(gè)柔性擋板相互靠近，進(jìn)而使HIV-1蛋白酶結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)閉合狀態(tài)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述化合物，芐基基團(tuán)插入到HIV-1蛋白酶的疏水性口袋，從而加強(qiáng)了化合物NSCl 11887與HIV-1蛋白酶間的親和力。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述化合物，異丁基基團(tuán)插入到HIV-1蛋白酶的疏水性口袋，從而加強(qiáng)了化合物NSC121217與HIV-1蛋白酶間的親和力。
7.根據(jù)權(quán)利要求1和權(quán)利要求2所述化合物，化合物分子與底物分子競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合艾滋病毒 HIV-1蛋白酶活性口袋，從而占據(jù)結(jié)合位點(diǎn)，但不被HIV-1蛋白酶水解，從而產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用，使HIV-1蛋白酶無(wú)法水解底物。
【文檔編號(hào)】C07K5/08GK104031117SQ201410168474
【公開(kāi)日】2014年9月10日 申請(qǐng)日期:2014年4月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月23日
【發(fā)明者】林建平, 黃偉強(qiáng), 洪章勇, 李冬梅, 魏宇, 陳澤銘, 李金龍 申請(qǐng)人:南開(kāi)大學(xué), 天津市康信醫(yī)藥科技有限公司