一種利拉魯肽的固相合成方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利拉魯肽的固相合成方法，包括步驟如下：1）先合成第1至第10氨基酸片段3、第11至第19氨基酸片段2、第20至第31氨基酸片段1，其中第20位上賴氨酸采用的是Fmoc-Lys(Mtt)-OH，第1位上組氨酸采用的是Boc-His(Trt)-OH；2）用液相合成法合成pal-Glu(OH)-Otbu；3）用5%TFA選擇性脫除第20位賴氨酸上的Mtt保護(hù)基，將pal-Glu(OH)-Otbu與第20位賴氨酸的側(cè)鏈相連接得到片段4；4）依次將片段2、片段3與片段4相連，得到利拉魯肽全保護(hù)的肽樹脂；5）通過裂解、純化、凍干，得到利拉魯肽精品。
【專利說明】一種利拉魯肽的固相合成方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種多肽的合成方法，具體涉及一種利拉魯肽的固相合成方法。
【背景技術(shù)】
[0002]利拉魯肽(Liraglutide)是由諾和諾德公司研發(fā)的人胰高血糖素樣肽_1 (GLP-1)類似物，由31個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，其分子的結(jié)構(gòu)如下:
H-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys (N-ε - (N-a -Palmitoyl-L- Y-glutamyl))-Glu-Phe-1le-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-GIy-Arg-GIy-OH
[0003]利拉魯肽(Liraglutide)是由諾和諾德公司研發(fā)的GLP-1類似物。該藥物2010年I月25日在美國(guó)批準(zhǔn)上市，劑型是皮下注射，每日只需皮下注射I次即可發(fā)揮良好的降糖作用。 [0004]利拉魯肽是根據(jù)天然的GLP-1 (7-37)序列合成的藥物。與GLP-1有95%的同源性，保留了 GLP-1 (7-37)的生物活性，其分子結(jié)構(gòu)與天然GLP-1分子不同的是第34位賴氨酸被精氨酸取代，第26位賴氨酸上增加一個(gè)由g谷氨酸連接的16碳棕櫚酰脂肪酸側(cè)鏈，使其在體內(nèi)與血漿白蛋白結(jié)合后形成可逆的藥物-白蛋白復(fù)合體，復(fù)合體不易被降解，還可以緩慢釋放藥物使分布時(shí)間延長(zhǎng)，克服了天然GLP-1 (7-37)易降解的缺點(diǎn)，半衰期達(dá)到13小時(shí)。
[0005]國(guó)內(nèi)外關(guān)于利拉魯肽制備報(bào)道的報(bào)道很多，諾和諾德公司主要是通過基因重組技術(shù)，利用酵母生產(chǎn)利拉魯肽；但由于需要采用基因重組技術(shù)，技術(shù)難度大，成本相對(duì)較高，同時(shí)由于Arg34-GLP-1 (7-37) -OH的側(cè)鏈處于未保護(hù)狀態(tài)，和Na -hexadecanoyl-Glu(ONSu)-OtBu反應(yīng)時(shí)會(huì)產(chǎn)生較多雜質(zhì),損失較大。國(guó)內(nèi)報(bào)道的利拉魯肽固相合成專利方法(CN103087181A)，采用王樹脂，按照利拉魯肽肽序逐個(gè)偶聯(lián)氨基酸，側(cè)鏈也是逐一偶聯(lián)，最后經(jīng)過反相純化得到利拉魯肽，這種方法需要逐個(gè)偶聯(lián)氨基酸，合成周期長(zhǎng)，總收率較低。國(guó)內(nèi)報(bào)道的利拉魯肽固相合成專利方法(CN102875665A)，采用的是分成5個(gè)片段合成利拉魯肽，此方法雖然能夠縮短合成周期，提高效率，但是分的片段較多，樹脂消耗量大，成本較高，且第20位賴氨酸采用Fmoc-Lys (Alloc) -OH,而選擇性脫除Al1c需要重金屬催化劑Pd(Ph3P)4，一般需要氮?dú)獗Ｗo(hù)下反應(yīng)，在工業(yè)上生產(chǎn)會(huì)受到限制。
本發(fā)明針對(duì)上述問題，找到一種解決方案，即通過將主鏈的合成分成了 3個(gè)片段分別合成再連接到一起的方法，其中第20位賴氨酸采用Fmoc-Lys(Mtt)-OH, Mtt的脫除只需要5%TFA/5%Tis在DCM中就能進(jìn)行，簡(jiǎn)單易行，工業(yè)化生產(chǎn)也不受限制。本發(fā)明將主鏈合成分成了 3個(gè)片段，既能縮短合成周期，提高效率，也能相對(duì)降低成本，側(cè)鏈以pal-Glu (OH) -Otbu為整體與賴氨酸相連，能夠提高合成收率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種利拉魯肽的合成方法，提高利拉魯肽的合成效率，降低合成成本，提高總收率，以便于工業(yè)化生產(chǎn)。
[0007]本發(fā)明提供一種利拉魯肽的合成方法，包括以下步驟:
O按照利拉魯肽主鏈N端至C端的氨基酸順序，先合成第I至第10氨基酸為片段3、第11至第19氨基酸為片段2、第20至第31氨基酸為片段1，共3個(gè)片段，其中第20位上賴氨酸采用的是Fmoc-Lys (Mtt) -OH,第I位上組氨酸采用的是Boc-His (Trt) -OH。
2)用液相合成法合成pal-Glu(OH)-Otbu。
3)用5%TFA選擇性脫除第20位賴氨酸上的Mtt保護(hù)基，將pal-Glu(OH) -Otbu與片段I中第20位的賴氨酸相連接得到片段4。
4)依次將片段2、片段3與片段4相連，得到利拉魯肽全保護(hù)的肽樹脂。
5)通過裂解、純化、凍干，得到利拉魯肽精品。
其中，所述步驟I)為利拉魯肽3個(gè)片段的制備，步驟如下:
[0008]其中片段I優(yōu)選的固相載體為王樹脂。以王樹脂為固相載體，依次進(jìn)行縮合反應(yīng)連接如下氨基酸:
Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg (pbf)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg (pbf) -OH> Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp (BOC)-OH> Fmoc-Ala-OH、Fmoc-1le-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu (Otbu)-OH、Fmoc-Lys (mtt)-OH,得到片段 I 全保護(hù)樹脂:
Fmoc-Lys(mtt)-Gl`u(Otbu)-Phe-1Ie-Ala-Trp(BOC)-Leu-Val-Arg(pbf)-Gly-Arg(pbf)_Gly_王樹脂
其中第一個(gè)氨基酸Fmoc-Gly-OH所使用的縮合劑是H0BT/DIC/DMAP，所使用的縮合溶劑為DMF。其余氨基酸所使用的縮合劑優(yōu)選H0BT/DIC，脫FMOC試劑優(yōu)選25%哌啶/DMF溶液。
其中片段2優(yōu)選的固相載體為二氯三苯甲基氯樹脂。以二氯三苯甲基氯樹脂為固相載體，依次進(jìn)行縮合反應(yīng)連接如下氨基酸:Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln (trt) _0H、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu (Otbu) -OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr (tbu) -OH、Fmoc-Ser (tbu) -OH、Fmoc-Ser (tbu)-OH,得到片段2全保護(hù)樹脂:
Fmoc-Ser(tbu)-Ser(tbu)-Tyr(tbu)-Leu-Glu(Otbu)-Gly-Gln(trt)-Ala-Ala-CTC 樹月旨。用1%TFA/DCM裂解片段2全保護(hù)樹脂I小時(shí)，得到片段2全保護(hù)肽Fmoc-Ser (tbu) -Ser(tbu)-Tyr(tbu)-Leu-Glu(Otbu)-Gly-Gln(trt)-Ala-Ala-OH。
其中第一個(gè)氨基酸Fmoc-Ala-OH所使用的縮合劑是DIEA，所使用的縮合溶劑為DMF。其余氨基酸所使用的縮合劑優(yōu)選H0BT/DIC，脫FMOC試劑優(yōu)選25%哌啶/DMF溶液。
其中片段3優(yōu)選的固相載體為二氯三苯甲基氯樹脂。以二氯三苯甲基氯樹脂為固相載體，依次進(jìn)行縮合反應(yīng)連接如下氨基酸:
Fmoc-Val-OH、 Fmoc-Asp(otbu)-OH、 Fmoc-Ser(tbu)-OH> Fmoc-Thr(tbu)-OH>Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr (tbu) -OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu (Otbu) -OH、Fmoc-Ala-OH、BOC-His (trt) -OH,得到片段3全保護(hù)樹脂:
BOC-His(trt)-Ala-Glu(Otbu)-Gly-Thr(tbu)-Phe-Thr(tbu)-Ser(tbu)-Asp(otbu)-Val-CTC樹脂。用1%TFA/DCM裂解片段3全保護(hù)樹脂I小時(shí)，得到片段3全保護(hù)肽:
BOC-His(trt)-Ala-Glu(Otbu)-Gly-Thr (tbu)-Phe-Thr (tbu)-Ser (tbu)-Asp(otbu)-Val-OH其中第一個(gè)氨基酸Fmoc-Val-OH所使用的縮合劑是DIEA，所使用的縮合溶劑為DMF。其余氨基酸所使用的縮合劑優(yōu)選H0BT/DIC，脫FMOC試劑優(yōu)選25%哌啶/DMF溶液。
[0009]其中，所述步驟2)用液相合成法合成pal-Glu (OH)-Otbu,步驟如下:
冰浴下，Glu (OH) -Otbu溶于THF溶液中，加入2倍量的TEA，然后棕櫚酰氯加入到上述溶液反應(yīng)3小時(shí)，然后加入10倍量的水，調(diào)節(jié)PH為4-5，以乙酸乙酯萃取，飽和NaHC03溶液洗滌，水洗，鹽水洗滌，干燥、旋干，以乙酸乙酯石油醚重結(jié)晶，抽濾，烘干，待用。
[0010]其中，所述步驟3)步驟如下: 將片段I全保護(hù)樹脂:
Fmoc-Lys(mtt)-Glu(Otbu)-Phe-1le-Ala-Trp(BOC)-Leu-Val-Arg(pbf)-Gly-Arg(pbf)-Gly-王樹脂，用切割試劑A: (TFA: Ti s: DCM=5:5:90),室溫下震蕩2次，每次30分鐘，依次用DCM、甲醇、DMF、DCM各洗滌2次，抽干，得到
Fmoc-Lys-Glu(Otbu)-Phe-1le-Ala-Trp(BOC)-Leu-Val-Arg(pbf)-Gly-Arg(pbf)-Gly-王樹脂，然后將pal-Glu (OH) -Otbu以DIC，HOBT活化后加入到上述樹脂的DMF溶液中，反應(yīng)120分鐘，抽濾，依次用DCM、甲醇、DMF、DCM各洗滌2次，得到片段4全保護(hù)樹脂:
Fmoc-Lys (pal-Glu (otbu))-Glu(Otbu)-Phe-1le-Ala-Trp(BOC)-Leu-Val-Arg(pbf)-GIy-Arg(pbf) -Gly-王樹脂。
[0011]其中，所述步驟4)步驟如下:
片段4全保護(hù)樹脂，加25%哌啶/DMF溶液反應(yīng)10分鐘各2次，得到H2N-LyS(pal_Glu(otbu)) -Glu (Otbu) -Phe-1le-Ala-Trp (BOC) -Leu-Val-Arg (pbf) -Gly-Arg (pbf) -Gly-王樹脂，將全保護(hù)肽片段2以DIC，HOBT活化后加入到上述樹脂的DMF溶液中，反應(yīng)120分鐘，抽濾，依次用DCM、甲醇、DMF、DCM各洗滌2次，得到片段5全保護(hù)樹脂
Fmoc-Ser(tbu)-Ser(tbu)-Tyr(tbu)-Leu-Glu(Otbu)-Gly-Gln(trt)-Ala-Ala-Lys (pa1-Glu (otbu))-Glu (Otbu)-Phe-1le-Ala-Trp (BOC)Leu-Val-Arg(pbf)-Gly-Arg(pbf)-Gly-王樹脂，片段5全保護(hù)樹脂，加25%哌啶/DMF溶液反應(yīng)10分鐘各2次，得到
H2N-Ser(tbu)-Ser(tbu)-Tyr(tbu)-Leu-Glu(Otbu)-Gly-Gln(trt)-Ala-Ala-Lys (pa1-Glu (otbu))-Glu (Otbu)-Phe-1Ie-Ala-Trp(BOC)-Leu-Val-Arg(pbf)-Gly-Arg(pbf)-Gly-王樹脂，將全保護(hù)肽片段3以DIC，HOBT活化后加入到上述樹脂的DMF溶液中，反應(yīng)120分鐘，抽濾，依次用DCM、甲醇、DMF、DCM各洗滌2次，得到利拉魯肽全保護(hù)的肽樹脂:
BOC-His(trt)-Ala-Glu (Otbu)-Gly-Thr (tbu)-Phe-Thr (tbu)-Ser (tbu)-Asp (otbu)-Val-Ser(tbu)-Ser(tbu)-Tyr(tbu)-Leu-Glu(Otbu)-Gly-Gln(trt)-Ala-Ala-Lys (pal-Glu(otbu)) -Glu (Otbu) -Phe-1le-Ala-Trp (BOC) -Leu-Val-Arg (pbf) -Gly-Arg (pbf) -Gly-王樹脂。
[0012]其中，所述步驟5)步驟如下:
裂解步驟，每克樹脂加IOml裂解液，裂解液體積比TFA:EDT:H20=90-95:2.5-5:2.5-5,裂解2小時(shí)，加乙醚沉淀，過濾得到粗肽。粗肽經(jīng)過反相高效液相色譜純化，冷凍干燥，得到精妝。
[0013]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)主要表現(xiàn)在:
本合成方法既能縮短合成周期，提高效率，也能降低成本，側(cè)鏈以pal-Glu (OH) -Otbu為整體與賴氨酸相連，能夠提高合成收率，便于工業(yè)化生產(chǎn)。以下通過實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)說明本發(fā)明的有益效果:
收率純度成本合成周步驟的
【權(quán)利要求】
1.一種利拉魯肽的固相合成方法，其特征在于，包括如下步驟: 步驟1、按照利拉魯肽主鏈N端至C端的氨基酸順序，先合成第I至第10氨基酸片段3，第11至第19氨基酸片段2，第20至第31氨基酸片段1，共3個(gè)片段，其中第20位上賴氨酸采用的是Fmoc-Lys (Mtt) -OH,第I位上組氨酸采用的是Boc-His (Trt) -OH ； 步驟2、用液相合成法合成pal-Glu(0H)-0tbu ； 步驟3、用5%TFA選擇性脫除第20位賴氨酸上的Mtt保護(hù)基，將pal_Glu (OH) -Otbu與片段I上第20位賴氨酸相連接得到片段4 ； 步驟4、依次將片段2、片段3與片段4相連，得到利拉魯肽全保護(hù)的肽樹脂； 步驟5、通過裂解、純化、凍干，得到利拉魯肽精品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，步驟I所述固相合成多肽片段1，步驟如下: 以王樹脂為固相載體，依次進(jìn)行縮合反應(yīng)連接如下氨基酸:
Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg (pbf)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg (pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp (BOC)-OH> Fmoc-Ala-OH、Fmoc-1le-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu (Otbu)-OH、Fmoc-Lys (mtt)-OH,得到片段 I 全保護(hù)樹脂:
Fmoc-Lys(mtt)-Glu(Otbu)-Phe-1le-Ala-Trp(BOC)-Leu-Val-Arg(pbf)-Gly-Arg(pbf)-Gly-王樹脂，所述的王樹脂與第一個(gè)氨基酸Fmoc-Gly-OH偶聯(lián)所使用的偶聯(lián)劑是HOBT/DIC/DMAP。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，步驟I所述固相合成多肽片段2，步驟如下: 以二氯三苯甲基氯樹脂為固相載體，依次進(jìn)行縮合反應(yīng)連接如下氨基酸:
Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln (trt) -OH> Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu (Otbu) -OH>Fmoc-Leu-OH>Fmoc-Tyr (tbu) -OH、Fmoc_Ser (tbu) -OH、Fmoc_Ser (tbu) -OH,得到片段 2 全保護(hù)樹脂:
Fmoc-Ser (tbu)-Ser(tbu)-Tyr(tbu)-Leu-Glu(Otbu)-Gly-Gln(trt)-Ala-Ala-CTC 樹月旨。用1%TFA/DCM裂解片段2全保護(hù)樹脂I小時(shí)，得到片段2全保護(hù)肽Fmoc-Ser (tbu) -Ser(tbu) -Tyr (tbu) -Leu-Glu (Otbu) -Gly-Gln (trt) -Ala-Ala-OH,所述的二氯三苯甲基氯樹脂與第一個(gè)氨基酸偶聯(lián)所使用的偶聯(lián)劑是DIEA。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，步驟I所述固相合成多肽片段3，步驟如下: 以二氯三苯甲基氯樹脂為固相載體，依次進(jìn)行縮合反應(yīng)連接如下氨基酸: Fmoc-Val-OH、 Fmoc-Asp(otbu)-OH、 Fmoc-Ser(tbu)-OH> Fmoc-Thr(tbu)-OH>Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr (tbu) -OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu (Otbu) -OH、Fmoc-Ala-OH、BOC-His (trt) -OH,得到片段3全保護(hù)樹脂:
BOC-His(trt)-Ala-Glu(Otbu)-Gly-Thr(tbu)-Phe-Thr(tbu)-Ser(tbu)-Asp(otbu)-Val-CTC樹脂。用1% TFA/DCM裂解片段3全保護(hù)樹脂I小時(shí)，得到片段3全保護(hù)肽:
BOC-Hi s (trt) -Ala-Glu (Otbu) -Gly-Thr (tbu) -Phe-Thr (tbu) -Ser (tbu) -Asp (otbu) -Val-OH，所述的二氯三苯甲基氯樹脂與第一個(gè)氨基酸偶聯(lián)所使用的偶聯(lián)劑是DIEA。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，步驟2所述用液相合成法合成pal-Glu (OH)-Otbu,步驟如下: 冰浴下，Glu (OH) -Otbu溶于THF溶液中，加入2倍量的TEA，然后棕櫚酰氯加入到上述溶液反應(yīng)3小時(shí)，然后加入10倍量的水，調(diào)節(jié)PH為4-5，以乙酸乙酯萃取，飽和NaHC03溶液洗滌，水洗，鹽水洗滌，干燥、旋干，以乙酸乙酯石油醚重結(jié)晶，抽濾，烘干，待用。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，步驟3所述固相合成多肽片段4，步驟如下: 將片段I全保護(hù)樹脂:
Fmoc-Lys(mtt)-Glu(Otbu)-Phe-1Ie-Ala-Trp(BOC)-Leu-Val-Arg(pbf)-Gly-Arg(pbf)-Gly-王樹脂，用切割試劑A: (TFA:Tis:DCM=5:5:90),室溫下震蕩2次，每次30分鐘，依次用 DCM、甲醇、DMF、DCM 各洗滌 2 次，抽干，得到 Fmoc-Lys-Glu (Otbu) -Phe-1le-Ala-Trp (B0C) -Leu-Val-Arg (pbf) -Gly-Arg (pbf) -Gly-王樹脂,然后將 pal-Glu (OH) -Otbu 以 DIC, HOBT活化后加入到上述樹脂的DMF溶液中，反應(yīng)120分鐘，抽濾，依次用DCM、甲醇、DMF、DCM各洗漆 2 次，得到片段 4 全保護(hù)樹脂:Fmoc_Lys (pal-Glu (otbu))-Glu (Otbu)-Phe-1le-Ala-Trp(BOC) -Leu-Val-Arg(pbf) -Gly-Arg(pbf) -Gly-王樹脂。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，步驟4所述得到利拉魯肽全保護(hù)的肽樹脂，步驟如下: 片段4全保護(hù)樹脂，加25%哌啶/DMF溶液反應(yīng)10分鐘各2次，得到H2N-LyS(pal_Glu(otbu)) -Glu (Otbu) -Phe-1le-Ala-Trp (BOC) -Leu-Val-Arg (pbf) -Gly-Arg (pbf) -Gly-王樹脂，將全保護(hù)肽片段2以DIC，HOBT活化后加入到上述樹脂的DMF溶液中，反應(yīng)120分鐘，抽濾，依次用DCM、甲醇、DMF、DCM各洗滌2次，得到片段5全保護(hù)樹脂
Fmoc-Ser(tbu)-Ser(tbu)-Tyr(tbu)-Leu-Glu(Otbu)-Gly-Gln(trt)-Ala-Ala-Lys (pa1-Glu(otbu))-Glu(Otbu)-Phe-1le-Ala-Trp(BOC)-Leu-Val-Arg(pbf)-Gly-Arg(pbf)-Gly-王樹脂，片段5全保護(hù)樹脂，加25%哌啶/DMF溶液反應(yīng)10分鐘各2次，得到
H2N-Ser(tbu)-Ser(tbu)-Tyr(tbu)-Leu-Glu(Otbu)-Gly-Gln (trt)-Ala-Ala-Lys (pa1-Glu(otbu))-G lu(Otbu)-Phe-1le-Ala-Trp(BOC)-Leu-Val-Arg (pbf)-Gly-Arg (pbf)-Gly-王樹脂，將全保護(hù)肽片段3以DIC，HOBT活化后加入到上述樹脂的DMF溶液中，反應(yīng)120分鐘，抽濾，依次用DCM、甲醇、DMF、DCM各洗滌2次，得到利拉魯肽全保護(hù)的肽樹脂
BOC-His (trt)-Ala-Glu (Otbu)-Gly-Thr (tbu)-Phe-Thr(tbu)-Ser (tbu)-Asp(otbu)-Val-Ser(tbu)-Ser(tbu)-Tyr(tbu)-Leu-Glu(Otbu)-Gly-Gln(trt)-Ala-Ala-Lys (pal-Glu(otbu)) -Glu (Otbu) -Phe-1le-Ala-Trp (BOC) -Leu-Val-Arg (pbf) -Gly-Arg (pbf) -Gly-王樹脂。
8.根據(jù)權(quán)利要求2、3、4所述方法，其特征在于，所述多肽片段固相合成中，除了第一個(gè)氨基酸的偶聯(lián)外，其余氨基酸偶聯(lián)所使用的縮合劑為H0BT/DIC、TBTU/DIEA或者HBTU/DIEA0
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，步驟5所述裂解采用體積比TFA:EDT:H20=90-95:2.5-5:2.5-5 的裂解劑。
【文檔編號(hào)】C07K1/04GK103864918SQ201410125860
【公開日】2014年6月18日 申請(qǐng)日期:2014年3月31日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月31日
【發(fā)明者】冷國(guó)慶, 余榮熹, 王艷, 王浩, 遲帥, 劉宇帥, 田輝, 張琪, 李迎新, 肖明輝, 李喜全, 趙民喜, 蘇宏健 申請(qǐng)人:哈爾濱吉象隆生物技術(shù)有限公司