一種非洲黃爪蝎抗菌肽基因、抗菌肽Os_116、其結(jié)構(gòu)同源抗菌肽、制備方法及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明具體涉及一種非洲黃爪蝎抗菌肽基因、抗菌肽Os_116、其結(jié)構(gòu)同源抗菌肽、制備方法及應(yīng)用。本發(fā)明篩選獲得一種新的非洲黃爪蝎抗菌肽基因，其核苷酸序列如序列表SEQIDNO：1所示，由該基因編碼的非洲黃爪蝎抗菌肽的氨基酸序列如序列表SEQIDNO：2所示。本發(fā)明還提供了人工合成的非洲黃爪蝎抗菌肽Os_116及其結(jié)構(gòu)同源抗菌肽，其氨基酸序列如SEQIDNO：3~5所示，所述抗菌肽Os_116及其結(jié)構(gòu)同源抗菌肽對(duì)多重耐藥性病原菌和革蘭氏細(xì)菌具有較強(qiáng)的抗菌活性，其分子量小且具有廣譜抗菌機(jī)制作用，和傳統(tǒng)抗生素相比大大降低了耐藥機(jī)率，且在低濃度下對(duì)人的正常細(xì)胞毒性小，是抗生素的最佳替代物。
【專利說(shuō)明】一種非洲黃爪蝎抗菌肽基因、抗菌肽Os_116、其結(jié)構(gòu)同源抗菌肽、制備方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種非洲黃爪蝎抗菌肽基因、抗菌肽0s_116、其結(jié)構(gòu)同源抗菌肽、制備方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]耐甲氧西林金黃色葡萄球菌ipwthici 11 in-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)是指對(duì)異唑青霉素(如甲氧西林、苯唑西林和氟氯西林)耐藥的金黃色葡萄球菌株，目前也被稱為超級(jí)細(xì)菌。自1961年，MRSA在英國(guó)首次發(fā)現(xiàn)后，其分離率逐年增加；1985年開始爆發(fā)流行，已成為醫(yī)院感染的重要致病菌之一。MRSA多重耐藥現(xiàn)象日益嚴(yán)重，部分地區(qū)已經(jīng)出現(xiàn)對(duì)萬(wàn)古霉素耐藥、中介耐藥以及異質(zhì)性耐藥MRSA細(xì)菌。MRSA引起的感染耐藥高、死亡率高因而成為威脅全球公共衛(wèi)生安全的嚴(yán)重問(wèn)題。MRSA流行的分布，根據(jù)地域的不同而存在很大的差異，到20世紀(jì)80年代后期，MRSA就已成為全球發(fā)生率最高的醫(yī)院內(nèi)感染病原菌之一。全球約有超過(guò)16億人攜帶葡萄球菌，保守估計(jì)攜帶MRSA的人群大約在200- 8500萬(wàn)。MRSA感染率逐年上升，2009年，中國(guó)CHINET細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)中，得到金葡菌中甲氧西林耐藥株MRSA平均為52.17%。在2004年，美國(guó)ICU病房，MRSA的分離率達(dá)到了 66.17%。在1995年至2003年加拿大醫(yī)院MRSA的發(fā)生率增長(zhǎng)了 10倍。歐洲最近的一項(xiàng)抗生素耐藥檢測(cè)指出，在2000~2008年，馬耳他MRSA引起的菌血癥，已經(jīng)居歐洲之首，2006年最高達(dá)到了 66%。在地中海地區(qū)很多國(guó)家，MRSA的感染也已經(jīng)很嚴(yán)重。
[0003]隨著萬(wàn)古霉素臨床應(yīng)用的增多，萬(wàn)古霉素耐藥腸球菌(yancomycin resis tan tenterococcus, VRE)不斷出現(xiàn)。自1988年首次分離得到第一株VRE以來(lái),糖肽類抗生素耐藥腸球菌的數(shù)量不斷增多 ，并且VRE具有將萬(wàn)古霉素耐藥性傳遞到金黃色葡萄球菌的危險(xiǎn)。目前還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)十分有效的治療VRE的藥物，一般原則是檢測(cè)病原菌的敏感性，根據(jù)藥敏結(jié)果來(lái)選擇合適的抗感染藥物。研究還表明，VRE存在多種基因型，VRE基因型不同對(duì)糖肽類抗生素的耐藥性不同。由于腸球菌對(duì)幾種常用的抗生素天然耐藥，而且它們能夠通過(guò)變異或通過(guò)質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)移來(lái)的外來(lái)基因獲得更多的耐藥性，VRE往往對(duì)抗生素多重耐藥，這給臨床治療帶來(lái)更多的困難。目前VRE在美國(guó)已成為致死率高達(dá)36%的院內(nèi)感染病原菌，美國(guó)醫(yī)院感染監(jiān)視系統(tǒng)(NISS)已將其列為引起醫(yī)院感染的第二位的病原菌，引起了人們的極大關(guān)注。有證據(jù)表明，VRE的耐藥基因可輕易地傳遞至腸球菌外的其它細(xì)菌(如金黃色葡萄球菌)，這對(duì)將來(lái)的抗感染治療帶來(lái)了極大的威脅。
[0004]藤黃微球菌CliicrococciAs Iuteus)為專性需氧革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌,廣泛分布于空氣、水、土壤中，也見于人與動(dòng)物皮膚、咽部、眼睛等部位，是人和動(dòng)物的條件致病菌，能引起人的腦膜炎、肺炎、敗血癥、膿毒性關(guān)節(jié)炎。近年來(lái)在抗生素選擇壓力下，條件致病菌日益增多，并且有繼續(xù)增高的趨勢(shì)，因此對(duì)藤黃微球菌應(yīng)引起高度的重視。
[0005]蝎子是我國(guó)的一種傳統(tǒng)名貴中藥材料，具有抗腫瘤、殺蟲、抑菌和抗菌功效，其作用主要來(lái)源蝎尾毒腺分泌的毒液。從多種蝎毒中鑒定了一類小分子抗菌活性肽，是一類由宿主生成在天然免疫中特異性發(fā)揮防御性作用的一類小分子多肽，通常由10-50個(gè)氨基酸構(gòu)成，靜電荷從+2到+9等。這樣的抗菌肽在大多數(shù)生物的天然防御方面具有重要的功能，用于抵御革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌、革蘭氏陰性細(xì)菌、真菌、原蟲及病毒感染。研究表明陽(yáng)離子抗菌肽可選擇性作用于細(xì)胞外膜或信號(hào)通路中不同的靶標(biāo)。與傳統(tǒng)抗生素相比較，這可能是細(xì)菌對(duì)陽(yáng)離子抗菌肽更難產(chǎn)生抗性的原因。另有一些研究表明抗菌肽不僅具有抗菌活性，而且還作為信號(hào)分子參與免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)(尤其是感染和炎癥)。陽(yáng)離子抗菌肽具有分子量小、廣譜抗菌活性及不易產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)，因此可以作為潛在的、理想的抗生素替代藥物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種非洲黃爪蝎抗菌肽基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1 所示。
[0007]本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種由上述非洲黃爪蝎抗菌肽基因編碼的非洲黃爪蝎抗菌肽，其氨基酸序列如序列表SEQ ID Ν0:2所示。
[0008]本發(fā)明的再一個(gè)目的在于提供一種人工合成的非洲黃爪蝎抗菌肽0s_116，它是將上述非洲黃爪蝎抗菌肽基因編碼的非洲黃爪蝎抗菌肽去除信號(hào)肽和前體肽后得到的，其氨基酸序列如序列表SEQ ID N0:3所不。
[0009]本發(fā)明的四個(gè)目的在于提供上述人工合成的非洲黃爪蝎抗菌肽0s_116的結(jié)構(gòu)同源抗菌肽，其氨基酸序列如序列表SEQ ID N0:4~5所示。
[0010]本發(fā)明的第五個(gè)目的在于提供上述非洲黃爪蝎抗菌肽0s_116及其結(jié)構(gòu)同源抗菌肽的人工合成方法。
[0011]本發(fā)明的第六個(gè)目 的在于提供上述非洲黃爪蝎抗菌肽0s_l 16及其結(jié)構(gòu)同源抗菌肽在制備治療或預(yù)防多重耐藥性病原菌和革蘭氏細(xì)菌的藥物中的應(yīng)用，所述多重耐藥性病原菌為MRSA和VRE。
[0012]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為:
一種非洲黃爪蝎抗菌肽基因，其特征在于，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:1所示。
[0013]按上述方案,所述非洲黃爪蝎抗菌肽基因是首次從非洲黃爪蝎iOpistophthalmus
毒腺中分離得到的，具體通過(guò)如下步驟獲得:(1)首先提取非洲黃爪蝎毒腺mRNA,通過(guò)反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增得到大小不一的雙鏈cDNA，再將雙鏈cDNA與載體連接并轉(zhuǎn)化后，構(gòu)建得到cDNA文庫(kù)；(2)采用PCR策略從上述cDNA文庫(kù)中篩選PCR產(chǎn)物為300_600bp大小的克隆子，進(jìn)行測(cè)序并與已知抗菌肽序列比對(duì)其同源性，經(jīng)過(guò)同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn)了一種非洲黃爪蝎抗菌肽基因和已有報(bào)道的Meucin-18、BmKb2、BmKbl和BmKbP等抗菌肽基因的同源性分別為44.9%,30.8%,29.5%和29.5%，結(jié)果表明，該篩選得到的非洲黃爪蝎抗菌肽基因是一個(gè)新抗菌肽基因。
[0014]由上述黃爪蝎抗菌 肽基因編碼的非洲黃爪蝎抗菌肽，其特征在于，它的氨基酸序列如序列表SEQ ID N0:2所示。所述非洲黃爪蝎抗菌肽由76個(gè)氨基酸殘基組成，包括三部分:22個(gè)氨基酸殘基長(zhǎng)的信號(hào)肽， 19個(gè)氨基酸殘基長(zhǎng)的成熟肽，以及35個(gè)氨基酸殘基長(zhǎng)的前體肽(見圖1)。[0015]人工合成的非洲黃爪蝎抗菌肽0s_116，其特征在于，它是將上述非洲黃爪蝎抗菌肽基因編碼的非洲黃爪蝎抗菌肽去除信號(hào)肽和前體肽后得到的，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:3 所示。
[0016]按上述方案,對(duì)所述非洲黃爪蝎抗菌肽0s_116通過(guò)NPSA server和HeliQuest軟件結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)該非洲黃爪蝎抗菌肽0s_116具有以下抗菌肽的結(jié)構(gòu)特征:a -螺旋并有疏水和未水面(結(jié)構(gòu)特征不意圖見圖2)。
[0017]人工合成的非洲黃爪蝎抗菌肽0s_116的結(jié)構(gòu)同源抗菌肽，其特征在于，它是基于非洲黃爪蝎抗菌肽0s_116的氨基酸序列進(jìn)行點(diǎn)突變后得到的，其氨基酸序列如序列表SEQID NO:4~5所示。
[0018]按上述方案，所述的點(diǎn)突變需遵循以下原則:1、在保持現(xiàn)有非洲黃爪蝎抗菌肽0s_116的α-螺旋結(jié)構(gòu)的前提下，盡量使突變后的抗菌肽兩親性更加明顯，即使其疏水面更疏水、親水面親水性更強(qiáng)；2、增強(qiáng)親水面的靜電荷數(shù)量，提高其對(duì)磷脂膜的靜電吸引作用；3、去掉對(duì)形成α-螺旋結(jié)構(gòu)有破壞作用的氨基酸。將突變后得到的氨基酸序列如序列表SEQ ID Ν0:4所示的結(jié)構(gòu)同源抗菌肽命名為抗菌肽0s_116Ml，氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:5所示的結(jié)構(gòu)同源抗菌肽命名為抗菌肽0s_116M2，抗菌肽0s_116Ml和抗菌肽0s_116M2的結(jié)構(gòu)特征示意圖見圖3和圖4。
[0019]上述非洲黃爪蝎抗菌肽0s_l 16及其結(jié)構(gòu)同源抗菌肽的人工合成方法，其特征在于:分別根據(jù)序列表SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，采用固相化學(xué)法合成多肽序列，并對(duì)合成的多肽進(jìn)行C端酰胺化，然后通過(guò)HPLC反相C18柱層析脫鹽、純化得到非洲黃爪蝎抗菌肽0s_116及其結(jié)構(gòu)同源抗菌肽。
[0020]上述非洲黃爪蝎 抗菌肽0s_116及其結(jié)構(gòu)同源抗菌肽在制備治療或預(yù)防多重耐藥性病原菌和革蘭氏細(xì)菌的藥物中的應(yīng)用，所述多重耐藥性病原菌為MRSA和VRE。
[0021]按上述方案，所述非洲黃爪蝎抗菌肽0s_116對(duì)革蘭氏細(xì)菌的抗菌結(jié)果為:(I)對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌:大腸桿菌(疋coli ) DH5 α、綠膿桿菌iPseudomorms aeruginosa )和惡臭假單胞菌putida')的最小抑制菌生長(zhǎng)濃度(minimal inhibitoryconcentration, MIC)均為20 μΜ ；(2)對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌:金黃色葡萄球菌{Staphylococcus aureus ) > 珊瑚諾卡氏 HNocardia coralIina ) > 蘇云金芽胞桿菌{Bacillus thuringiensis')、藤黃微球菌 iMicrococcus Iuteus)和巨大芽抱桿菌(.Bacillus megaterium)飽 WiC 分別為 4 μΜ、4 μΜ、6 μΜ、8 μ M 和 10 μ Μ。所述非洲黃爪蝎抗菌肽0s_116的結(jié)構(gòu)同源抗菌肽:抗菌肽0s_116Ml和抗菌肽0s_116M2對(duì)革蘭氏細(xì)菌的MIC值見表1。上述抗菌結(jié)果表明所述非洲黃爪蝎抗菌肽0s_l 16及其結(jié)構(gòu)同源抗菌肽可應(yīng)用于制備治療或預(yù)防革蘭氏病菌的藥物中，特別地可以應(yīng)用于制備治療或預(yù)防因藤黃微球菌引起的疾病的藥物中，如應(yīng)用于制備治療或預(yù)防因藤黃微球菌引起的腦膜炎、肺炎、敗血癥、膿毒性關(guān)節(jié)炎和腦膿腫等疾病的藥物中。
[0022]所述非洲黃爪蝎抗菌肽0s_116對(duì)多重耐藥性病原菌的抗菌結(jié)果為:(I)對(duì)從北京朝陽(yáng)醫(yī)院分離的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌MRSA:菌株5^的MIC為2 μΜ，菌株16436、16465、16558、16559、16585、16679、16731、16748 和 16760 的 MIC 均為 4 μΜ;(2)對(duì)萬(wàn)古霉素耐藥腸球菌VRE:菌株E147、E161、E179、S13的MIC均為4 μ M，菌株E11、E128、E156的MIC均為6 μ M。所述非洲黃爪蝎抗菌肽0s_l 16的結(jié)構(gòu)同源抗菌肽:抗菌肽0s_116Ml和抗菌肽Os_116M2對(duì)多重耐藥性病原菌的MIC值見表2。上述抗菌結(jié)果表明，所述非洲黃爪蝎抗菌肽Os_l 16及其結(jié)構(gòu)同源抗菌肽在低濃度的條件下就能高效抑制MRSA以及VRE的生長(zhǎng)，可以應(yīng)用于制備治療或預(yù)防因MRSA、VRE引起的疾病的藥物中，尤其是制備治療或預(yù)防因MRSA、VRE引起的呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎、敗血癥、腦膜炎、中耳炎、皮膚軟組織感染、泌尿系統(tǒng)感染和中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染等嚴(yán)重感染性疾病的藥物中。
[0023]本發(fā)明提供的非洲黃爪蝎抗菌肽0s_116及其結(jié)構(gòu)同源抗菌肽對(duì)多重耐藥性病原菌和革蘭氏細(xì)菌具有較強(qiáng)的抗菌活性，分子量小且具有廣譜抗菌機(jī)制作用，和傳統(tǒng)抗生素相比大大降低了耐藥機(jī)率，并且在低濃度下對(duì)人的正常細(xì)胞毒性小，因此在面臨抗藥性和篩選新的抗生素極端困難的情況下，成為抗生素的最佳替代物。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0024]圖1為本發(fā)明提供的非洲黃爪蝎抗菌肽基因及其編碼的抗菌肽的氨基酸序列示意圖。圖中核苷酸序列下方為推斷的對(duì)應(yīng)氨基酸序列；信號(hào)肽氨基酸以單下劃線標(biāo)記；陰影部分氨基酸為C端前體肽；信號(hào)肽和C端前體肽中間序列為成熟肽序列，第一個(gè)成熟肽氨基酸殘基用+1表示；方框里氨基酸序列為羧肽酶切位點(diǎn)；多聚腺苷酸化信號(hào)以斜體下劃線標(biāo)記。
[0025]圖2為非洲黃爪蝎抗菌肽0s_116的結(jié)構(gòu)特征圖。
[0026]圖3為非洲黃爪蝎抗菌肽0s_116的結(jié)構(gòu)同源抗菌肽0s_116Ml的結(jié)構(gòu)特征圖。
[0027]圖4為非洲黃爪蝎抗菌肽0s_116的結(jié)構(gòu)同源抗菌肽0s_116M2的結(jié)構(gòu)特征圖。
[0028]圖5為非洲黃爪蝎抗菌肽0s_116及其結(jié)構(gòu)同源抗菌肽(抗菌肽0s_116Ml和抗菌肽0s_116M2)的毒性試 驗(yàn)結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0029]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)具體的說(shuō)明，但是本發(fā)明的保護(hù)內(nèi)容并不局限于以下實(shí)施例。
[0030]實(shí)施例1非洲黃爪蝎抗菌肽基因的獲得
1、非洲黃爪蝎毒腺總RNA的提取(RNAiso Plus，購(gòu)于Takara)
(1)取電擊過(guò)好的蝎尾腺迅速轉(zhuǎn)移至用液氮預(yù)冷的研缽中，用研杵研磨組織，其間不斷加入液氮，直至將蝎尾腺研磨成粉末狀(研磨越徹底，RNA的收率和質(zhì)量越高)，向研缽中加入與樣品勻 染量匹配的適量的RNAiso Plus,充分勻衆(zhòng)；
(2)將勻漿液轉(zhuǎn)移至離心管中，室溫(15~30°C)靜置5min ；
(3)然后加入氯仿(氯仿體積為RNAisoPlus體積的1/5)，蓋緊離心管蓋，混合至溶液乳化呈乳白色，室溫靜置5 min；
(4)12,000 g 4°C離心15 min，從離心機(jī)中小心取出離心管，此時(shí)勻漿液分為三層，即:無(wú)色的上清液(含RNA)、中間的白色蛋白層(大部分為DNA)及帶有顏色的下層有機(jī)相，吸取上清液轉(zhuǎn)移至另一新的離心管中(切勿吸出白色中間層)；
(5)向上清液中加入異丙醇(異丙醇體積為RNAisoPlus體積的0.5~I倍)，上下顛倒離心管充分混勻后，室溫下靜置10 min ； 12, OOOg 4°C離心10 min，得到RNA沉淀；
(6)RNA沉淀用75%乙醇洗滌(乙醇加入量與RNAiso Plus體積相同)，7，500X g 4°C離心5 min后棄去上清；室溫下將RNA沉淀干燥后，加入適量的RNase-free水溶解RNA沉淀，得到蝎毒腺總RNA。整個(gè)過(guò)程參照RNAiso Plus (Total RNA提取試劑)推薦方法進(jìn)行，制備的蝎毒腺總RNA采用用瓊脂糖凝膠電泳(1%瓊脂糖+溴乙錠)分析檢測(cè)其質(zhì)量。
[0031]2、mRNA的分離純化
采用PolyA Tract mRNA分離系統(tǒng)(Promega，USA)分離和純化蝎毒腺總RNA，得到mRNA，其工作原理是基于Oligo (dT)與mRNA 3 ^端poly (A)尾的互補(bǔ)配對(duì)特性，
用生物素標(biāo)記oligo (dT),通過(guò)它與mRNA3 '端poly (A)的退火形成雜合體,然后用標(biāo)有親和素的磁珠和磁性分離架捕獲并洗漆生物素01igo(dT)/mRNA雜交體,最后用無(wú)RNA酶的ddH20將之洗脫下來(lái)，達(dá)到從總RNA中分離mRNA的目的。具體操作步驟如下:
(1)樣品的制備:將RNA加入到含有32μ I β-巰基乙醇的800 μ I的GTC中。
[0032](2)探針的退火:取250ρΜ濃度Oligo (dT)5 μL，加入蒸餾水至50 μ I ;加入1.6 ml 預(yù)熱的 dilution buffer (dilution buffer 中已加入 32 μ I β-疏基乙醇)，與RNA 混勻，70°C溫浴 5 min。
[0033](3)磁珠的活化-M 1.2ml的磁珠SA-PMPS (購(gòu)自Promega)于1.5 ml的離心管中；用0.5 X SSC重懸SA-PMPS，以磁架吸附磁珠，原體積0.5 X SSC洗滌SA-PMPS三次。
[0034](4) mRNA的獲取:將70°C溫育的RNA與SA-PMPS混合，室溫放置5 min后放在磁架上吸附磁珠，棄上清液；取2ml的0.5 X SSC懸浮磁珠，洗滌重復(fù)2次，最后一次盡量去除SSC ;加入無(wú)RNA酶的ddH20至磁珠中，輕輕混勻，然后離心(12000gX 3min)或磁架吸附磁珠；取上清，獲得mRNA，通過(guò)電泳和紫外測(cè)定mRNA的濃度和純度。
[0035](5)mRNA的沉淀:將`上步驟獲得的mRNA中加入糖原和2.5倍體積的無(wú)水乙醇，沉淀過(guò)夜，所得沉淀即為mRNA，mRNA將用于cDNA合成。
[0036]3、第一鏈 cDNA 合成
利用 SMART cDNA synthesis Kit (購(gòu)于 Takara)構(gòu)建 cDNA 文庫(kù)。首先以 3’ SMART ?CDS Primer II A - AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT^N—iN - 3’)為引物，以 mRNA 為模板合成第一鏈cDNA。
[0037](I)將 1000 ng mRNA 和 1μ I 3' SMARTer CDS Primer II A 引物(12 μ M)分別加入到0.5 ml PCR管中,用無(wú)RNase水補(bǔ)足溶液體積至4.5 μ I,混勻,簡(jiǎn)短離心十幾秒；
(2)放在PCR儀中孵育，72°C孵育3min，然后將溫度降至42°C孵育2 min ；
(3)按照以下順序混合得到混合試劑,其中SMARTerIIA Oligonucleotide的引物序列為 5’ - AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACXXXXX _ 3’:
2.0 μ I 5X First-Strand Buffer
0.25μ I DTT (IOOmM)
1.0 μ I SMARTer II A Oligonucleotide (12 μΜ )
0.25μ I RNase Inhibitor
1.0 μ I SMARTScribe Reverse Transcriptase (100 U) *
5.5 μ I Total Volume added per reaction
上述反轉(zhuǎn)錄酶需在使用混合試劑前加入，混合試劑應(yīng)放在微量離心機(jī)上短暫離心混合；
(4)在0.5ml PCR管中加入5.5 μ I上述混合試劑，上下吹打混勻后短暫離心，在PCR儀上42°C孵育90 min。[0038](5)在70°C加熱10 min后終止反應(yīng)，向其中加入40 μ I的TE緩沖液(ρΗ8.0的10 mM Tris, 0.1 mM EDTA)，至此得到第一鏈cDNA合成產(chǎn)物，并用于第二鏈cDNA的合成。
[0039]4、第二鏈 cDNA 合成
利用 SMART cDNA synthesis Kit (購(gòu)于 Takara),以 SMART II? A Oligonucleotide (5’ - AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACXXXXX _ 3’)為引物，以第一鏈為模板合成第二鏈。
[0040](I)以 30 μ I 第一鏈 cDNA 為模板，以 6 μ I 5’PCR 引物 SMART IItmAOligonucleotide (12 μ Μ)合成第二鏈cDNA。其PCR反應(yīng)體系如下:
30 μ I 第一鏈 cDNA 222 μ I 超純水
30 μ I IOXAdvantage 2 PCR 緩沖液 6 μ I 50 XdNTP 聚合物(10 mM)
6 μ I 5’PCR 引物 SMART II ? A Oligonucleotide (12 μ Μ)
6 μ I 50 X Advantage 2 酶聚合物 上述反應(yīng)體系應(yīng)放在微量離心機(jī)上短暫離心混合；
(2)PCR反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性Imin;95°C變性15 s，65°C復(fù)性30 s，68°C延伸3 min,共30個(gè)循環(huán)(通過(guò)優(yōu)化確定的PCR循環(huán)次數(shù))；
(3)用1.2%瓊脂糖凝膠、IXTAE緩沖液，取5 μ I PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，根據(jù)其結(jié)果來(lái)決定PCR產(chǎn)物質(zhì)量及純度；此時(shí)的PCR產(chǎn)物為雙鏈cDNA。
[0041]5、cDNA文庫(kù)的構(gòu)建:` 利用PMD19-T Vector試劑盒(購(gòu)于Takara)雙鏈cDNA與pMD19_T載體的連接和轉(zhuǎn)化。
[0042](I)在微量離心管中配制下列DNA溶液，體系為5 μ I ; pMD?19_T Simple Vector*I I μ I
cDNAI μ I
dH203 μ I
(2)加入5 μ I (等量)的 Solution I ;在 16°C 反應(yīng) 30 min ；
(3)全量(10μL)加入至100 μ I DH5 α感受態(tài)細(xì)胞中，冰中放置30 min ;
(4)42°C加熱45s后，再在冰中放置I min;
(5)加入890μ I SOC培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)60 min ;在含有X-Gal、IPTG、Amp的L-瓊脂平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，形成單菌落，計(jì)數(shù)白色、藍(lán)色菌落；
(6)挑選白色菌落，使用PCR法確認(rèn)載體中插入片段的長(zhǎng)度大小。
[0043]6、用PCR策略篩選cDNA文庫(kù)
使用PMD19-T載體的載體引物，正向引物:5’ - GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3 ’反向引物:5 ’ -CAGCACTGACCCTTTTGGGACCGC-3 ’，通過(guò)PCR確認(rèn)載體中插入片段的長(zhǎng)度大小，將PCR產(chǎn)物為300-600bp大小的克隆子進(jìn)行測(cè)序；測(cè)序獲得的序列經(jīng)過(guò)生物軟件0RF、SignalP4.0和NCBI (美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心)網(wǎng)頁(yè)進(jìn)行序列比對(duì)判斷其基因結(jié)構(gòu)和同源性。經(jīng)過(guò)同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn)了一種非洲黃爪蝎抗菌肽基因和已有報(bào)道的Meucin-18、BmKb2、BmKbl 和 BmKbl'等抗菌肽基因的同源性分別為 44.9%,30.8%,29.5%和29.5%，結(jié)果表明，該篩選得到的非洲黃爪蝎抗菌肽基因是一個(gè)新抗菌肽基因，核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:1所示。[0044]本實(shí)施例篩選得到的非洲黃爪蝎抗菌肽基因編碼的非洲黃爪蝎抗菌肽的氨基酸序列如序列表SEQ ID N0:2所示。圖1為非洲黃爪蝎抗菌肽基因及其編碼的抗菌肽的氨基酸序列示意圖，從圖1可以看出非洲黃爪蝎抗菌肽基因編碼的抗菌肽氨基酸由以下三部分組成:信號(hào)肽(22個(gè)殘基)，成熟肽(19個(gè)殘基)，以及前肽(35個(gè)殘基)，其中成熟肽序列為FffSffLMKAATKLLPSMLGS。
[0045]對(duì)上述非洲黃爪蝎抗菌肽的成熟肽通過(guò)NPSA server和HeliQuest軟件結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)該非洲黃爪蝎抗菌肽的成熟肽具有以下抗菌肽的結(jié)構(gòu)特征:a-螺旋并有疏水和親水面。
[0046]實(shí)施例2非洲黃爪蝎毒抗菌肽0s_116的人工合成
根據(jù)實(shí)施例1獲得的非洲黃爪蝎抗菌肽基因序列推導(dǎo)出非洲黃爪蝎抗菌肽的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)，去除其信號(hào)肽和前體肽，采用固相化學(xué)合成法，用自動(dòng)多肽合成儀合成非洲黃爪蝎抗菌肽成熟肽序列，然后通過(guò)HPLC反相C18柱層析脫鹽、純化得到合成多肽。所述合成多肽用高效液相色譜HPLC方法鑒定其純度，并采用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜測(cè)定其精確的分子量，并用自動(dòng)氨基酸測(cè)序儀測(cè)定氨基酸序列以進(jìn)行確證，最終得到了純度為91.34%，且與實(shí)施例1所述的非洲黃爪蝎抗菌肽(氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示)成熟肽的氨基酸序列一致、結(jié)構(gòu)特征一致的合成多肽，命名為非洲黃爪蝎毒抗菌肽0s_116 (其氨基酸序列見SEQ ID NO:3，結(jié)構(gòu)特征示意圖見圖2)。
[0047]實(shí)施例3非洲黃爪蝎毒抗菌肽0s_116的結(jié)構(gòu)同源抗菌肽的設(shè)計(jì)及其人工合成 非洲黃爪蝎毒抗菌肽0s_116的結(jié)構(gòu)同源抗菌肽的設(shè)計(jì):根據(jù)非洲黃爪蝎毒抗菌肽
0s_116的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)及其結(jié)構(gòu)特征，遵循以下原則設(shè)計(jì)突變體:1、在保持現(xiàn)有非洲黃爪蝎毒抗菌肽0s_l 16的α -螺旋結(jié)構(gòu)的前提下，盡量使突變后的抗菌肽兩親性更加明顯，即使得其疏水面更疏水、親水面親水性更強(qiáng)；2、增強(qiáng)親水面的靜電荷數(shù)量，提高其對(duì)磷脂膜的靜電吸引作用；3、去掉對(duì)形成α-螺旋結(jié)構(gòu)有破壞作用的氨基酸。采用點(diǎn)突變將非洲黃爪蝎毒抗菌肽0s_116氨基酸序列(SEQ ID NO:3)的第4位的色氨酸突變成賴氨酸，第9位的丙氨酸突變成異亮氨酸，得到氨基酸序列如序列表SEQ ID N0:4所示的突變體I ;將非洲黃爪蝎毒抗菌肽0s_116氨基酸序列(SEQ ID NO:3)的第19位的絲氨酸去掉后得到氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:5所示的突變體2。
[0048]本實(shí)施例中人工合成結(jié)構(gòu)同源抗菌肽(突變體I和突變體2)的方法同實(shí)施例2，得到的合成多肽用高效液相色譜HPLC方法鑒定其純度，并采用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜測(cè)定其精確的分子量，并用自動(dòng)氨基酸測(cè)序儀測(cè)定氨基酸序列以進(jìn)行確證，最終得到:(1)純度為91.34%，氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，結(jié)構(gòu)特征示意圖如圖3所示的合成多肽，命名為抗菌肽0s_116Ml ；(2)純度為94.67%，氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，結(jié)構(gòu)特征示意圖如圖4所示的合成多肽,命名為抗菌肽0s_116M2。
[0049]實(shí)施例3非洲黃爪蝎抗菌肽0s_116及其結(jié)構(gòu)同源抗菌肽的抑菌試驗(yàn)
實(shí)驗(yàn)對(duì)象包括以下細(xì)菌:革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，包括金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus (CCTCC:AB 94004),巨大芽孢桿 MBacillus magaterium (CCTCC:AB90008),藤黃微球菌 Micrococcus luteus (CCTCC:AB2010179),珊瑚諾卡氏菌 Nocardia coralIina(CCTCC:M92100)，蘇云金芽胞桿菌也thuringiensis (CCTCC:AB93100);革蘭氏陰性細(xì)菌，包括大腸桿菌瓦co/iDH5 α ,突光假單胞菌/!sewi/cwoftas fluorences (CCTCC:PF),惡臭假單胞菌putida (CCTCC:PP),陰溝腸桿菌cloacae (CCTCC:AB2010162),傷寒桿菌 5k/?o/?<977a enterica (CCTCC:AB2010185),綠胺桿菌/!sewt/cwoftasaeruginosa (CCTCC:AB93066)，產(chǎn)酸克雷伯式菌Z/eAsie77a oxytoca (CCTCC:AB2010143)。以上革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌和革蘭氏陰性細(xì)菌均購(gòu)于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。
[0050]多重耐藥菌:耐甲氧西林金黃色葡萄球菌MRSA菌株(5^、16436、16465、16558、16559、16585、16679、16731、16748 和 16760)和萬(wàn)古霉素耐藥腸球菌 VRE 菌株(E11、E128、E147、E156、E161、E179、S13和S15);實(shí)驗(yàn)使用的MRSA以及VRE所有菌株均從北京朝陽(yáng)醫(yī)院分離的。
[0051]對(duì)以上細(xì)菌采用96孔板培養(yǎng)法試驗(yàn):(I)分別將革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌、革蘭氏陰性細(xì)菌和多重耐藥菌菌株培養(yǎng)到0D_=0.4時(shí)，用新鮮培養(yǎng)基稀釋至0D_=0.002后取160 μ I加入到96孔板中，然后分別向各孔加入40 μ I經(jīng)等比稀釋的非洲黃爪蝎抗菌肽0s_116、0s_116Ml或0s_116M2，負(fù)對(duì)照只加菌，空白對(duì)照只有培養(yǎng)基；(2)37°C培養(yǎng)12小時(shí)后，用酶標(biāo)儀測(cè)96孔板中各孔的在600nm波長(zhǎng)處的吸光值；(3)確定非洲黃爪蝎抗菌肽0s_116、0s_116Ml和0s_116M2的10倍稀釋的最低抑制濃度之后將最低抑制濃度進(jìn)行2倍等比稀釋，重復(fù)本實(shí)驗(yàn)實(shí)例實(shí)驗(yàn)的前兩個(gè)步驟，最終確定非洲黃爪蝎毒抗菌肽0s_116、0s_116Ml和0s_116M2對(duì)細(xì)菌的最低抑制濃度。
[0052]非洲黃爪蝎毒抗菌肽0s_116、0s_116Ml和0s_116M2對(duì)革蘭氏細(xì)菌的MIC值見表I。表1結(jié)果表明:非洲黃爪蝎毒抗菌肽抗菌肽0s_116、0s_116Ml和0s_116M2對(duì)革蘭氏細(xì)菌有廣譜抗菌活性，尤其對(duì)藤黃微球菌(iffcrococciAs Iuteus)的抗菌效果好,可以應(yīng)用于制備治療或預(yù)防因藤黃微球菌而引起的疾病的藥物中，如應(yīng)用于制備治療或預(yù)防因藤黃微球菌而引起的腦膜炎、肺炎、敗血癥、膿毒性關(guān)節(jié)炎和腦膿腫等疾病的藥物中。
[0053]表1非洲黃爪蝎毒抗菌肽0s_116及其結(jié)構(gòu)同源抗菌肽對(duì)革蘭氏細(xì)菌的抑制效果
【權(quán)利要求】
1.一種非洲黃爪蝎抗菌肽基因，其特征在于，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:1所示。
2.權(quán)利要求1所述的非洲黃爪蝎抗菌肽基因編碼的非洲黃爪蝎抗菌肽，其特征在于，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示。
3.人工合成的非洲黃爪蝎抗菌肽Os_116，其特征在于，它的氨基酸序列如序列表SEQID NO:3 所示。
4.權(quán)利要求3所述的人工合成的非洲黃爪蝎抗菌肽Os_l16的結(jié)構(gòu)同源抗菌肽，其特征在于，氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:4和SEQ ID N0:5所不。
5.非洲黃爪蝎抗菌肽Os_l16及其結(jié)構(gòu)同源抗菌肽的人工合成方法，其特征在于:分別根據(jù)序列表SEQ ID N0:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，采用固相化學(xué)法合成多肽序列，并對(duì)合成的多肽進(jìn)行C端酰胺化，然后通過(guò)HPLC反相C18柱層析脫鹽、純化得到非洲黃爪蝎抗菌肽Os_116及其結(jié)構(gòu)同源抗菌肽。
6.非洲黃爪蝎抗菌肽Os_116及其結(jié)構(gòu)同源抗菌肽在制備治療或預(yù)防多重耐藥性病原菌和革蘭氏細(xì)菌的藥物中的應(yīng)用，所述非洲黃爪蝎抗菌肽Os_116及其結(jié)構(gòu)同源抗菌肽的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:3飛所示，所述多重耐藥性病原菌為耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和萬(wàn)古霉素耐藥 腸球菌。
【文檔編號(hào)】C07K7/08GK103865935SQ201410125303
【公開日】2014年6月18日 申請(qǐng)日期:2014年3月31日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月31日
【發(fā)明者】曾憲春, 聶堯, 張磊, 敖日格樂(lè) 申請(qǐng)人:中國(guó)地質(zhì)大學(xué)（武漢）