可辨認(rèn)感染性普立昂蛋白質(zhì)的單株抗體及其用途
【專利摘要】本發(fā)明是關(guān)于可用于特異性辨認(rèn)感染性普立昂蛋白(PrPSc)的單株抗體，本發(fā)明的單株抗體特征在于不需要經(jīng)過蛋白水解酶的反應(yīng)，就能夠直接特異性地辨認(rèn)PrPSc蛋白，可提供用來建立一種高特異性及高靈敏度的普立昂疾病檢測(cè)方法與套組。
【專利說明】可辨認(rèn)感染性普立昂蛋白質(zhì)的單株抗體及其用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明關(guān)于可專一性辨認(rèn)感染性普立昂蛋白質(zhì)(scrapie prion protein, PrPsc)的單株抗體，特別地，是關(guān)于可與普立昂蛋白質(zhì)C端以β褶版(Psheet)為主的片段結(jié)合的單株抗體，及其用于檢測(cè)普立昂疾病的用途。
【背景技術(shù)】
[0002]普立昂疾病(prion diseases)又稱作傳染性海綿體腦部病變(Transmissiblespongiform encephalopathies,以下簡(jiǎn)稱TSE),病理特征是在腦部會(huì)出現(xiàn)海綿狀空洞、神經(jīng)元細(xì)胞死亡、星狀細(xì)胞增生、組織染色出現(xiàn)淀粉斑塊(amyloid plaque);臨床特征通常在長(zhǎng)時(shí)間的潛伏下會(huì)出現(xiàn)漸進(jìn)式的行為、運(yùn)動(dòng)失調(diào)、癡呆等(Ludlam, C.A.，Lancet351:1289-1290，1998; Soto, C.，Nature reviews Microbiology2:809-819，2004)，雖與其他神經(jīng)性退化疾病如阿茲海默(Alzheimer disease)、帕金森氏癥(Parkinson disease)相似,但是獨(dú)特的地方在于其具有傳染性，會(huì)嚴(yán)重影響動(dòng)物如羊騷癢癥(Scrapie)、狂牛癥(bovinespongiform encephalopathy,以下簡(jiǎn)稱 BSE),以及人類如庫(kù)賈氏癥(Creutzfeldt-Jakobdisease, CJD)、Gerstmann-Straussler-Scheinker 氏癥(GSS)、致死性家族失眠癥(Fatalfamilial insomnia, FFI)等。人類的普立昂疾病的致病原因可分為遺傳性:GSS、FF1、fCJD ；后天獲得:Kuru、iCJD、vCJD ;未知:sCJD，動(dòng)物則是因?yàn)橛谐宰约和愂w的習(xí)慣，而有傳染性紹腦病變(Transmissible mink encephalopathy),及因牛誤食羊騷癢癥(Scrapie)的羊制成的肉骨粉，而產(chǎn)生的狂牛癥(BSE)。 [0003]在公元1986年，英國(guó)首次爆發(fā)從未出現(xiàn)過造成大量牛只死亡的疾病，即為后來所知的狂牛癥(Wells, G.A.，et al., The Veterinary recordl21:419-420，1987),接著幾年也開始在其他國(guó)家陸續(xù)出現(xiàn)案例，造成大規(guī)模流行。目前研究顯示，BSE的爆發(fā)可能是因?yàn)樵谧鳛榕ｏ暳咸砑拥娜夤欠壑?，含有大量的羊搔癢癥病原所致，這也暗示TSE似乎會(huì)跨越種別差異，而造成另一物種的疾病發(fā)生，人類的庫(kù)賈氏病在1920年代初期被發(fā)現(xiàn)，為一種相當(dāng)罕見的疾病，發(fā)生率約為每百萬人口 0.5~I名病例。此病的病理癥狀與狂牛癥類似。
[0004]過去幾年來各國(guó)已經(jīng)確信BSE是嚴(yán)重的問題，目前在病原的鑒定上，主要的檢體來源都是“死后”的腦部組織，僅可由嚴(yán)重感染的牛只腦部組織做成乳劑后，以人工接種感染小鼠來證實(shí)BSE的病原是可傳播感染的；但這類接種感染的方式卻最少須150幾天的感染期才能證實(shí)有無感染成立。而現(xiàn)今WHO及OIE所承認(rèn)的診斷方法，是以死后檢查臨床疫情、癥狀、顯微病理變化、免疫組織化學(xué)染色技術(shù)及西方免疫墨點(diǎn)轉(zhuǎn)潰法等，來作為普立昂疾病的診斷依據(jù)(Hardt, M., et al., Journal of comparative pathologyl22:43-53，2000;Ingrosso, L., et al., Trends in molecular medicine8, 273—280，2002)。以下將分別敘述現(xiàn)有常用的幾個(gè)TSE檢測(cè)方法:
[0005]1.西方免疫墨點(diǎn)轉(zhuǎn)潰法:原理是依據(jù)？沖&被蛋白酶K水解后會(huì)產(chǎn)生27~30kDa(PrPres)大小的訊號(hào)，將腦組織均質(zhì)液與蛋白酶K反應(yīng)后，接著利用單株抗體6H4(抗原決定位:DYEDRYYRE)偵測(cè)，此方法的好處是可以減少檢測(cè)上的錯(cuò)誤率，因?yàn)橄鄬?duì)于用酵素免疫分析法(ELISA)全長(zhǎng)PrPG部分沒被水解掉進(jìn)而干擾PrP27_30訊號(hào)的現(xiàn)象，此外也可以發(fā)現(xiàn)新的PrPse種(strain)。
[0006]2.CEA/BioRad檢測(cè):是將腦組織先經(jīng)過一連串去活性(denaturation)及濃縮步驟后，進(jìn)行利用兩種單株抗體三明治型的酵素免疫分析法。此方法較其他方法的偵測(cè)靈敏度高，可到0.5-2.0pmol，但是相對(duì)于其他方法，從純化到濃縮腦組織液需要耗費(fèi)相對(duì)多的時(shí)間及人力，也同樣有會(huì)受到未完全被水解掉的PrPe片段干擾的困擾。
[0007]3.結(jié)構(gòu)依據(jù)(conformation dependent)免疫分析:是利用抗體對(duì)于原始及變性后的PrP有不同的鍵結(jié)能力，而建立的三明治酵素免疫分析法?？贵w會(huì)辨認(rèn)只在PrPse變性后才出現(xiàn)的結(jié)構(gòu)依據(jù)抗原決定位(conformational epitope),特別是不用依賴蛋白水解酵素，故對(duì)于蛋白酶K敏感的PrPse株(strain)仍舊可以偵測(cè)的到，但缺點(diǎn)是相對(duì)于其他快速檢測(cè)方式，其需要較多的處理步驟。
[0008]上述方式都具有潛在性的問題，由于其偵測(cè)極限過高(目前具備最低偵測(cè)極限的檢測(cè)方法是CEA/Biorad檢測(cè))，而使許多牛只可能處于PrPse潛伏階段，還未出現(xiàn)任何臨床癥狀，以致所獲得的化學(xué)檢測(cè)結(jié)果呈現(xiàn)偽陰性(false negative)。另外，類似的情況也會(huì)發(fā)生在人類，目前對(duì)于“活著”的CJD患者的癥狀出現(xiàn)前(pre-symptom)檢測(cè)仍舊在發(fā)展中，所以同樣的問題在于，如果vCJD患者在未知的狀態(tài)下進(jìn)行手術(shù)、捐贈(zèng)器官、輸血等醫(yī)療行為，而鑒于PrPse耐高溫、不怕殺菌劑的特性，其一旦附著在手術(shù)器具上，便無法清除干凈，接著就會(huì)發(fā)生傳染造成醫(yī)源性(iatrogenic) CJD案例的發(fā)生。另外，根據(jù)PrPse的特性,檢體取得后通常需要經(jīng)過蛋白水解酶的處理，但是這樣的處理會(huì)使得原本存在少量的PrPse損失，逃過偵測(cè)極限而得到另外一種偽陰性的發(fā)生?？偨Y(jié)上述，目前仍需要發(fā)展一種于臨床癥狀發(fā)生前、活體狀態(tài)下，采取的檢體不需要經(jīng)過蛋白水解酶的處理，而能夠直接特異性地辨認(rèn)PrPsc,并且提升偵測(cè)極限的檢測(cè)方法。
[0009]發(fā)展專一結(jié)合PrPse結(jié)構(gòu)的抗體，是一直以來研究普立昂疾病的重點(diǎn)，而普立昂蛋白的特點(diǎn)在于，它并不像其他感染性物質(zhì)如病毒、細(xì)菌能夠引起強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，在PrP蛋白正常表達(dá)的動(dòng)物(Prnp+/+)于普立昂疾病發(fā)生的過程，因?yàn)檎細(xì)胞、T細(xì)胞表面即有廣泛分布的PrPe,而PrPse的初級(jí)結(jié)構(gòu)可能與PrPe相似，使得B細(xì)胞有免疫耐受性而沒有免疫反應(yīng)(Bueler, H., et al., Cell73, 1339-1347, 1993;Kascsak, R.J., et al., Journalof virology61:3688, 1987;Prusinerj S.B.,et al., The Journal of infectiousdiseases167:602-613，1993) 0
[0010]這幾年來嘗試不同策略，但仍舊無法發(fā)展出專一性高的辨認(rèn)PrPse抗體，最早在1997年，Korth的團(tuán)隊(duì)利用重組牛蛋白制造出15B3，該抗體雖然可以免疫沉淀牛、小鼠、人類的PrPse而非PrPG，但是在實(shí)際應(yīng)用上卻因?yàn)槠鋵?duì)于普立昂蛋白質(zhì)相對(duì)弱的結(jié)合能力，而使其無法實(shí)現(xiàn)于臨床診斷(Korth，C.，et al.，Nature390:74, 1999)。因此，開始修正采用全長(zhǎng)片段(不包含N端)的免疫原策略，制造β褶版為主的重組蛋白、增加酪胺酸(tyrosine)殘基，根據(jù)不同的物種酪胺酸-酪胺酸-精胺酸(tyrosine-tyrosine-arginine)重復(fù)序列設(shè)計(jì)合成勝肽片段(Paramithiotis, et al.2003),使用羊搔癢癥相關(guān)纖維絲(scrapie-associated fribril, SAF) (Morel, N., et al., The Journal of biologicalchemistry279:30143-30149, 2004)也生產(chǎn)出能夠辨認(rèn)PrPse的抗體，但之后的實(shí)驗(yàn)卻發(fā)現(xiàn)其仍舊能夠辨認(rèn)PrPG。截至目前，雖然生產(chǎn)出許多的抗PrP抗體能夠辨認(rèn)各種形式的PrP，但是對(duì)于純化原始狀態(tài)(native)PrPSc;的辨認(rèn)，僅只剩下微弱的訊號(hào)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]于是，本發(fā)明的一方面，是關(guān)于一種特異性辨認(rèn)感染性普立昂蛋白(PrPSc)的單株抗體，其特征在于與包含普立昂蛋白的胺基酸141-182(SEQ ID N0.1)的肽片段結(jié)合。
[0012]于本發(fā)明的一具體實(shí)施態(tài)樣，所述的單株抗體可辨識(shí)在結(jié)構(gòu)上以β褶版為主的普立昂蛋白。于本發(fā)明的一具體實(shí)施態(tài)樣，所述的普立昂蛋白形成β寡聚體。
[0013]于本發(fā)明的一些具體實(shí)施態(tài)樣，所述的單株抗體與包含普立昂蛋白的胺基酸141-152 (SEQ ID N0.2)的肽片段結(jié)合。于本發(fā)明的一些具體實(shí)施態(tài)樣，所述的單株抗體與包含普立昂蛋白的胺基酸171-182 (SEQ ID N0.3)的肽片段結(jié)合。
[0014]本發(fā)明的另一方面，是關(guān)于一種特異性偵測(cè)感染性普立昂蛋白(PrPse)的抗體的制造方法，其包含制備一種在結(jié)構(gòu)上以β褶版為主的重組型普立昂蛋白；將所得的重組型普立昂蛋白免疫小鼠產(chǎn)生抗體；及分離及純化出該抗體。所述的抗體包單株抗體及多株抗體。
[0015]于本發(fā)明的一具體實(shí)施態(tài)樣，所述的重組型普立昂蛋白在結(jié)構(gòu)上會(huì)自動(dòng)由α轉(zhuǎn)變成β褶版形式為主，且自動(dòng)聚合成β寡聚體。于本發(fā)明的另一具體實(shí)施態(tài)樣，所述的重組型普立昂蛋白包含Ser-132、Asn-181、Cysl79、Cys-214四個(gè)位點(diǎn)的突變。
[0016]本發(fā)明的又一方面，是關(guān)于一種特異性偵測(cè)感染性普立昂蛋白(PrPse)的診斷套組，其特征在于包含本 發(fā)明的單株抗體。
[0017]本發(fā)明的又另一方面，是關(guān)于一種普立昂疾病檢測(cè)方法，其包含取得腦部組織樣本；及利用本發(fā)明的單株抗體進(jìn)行免疫分析，偵測(cè)樣本中是否存在感染性普立昂蛋白(PrPscO。于本發(fā)明的一些具體實(shí)施態(tài)樣，所述的腦部組織樣本為腦組織均質(zhì)液。于本發(fā)明的其他具體實(shí)施態(tài)樣，所述的腦部組織樣本為腦部組織切片。
[0018]于本發(fā)明的一具體實(shí)施態(tài)樣，所述的感染性普立昂蛋白(PrPse)在結(jié)構(gòu)上以β褶版為主的普立昂蛋白。于本發(fā)明的另一具體實(shí)施態(tài)樣，所述的感染性普立昂蛋白形成β寡聚體。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1顯示利用ELISA分析(A)及西方墨點(diǎn)法(western blot)分析(B),確認(rèn)A2、A3、3B融合瘤細(xì)胞在HAT培養(yǎng)篩選下抗體的分泌情況。
[0020]圖2顯示抗-m β PrP單株抗體mAb_A2、A3及3B的抗體異構(gòu)型分析結(jié)果。
[0021]圖3顯示利用點(diǎn)轉(zhuǎn)潰(dot plot)方式比較單株抗體A.A2、B.A3、C.3B對(duì)于不同量的小鼠β PrP和重組牛PrP的辨認(rèn)差異。
[0022]圖4顯示以ELISA的方式比較Α2 (A)、A3 (B) R 3Β (C)對(duì)于小鼠β PrP及a PrP辨識(shí)的差異的結(jié)果。
[0023]圖5為用勝肽掃描(peptide scan)分析單株抗體抗體抗原決定位序列結(jié)果。其中A-C將93-230的小鼠PrP序列分成22段，并將這些勝肽片段覆蓋于96免疫酵素分析盤內(nèi)，進(jìn)行ELISA分析。D為藉由勝肽掃描所得到抗原決定位，相對(duì)抗體的示意圖。
[0024]圖6為以西方墨點(diǎn)轉(zhuǎn)潰法分析mAb_A2、A3、3B對(duì)正常小鼠腦組織均質(zhì)液及感染性小鼠腦組織均質(zhì)液的辨識(shí)。其中樣品包括，有(+)或無(-)經(jīng)過50 μ g/mL蛋白酶K處理的正常小鼠腦組織均質(zhì)液，NBH(lane3, 4，7，8，11，12，14，15)，及感染性PrPsc (10%22L)小鼠腦組織均質(zhì)液(lanel, 2，5，6，9，10 及 13)。
[0025] 圖7顯示利用實(shí)驗(yàn)室自制的三株可辨認(rèn)PrP的單株抗體_A2、A3、3B對(duì)已感染22LPrPse病變的小鼠腦部切片和正常小鼠健康的腦部切片(normal control)進(jìn)行免疫組織染色，所呈現(xiàn)的結(jié)果為小腦區(qū)域。免疫前(Pre-1mmune)組是利用BALB/c小鼠免疫前血清，在此作為陰性對(duì)照組(Negative control),左側(cè)標(biāo)示為所使用的抗體,包括免疫前、A2、3B、A3 ;下方標(biāo)示為顯微鏡放大倍率，前兩欄為感染性小鼠切片，第三欄是正常小鼠腦部切片。
【具體實(shí)施方式】
[0026]本發(fā)明的其他特色及優(yōu)點(diǎn)將于下列實(shí)施范例中被進(jìn)一步舉例與說明，而該實(shí)施范例僅作為輔助說明，并非用于限制本發(fā)明的范圍。
[0027]根據(jù)本發(fā)明所呈現(xiàn)的各種實(shí)施例，下述各種儀器、裝置、方法和其相關(guān)結(jié)果者，實(shí)施例中為了方便讀者閱讀所使用的標(biāo)題或副標(biāo)題，并不被限制在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
[0028]實(shí)施例1:單株抗體的制造及特性分析
[0029]單株抗體的制造
[0030]首先將小鼠普立昂蛋白的四個(gè)位點(diǎn)Ser-132、Asn-181、Cysl79、Cys-214作突變，得到重組小鼠普立昂蛋白，接著以電子順磁光譜(Electron paramagneticresonance, EPR)、旋光光譜儀(Circular dichroism)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),該重組的小鼠普立昂蛋白在低鹽pH=7室溫的狀態(tài)下，會(huì)自動(dòng)由α轉(zhuǎn)變成β褶版形式為主，且自動(dòng)聚合成β寡聚體。因此將所制得會(huì)自發(fā)性結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變的小鼠普立昂蛋白，即小鼠PPrP(被認(rèn)為結(jié)構(gòu)近似于PrP”，做為免疫小鼠的免疫原，制造出獨(dú)特的單株抗體。
[0031 ] 每只BALB/c小鼠以50 μ g的大腸桿菌生產(chǎn)的重組小鼠普立昂蛋白，結(jié)構(gòu)以β褶版為主(mouse PPrP，簡(jiǎn)稱πιβ PrP)加入IX PBS將體積帶大到250ul，并加入250ul完全Freund’s佐劑，在注射筒內(nèi)混合均勻，以腹腔注射的方式將抗原打入小鼠的體內(nèi)，接著2周后進(jìn)行追加注射，每只小鼠再以50 μ g的πιβ PrP加入IXPBS將體積帶大到250ul，并加入250ul不完全Freund’s佐劑(Incomplete Freund’s adjuvate)，在注射筒內(nèi)混合均勻，以腹腔注射的方式將抗原打入小鼠的體內(nèi)，之后每次追加注射后I周采集血液并分離血清進(jìn)行酵素免疫分析法，于第5次追加注射后，抽血后分離出血清進(jìn)行酵素免疫分析法，決定小鼠，準(zhǔn)備進(jìn)行細(xì)胞融合。
[0032]施打πιβ PrP重組蛋白過后，會(huì)促使脾臟內(nèi)的B細(xì)胞產(chǎn)生特定抗體，與癌化細(xì)胞融合行成可在體外培養(yǎng)且具特定抗體的細(xì)胞株，本實(shí)驗(yàn)利用抗原免疫的小鼠(BABL/c mice)的脾臟與骨髓瘤細(xì)胞株NS-1進(jìn)行融合。接著將細(xì)胞培養(yǎng)于HAT培養(yǎng)基(HAT growthmedium)，分裝到6個(gè)96孔培養(yǎng)盤中，靜置7~14天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況。以3種限制性稀釋(快速稀釋細(xì)胞法，慢速稀釋細(xì)胞法及細(xì)胞計(jì)數(shù)法)的方式，得到單一母細(xì)胞所產(chǎn)生的單株抗體，并以酵素免疫分析法及西方墨點(diǎn)法進(jìn)行特異性確認(rèn)。最后我們分別得到3株πιβ PrP單株抗體細(xì)胞，Α2、A3及3Β (圖1)。
[0033]接著將單株抗體細(xì)胞株殖入小鼠腹腔內(nèi)生長(zhǎng)，由腹水取得高濃度的單株抗體。由于單株抗體細(xì)胞培養(yǎng)液中的HAT培養(yǎng)基對(duì)于小鼠是具有毒性的，所以須將篩選出的單株抗體細(xì)胞更換成一般RPMI培養(yǎng)液，才能殖入小鼠體內(nèi)得到高濃度的單株抗體。之后進(jìn)行腹水中的單株抗體純化，將0.5ml蛋白G/A瓊脂糖(protein G plus protein A agarose)裝到管柱內(nèi)，以ImllXPBS清洗瓊脂糖，將IXPBS等量混合均勻的腹水共6ml加到管柱內(nèi)，重復(fù)流過管柱3~5次，加入5ml的IXPBS清洗瓊脂糖，再加入IOml0.5M NaOAC (pH=3)+0.01%迭氮化鈉(sodium azide)到管柱，純化出抗體，重復(fù)3-5次,加入2.5ml2M Tris base+0.01%迭氮化鈉到第一批純化抗體，平衡酸堿值；加入5mll0mM甘胺酸(pH=3)+0.01%迭氮化鈉到管柱，純化出抗體，重復(fù)3-5次，加入1.25ml2MTris base+0.01%迭氮化鈉到第二批純化出的抗體，平衡酸堿值。取出濃縮離心管，將二批抗體混合，使用濃縮管濃縮至Iml以下，濃度定量后，分裝每管100 μ g的量(用于嗜菌體呈現(xiàn)技術(shù))，其余存放在_20°C /_80°C。
[0034]抗-πιβ PrP單株抗體mAb_A2、A3、3B的異構(gòu)型鑒定
[0035]將2.5μ g/ml免疫球蛋白覆蓋在96孔免疫酵素分析盤內(nèi)，一抗用培養(yǎng)中的融合瘤細(xì)胞A2、A3、3B的培養(yǎng)上清液，二抗使用不同免疫球蛋白(結(jié)合HRP辨識(shí)重鏈的抗_IgA、IgM、IgGl、IgG2a、IgG2b及IgG3抗體；結(jié)合HRP辨識(shí)輕鏈的抗_ κ鏈及λ鏈抗體)，測(cè)讀490波長(zhǎng)，可測(cè)得單株抗體的免疫球蛋白的重鏈與輕鏈。結(jié)果顯示，本發(fā)明所制得的三株mi3PrP單株抗體Α2、Α3及3Β的免疫球蛋白，其重鏈為IgM，輕鏈為κ鏈(參見圖2)。
[0036]使用點(diǎn)轉(zhuǎn)潰(dot plot)方法比較單株抗體A2、A3與3B對(duì)于不同量的ηιβ PrP和重組牛PrP的辨認(rèn)差異 [0037]利用點(diǎn)轉(zhuǎn)潰(Dot blot)分析在原始的(native)結(jié)構(gòu)狀態(tài)下，相同物種的PrP蛋白會(huì)以不同的立體結(jié)構(gòu)存在型式，ma PrP是以單體(monomer)存在，mβ PrP則以寡聚合體(oligomer)存在。將 5 μ g、I μ g、0.5 μ g、及 0.I μ g 的 ηιβ PrP 及 m a PrP 點(diǎn)在 PVDF 轉(zhuǎn)潰膜上，接著加入5%牛奶阻斷(blocking),使用不同倍率稀釋的mAb A2、A3、3B單株抗體反應(yīng)為一級(jí)抗體，以小鼠免疫前的血清作為負(fù)對(duì)照組，進(jìn)行反應(yīng)。結(jié)果參見圖3。
[0038]由圖3A顯示,A2單株抗體在10 μ g/ml到50 μ g/ml濃度之間對(duì)于ηιβ PrP辨認(rèn)的極限較好，能夠偵測(cè)到0.1 μ g的蛋白，但是對(duì)于5m a PrP只偵測(cè)能到Iyg ;濃度I μ g/ml下的A2單株抗體對(duì)于10 μ g m a PrP有微弱的訊號(hào)，相對(duì)在πιβ PrP則沒有。圖3Β顯示，A3單株抗體在10 μ g/ml到50 μ g/ml濃度之間對(duì)于mβ PrP的辨識(shí)訊號(hào)較對(duì)于m a PrP好,尤以星號(hào)標(biāo)示處更為顯著，但在抗體濃度I μ g/ml下，其對(duì)于該二蛋白的辨識(shí)度就無差異。圖3C則顯示，單株抗體3B在濃度I μ g/ml到20 μ g/ml濃度之間對(duì)于5 μ g ηιβ PrP的辨認(rèn)情形較對(duì)于m a PrP的優(yōu),且3B單株抗體在濃度50 μ g/ml下,對(duì)于0.1 μ g ηιβ PrP的辨認(rèn)情形比ma PrP好，其他則沒有太大的差異。綜合上述，mAb A2、A3、3B三個(gè)單株抗體對(duì)于ma PrP或mPPrP皆能夠辨認(rèn),而該等單株抗體在10 μ g/ml到50 μ g/ml之濃度間,對(duì)于mPPrP的偵測(cè)極限較對(duì)于m a PrP的好。
[0039]ELISA分析抗-PrP單株抗體A2、A3、3B對(duì)于m β PrP及a PrP辨識(shí)的差異
[0040]亦進(jìn)行ELISA分析，將各單株抗體對(duì)于不同蛋白的辨認(rèn)情形以數(shù)值方式呈現(xiàn)。將200ng/well的小鼠β PrP、a PrP蛋白各自覆蓋于免疫酵素分析盤的孔內(nèi)，接著加入經(jīng)不同倍率稀釋的mAbs A2、A3、3B單株抗體為第一抗體，二抗為抗-小鼠IgM(l:4000)，進(jìn)行反應(yīng)，接著以O(shè)PD成色。結(jié)果顯示，單株抗體A2、A3及3B在I μ g/ml到200 μ g/ml濃度之間，對(duì)于πιβ PrP的辨認(rèn)較對(duì)于ma PrP的辨視能力好(參見圖4)。在重組蛋白辨識(shí)的結(jié)果統(tǒng)合包括圖1結(jié)果，可以知道在蛋白質(zhì)存在自然(native)型式下，本發(fā)明的單株抗體可以辨認(rèn)另外一個(gè)物種(牛)來源的PrP，并且對(duì)于單體及寡聚合體有不同的親和性。
[0041]實(shí)施例2:單株抗體的抗原決定位序列分析
[0042]勝肽掃描(peptidescan)分析
[0043]將93-230的mPrP序列分成22段，每段12個(gè)胺基酸組成，各有6個(gè)胺基酸重復(fù)，將這些勝肽片段覆蓋于96免疫酵素分析盤內(nèi)，進(jìn)行ELISA分析，一抗使用純化過的A2、A3、3B單株抗體，并利用抗-小鼠IgM結(jié)合HRP的多株抗體做為二次抗體。
[0044]利用勝肽掃描結(jié)果如圖5，發(fā)現(xiàn)單株抗體A3的勝肽抗原決定位在141-152GNDWEDRYYREN (SEQ ID N0.2)，而單株抗體A2與3B的抗原決定位則是位在同一位置，171-182QNNFVHDAVCIT(SEQ ID N0.3)。
[0045]嗜菌體呈現(xiàn)技術(shù)
[0046]隨機(jī)挑選經(jīng)過四次篩選的嗜菌體群落并且抽取其DNA送定序整理結(jié)果如下，序列后的括號(hào)代表(出現(xiàn)次數(shù)/所挑選的全部序列數(shù)量)，粗體字代表交叉比對(duì)都有出現(xiàn)的序列，統(tǒng)整可能的序列于每個(gè)表格最下面一列，底線代表比對(duì)回去有的序列。
[0047]抗體:mAb-A2
[0048]
【權(quán)利要求】
1.一種特異性辨認(rèn)感染性普立昂蛋白(PrPse)的單株抗體，其特征在于與具有普立昂蛋白的胺基酸141-182 (SEQ ID N0.1)的肽片段結(jié)合。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單株抗體，其特征在于，該單株抗體可辨識(shí)在結(jié)構(gòu)上以β褶版為主的普立昂蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的單株抗體，其特征在于，該單株抗體可辨識(shí)形成β寡聚體的普立昂蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單株抗體，其特征在于，該單株抗體的抗原決定位位于普立昂蛋白的胺基酸141-152 (SEQ ID N0.2)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單株抗體，其特征在于，該單株抗體的抗原決定位位于普立昂蛋白的胺基酸171-182 (SEQ ID N0.3)。
6.一種特異性偵測(cè)感染性普立昂蛋白(PrPse)的抗體的制造方法，其特征在于，包含: (a)制備一種在結(jié)構(gòu)上以β褶版為主的重組型普立昂蛋白； (b)將所得的重組型普立昂蛋白免疫小鼠產(chǎn)生抗體；及 (C)分離及純化出該抗體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制造方法，其特征在于，該抗體包括單株抗體及多株抗體。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制造方法，其特征在于，該重組型普立昂蛋白在結(jié)構(gòu)上會(huì)自動(dòng)由α轉(zhuǎn)變成β褶版形式為主，且自動(dòng)聚合成β寡聚體。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制造方法，其特征在于，該重組型普立昂蛋白包含Ser-132、Asn-181、Cysl79、Cys-214 四個(gè)位點(diǎn)的突變。
10.一種特異性偵測(cè)感染性普立昂蛋白(PrPse)的診斷套組，其特征在于包含根據(jù)權(quán)利要求I所述的單株抗體。
11.一種普立昂疾病檢測(cè)方法，其特征在于，包含: (a)取得腦部組織樣本；及 (b)利用如權(quán)利要求1所述所述的單株抗體進(jìn)行免疫分析，偵測(cè)樣本中是否存在感染性普立昂蛋白(PrPsc)。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的普立昂疾病檢測(cè)方法，其特征在于，該腦部組織樣本為腦組織均質(zhì)液。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的普立昂疾病檢測(cè)方法，其特征在于，該免疫分析為西方墨點(diǎn)轉(zhuǎn)潰法。
14.根據(jù)權(quán)利要求11所述的普立昂疾病檢測(cè)方法，其特征在于，該腦部組織樣本為腦部組織切片。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的普立昂疾病檢測(cè)方法，其特征在于，該免疫分析為免疫組織染色。
16.根據(jù)權(quán)利要求11所述的普立昂疾病檢測(cè)方法，其特征在于，該感染性普立昂蛋白(PrPsc)在結(jié)構(gòu)上以β褶版為主的普立昂蛋白。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的普立昂疾病檢測(cè)方法，其特征在于，該感染性普立昂蛋白形成β寡聚體。
【文檔編號(hào)】C07K16/18GK103897056SQ201310662163
【公開日】2014年7月2日 申請(qǐng)日期:2013年12月9日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月25日
【發(fā)明者】陳宜民, 黃思惟, 林盈妤 申請(qǐng)人:法瑪科技顧問股份有限公司