一種分離純化11α-羥基坎利酮的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種使用大孔樹脂分離純化11α-羥基坎利酮的方法，包括菌絲體分離、烘干粉碎、加熱醇提取、大孔樹脂柱吸附分離純化、加壓連續(xù)層析、濃縮烘干。工藝流程簡(jiǎn)單，成本低，效益高，層析柱可以活化再生，適合工業(yè)化分離純化11α-羥基坎利酮。使用甲醇溶液加熱提取，可使11α-羥基坎利酮提取率較高。采用AB-8大孔樹脂，可在高壓恒流泵驅(qū)動(dòng)下連續(xù)層析，最終獲得較純的11α-羥基坎利酮。
【專利說(shuō)明】—種分離純化11α-羥基坎利酮的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明專利涉及使用大孔樹脂分離純化Ila-羥基坎利酮的方法，屬于微生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的提取分離純化領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]Ila-羥基坎利酮是坎利酮羥基化反應(yīng)后形成的留體類衍生物，也是合成依普利酮的重要藥物中間體。依普利酮作為治療高血壓和其他心血管疾病的新型藥物，具備廣闊的市場(chǎng)前景。微生物轉(zhuǎn)化坎利酮合成Ila-羥基坎利酮的方法具有專一性強(qiáng)、反應(yīng)條件溫和、催化效率高、副產(chǎn)物少、成本低、污染少等優(yōu)點(diǎn)。
[0003]由于11 a -羥基坎利酮在水中的溶解度極低，由微生物發(fā)酵合成的Ila-羥基坎利酮主要吸附在菌絲體表面，很難依靠過(guò)濾、離心或萃取單純的物理方法分離。同時(shí)，發(fā)酵液中還存在未轉(zhuǎn)化的坎利酮，而坎利酮的物理、化學(xué)性質(zhì)與11 a -羥基坎利酮類似，故對(duì)提取物的純化也是一個(gè)重要步驟。
[0004]國(guó)內(nèi)目前對(duì)微生物發(fā)酵合成11 a-羥基坎利酮及其分離純化有部分研究和報(bào)道，發(fā)酵合成Ila-羥基坎利酮所用的微生物主要是赭曲霉、根霉等，對(duì)發(fā)酵完成后產(chǎn)物Ila-羥基坎利酮提取方法主要是有機(jī)溶劑萃取，純化方法主要是多次結(jié)晶法。例如專利(CN 101845474A)用經(jīng)過(guò)波長(zhǎng)為200nm_280nm紫外線照射10-30小時(shí)的赭曲霉，作為發(fā)酵合成11 a -羥基坎利酮的微生物，發(fā)酵完成后經(jīng)過(guò)離心機(jī)菌液分離，獲得的菌絲體加入2.5%的二氯甲烷萃取3-4次，棄菌絲體殘?jiān)?，蒸餾回收溶劑二氯甲烷后，加入0.5%甲苯，冷卻結(jié)晶精制，得到11 a-羥基坎利酮;專利(CN 1727494A)和專利(CN 103255192A)分別用赭曲霉(AS 3.4411)和赭曲霉(TCCC41060)進(jìn)行發(fā)酵合成了 11 a -羥基坎利酮，但均未提及產(chǎn)物11 a -羥基坎利酮的提取純化方法；2005年茅燕勇利用赭曲霉(NG0216)、葡枝根霉(NG0305)和粉紅單端孢霉(NG0207)均進(jìn)行發(fā)酵合成了 11 a -羥基坎利酮，其用冷凝回流法對(duì)產(chǎn)物11 a-羥基坎利酮進(jìn)行了提取，用三次重結(jié)晶法對(duì)提取的Ila-羥基坎利酮進(jìn)行了純化；2012年崔鳳杰等對(duì)利用根霉0%辦0/7心sp.UJS-0602)發(fā)酵合成的Ila-羥基坎利酮進(jìn)行分離提取，證明洗脫法和浸泡法對(duì)Ila-羥基坎利酮具有較好的分離效果。
[0005]目前提取發(fā)酵合成的Ila-羥基坎利酮的方法是將轉(zhuǎn)化后的發(fā)酵液過(guò)濾，上清液通過(guò)有機(jī)溶劑萃取，過(guò)濾出的菌體通過(guò)用有機(jī)溶劑加熱攪拌提取、浸泡、洗脫或勻漿，然后將有機(jī)溶劑合并后，真空濃縮并多次重結(jié)晶。這需要大量有毒有機(jī)溶劑，且在提取后的11 a -羥基坎利酮的純化步驟繁瑣。因此，尋找一種簡(jiǎn)便、提取效率高的提取方法，對(duì)轉(zhuǎn)化后的發(fā)酵液中的11 a -羥基坎利酮的提取純化就顯得極為重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明涉及一種使用大孔樹脂分離純化11 a -羥基坎利酮的工藝，包括菌絲體的抽濾或離心、烘干粉碎、加熱浸提、加壓高效大孔樹脂分離、重結(jié)晶等。
[0007]—種使用大孔樹脂分離純化11 a-羥基坎利酮的方法，其方法具體包括以下步驟:
(I)將根霉0%辦0/7心sp.UJS-0602，CICC3143，購(gòu)于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心)或赭曲霉(Aspergillus ocAraceiAs，CICC40239,購(gòu)于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心)轉(zhuǎn)化坎利酮制得的含有Ila-羥基坎利酮的發(fā)酵液進(jìn)行1000-6000 r/min離心10-30分鐘或抽濾后，取菌絲體或菌體40-10(TC烘干，粉碎至50-200目。
[0008](2)提取:將粉碎過(guò)的菌絲體或菌體用1-8倍體積的濃度為20-90%去離子水稀釋的甲醇水溶液，于35-60°C浸泡0.5-5小時(shí)后，1000-3000r/min離心10-30分鐘或過(guò)濾后，用0.5-5倍體積的濃度為20-90%甲醇水溶液洗滌濾渣，過(guò)濾，合并濾液。
[0009](3)分離:濾液上AB-8大孔樹脂柱，單柱上樣，雙柱洗脫。第一根上至飽和，第二根上至10-80%飽和。然后將兩根樹脂柱按照第一根在上，第二根在下的方式串聯(lián)，開始洗脫。先用20-60%的甲醇水溶液洗脫2-10BV ;然后再用60-90%的甲醇水溶液洗脫2-10BV。
[0010](4)將含Ila-羥基坎利酮的洗脫流分合并，在40-60°C下減壓濃縮后，在40_90°C下烘干，得到提純的11 α -羥基坎利酮。
[0011](5)將柱子用1-5倍乙酸乙酯洗脫ΑΒ-8大孔樹脂柱再生，然后用蒸餾水洗至無(wú)乙酸乙酯味即可重復(fù)使用。
[0012]本方法中，11 α -羥基坎利酮用高效液相色譜(HPLC)檢測(cè)條件，色譜柱:AgilentZORBAX Eclipse XDB-C18 (150 mmX4.6 mm，5 μ m);測(cè)定條件:甲醇-水為流動(dòng)相,梯度洗脫40 min ;流速:0.8 mL/min ;檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm ;柱溫:30°C ;進(jìn)樣量:5 μ L。采用外標(biāo)法計(jì)算公式計(jì)算坎利酮和11- α -羥基坎利酮。轉(zhuǎn)化率計(jì)算方法:
【權(quán)利要求】
1.一種分離純化11 α -羥基坎利酮的方法，其特征在于，按照以下步驟進(jìn)行: (1)將根霉{Rhiζopussp.UJS-0602)或赫曲霉{Aspergillus ochraceus)轉(zhuǎn)化坎利酮制得的含有11 α -羥基坎利酮的發(fā)酵液進(jìn)行1000-6000 r/min離心10-30分鐘或抽濾后，取菌絲體或菌體40-100°C烘干，粉碎至50-200目； (2)提取:將粉碎過(guò)的菌絲體或菌體用1-8倍體積的濃度為20-90%去離子水稀釋的甲醇水溶液，于35-60°C浸泡0.5-5小時(shí)后，1000-3000r/min離心10-30分鐘或過(guò)濾后，用`0.5-5倍體積的濃度為20-90%甲醇水溶液洗滌濾渣，過(guò)濾，合并濾液； (3)分離:濾液上AB-8大孔樹脂柱，單柱上樣，雙柱洗脫；第一根上至飽和，第二根上至10-80%飽和；然后將兩根樹脂柱按照第一根在上，第二根在下的方式串聯(lián)，開始洗脫；先用20-60%的甲醇水溶液洗脫2-10BV ;然后再用60-90%的甲醇水溶液洗脫2-10BV ； (4)將含11α -羥基坎利酮的洗脫流分合并，在40-60°C下減壓濃縮后，在40-90°C下烘干，得到提純的Ila-羥基坎利酮； (5)將柱子用1-5倍乙酸乙酯洗脫AB-8大孔樹脂柱再生，然后用蒸餾水洗至無(wú)乙酸乙酯味即可重復(fù)使用。`
【文檔編號(hào)】C07J21/00GK103665083SQ201310626460
【公開日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2013年12月2日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月2日
【發(fā)明者】管國(guó)強(qiáng), 黃達(dá)明, 孫文敬, 崔鳳杰, 崔鵬景, 錢靜亞 申請(qǐng)人:江蘇大學(xué)