一種檢測單糖的方法及衍生試劑的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于醫(yī)藥領域，涉及一種單糖的檢測方法及衍生試劑的制備方法，包括如下步驟：(1)用衍生試劑對單糖進行衍生；(2)將衍生產(chǎn)物進行液相色譜質譜聯(lián)用(LC-MS)分析；衍生試劑包括1-萘-3-氘代甲基-5-吡唑啉酮(D3NMP)和1-萘-3-甲基-5-吡唑啉酮(NMP)。該檢測方法對微量樣品既可以定性又可以定量，檢測靈敏度高，操作簡便，可同時對兩種未知樣品進行相對定量，質譜圖信噪比低，分離所需流動相極性小，大大延長了柱子的使用壽命。本發(fā)明方法比傳統(tǒng)1-苯基-3-甲基-5吡唑啉酮(PMP)衍生法的靈敏度高4-5倍，比傳統(tǒng)NMP衍生法更好地分離單糖，不會出現(xiàn)單糖色譜峰重疊的現(xiàn)象。
【專利說明】一種檢測單糖的方法及衍生試劑的制備方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)藥領域，涉及一種檢測單糖的方法及衍生試劑的制備方法。
【背景技術】
[0002]目前，多糖領域中面臨很多挑戰(zhàn)。多糖的研究不僅僅限于對大量樣品的分析，對于生物來源的樣品研究也越來越多。由于生物來源(如血液、細胞、組織)的樣品多糖量少，單糖極性較強，結構相近，且缺乏光學活性，采用常規(guī)方法對其分離鑒定較為困難。糖在紫外區(qū)無吸收，傳統(tǒng)的示差折光檢測法的靈敏度低且不利于梯度洗脫。為了改善其分離選擇性和提高檢測靈敏度，人們常采用衍生化處理，將糖類組分轉變?yōu)閹Оl(fā)色基團的分子，然后進行紫外或熒光檢測。
[0003]液相色譜質譜聯(lián)用(LC-MS)是一種很好的檢測方法。它以液相色譜作為分離系統(tǒng)，質譜為檢測系統(tǒng)。樣品由流動相分離，被離子化后，經(jīng)質譜的質量分析器將離子碎片按質量數(shù)分開，經(jīng)檢測器得到質譜圖。液質聯(lián)用體現(xiàn)了色譜和質譜的優(yōu)勢互補，將色譜對復雜樣品的高分離能力，與質譜具有高選擇性、高靈敏度及能夠提供相對分子質量與結構信息的優(yōu)點結合起來，在藥物分析、食品分析和環(huán)境分析等許多領域得到了廣泛的應用。
[0004]糖類物質的衍生反應多基于還原氨化法，不僅過程繁瑣、反應時間長，而且可導致不穩(wěn)定基團如唾液酸殘基的解離，給測定結果帶來偏差。1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)，常被用于衍生單糖，結合高效液相色譜法分析，具有反應條件較溫和，產(chǎn)物無立體異構等優(yōu)點。1-萘-3-甲基-5-吡唑啉酮(NMP)也是常用的衍生試劑，如孫志偉等用NMP衍生測定油菜花粉多糖中單糖的組成(孫志偉，劉凌君，戶寶軍，等.1-(2-萘基)-3-甲基-5-批唑啉酮衍生試劑的制備及其在高效液相色譜-質譜法測定糖類化合物中的應用[J].色譜，2008(02):200-205)，其反應機理與PMP相同，都可以與單糖反應生成具有紫外吸收的糖-雙衍生試劑產(chǎn)物，但是以上兩種衍生試劑都存在檢測限高，樣品消耗量大，用質譜檢測只能對樣品定性，不能定量等缺點。用普通衍生試劑衍生結合LC-MS對單糖定量，需要做一系列的標準曲線，不僅步驟繁瑣，而且對珍貴的生物樣品來說也是一種浪費，同時單糖的分離結果并不理想。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對以上現(xiàn)有技術存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種定性定量檢測單糖的方法。
[0006]實現(xiàn)上述發(fā)明目的的技術方法是:
[0007]1.一種檢測單糖的方法，具體包括如下步驟:
[0008](I)用衍生試劑對單糖進行衍生；
[0009](2)將衍生產(chǎn)物進行液相色譜質譜聯(lián)用(LC-MS)分析；
[0010]所述的衍生試劑包括1-萘-3-氘代甲基-5-吡唑啉酮(D3NMP)和1-萘_3_甲基-5-吡唑啉酮(NMP)；[0011 ] 所述的衍生試劑D3NMP單獨使用或與NMP聯(lián)用。
[0012]2.一種檢測單糖的方法，其特征在于，所述的單糖為動物、植物和微生物來源的多糖及寡糖的基本組成單元。
[0013]3.D3NMP的制備方法包括如下步驟:
[0014](I)稱取萘肼鹽酸鹽，置于水中，加熱至100°C，使其完全溶解，用20% NaOH溶液調(diào)節(jié)PH至8-9，抽濾后得到固體，用水洗滌直至PH為7，抽濾后真空干燥，得萘肼；
[0015](2)將萘肼加入無水乙醇中，于55°C水浴條件下攪拌至其溶解，滴加氘代乙酰乙酸乙酯，滴加完畢后反應2h,然后升溫至80°C回流7h,將反應液減壓濃縮至原體積的I /3，用甲醇將其重結晶3次，得D3NMP ；
[0016]其中萘肼與氘代乙酰乙酸乙酯的物質量之比為1.2:1。
[0017]反應方程式如下:
[0018]
【權利要求】
1.一種檢測單糖的方法，包括如下步驟: (1)用衍生試劑對單糖進行衍生； (2)將衍生產(chǎn)物進行液相色譜質譜聯(lián)用(LC-MS)分析； 其特征在于，所述的衍生試劑包括1-萘-3-氘代甲基-5-吡唑啉酮(D3NMP)和1-萘-3-甲基-5-吡唑啉酮(NMP)； 所述的衍生試劑D3NMP單獨使用或與NMP聯(lián)用。
2.如權利要求1所述的一種檢測單糖的方法，其特征在于，所述的單糖為動物、植物和微生物來源的多糖及寡糖的基本組成單元。
3.制備權利要求1或2任意一項所述的D3NMP的方法，其特征在于包括如下步驟: (1)稱取萘肼鹽酸鹽，置于水中，加熱至100°c，使其完全溶解，用20%NaOH溶液調(diào)節(jié)PH至8-9，抽濾后得到固體，用水洗滌直至PH為7，抽濾后真空干燥，得萘肼； (2)將萘肼加入無水乙醇中，于55°C水浴條件下攪拌至其溶解，滴加氘代乙酰乙酸乙酯，滴加完畢后反應2h，然后升溫至80°C回流7h，將反應液減壓濃縮至原體積的I / 3，用甲醇將其重結晶3次，得D3NMP ； 所述的萘肼與氘代乙酰乙酸乙酯的物質量之比為1.2: I。
【文檔編號】C07D231/22GK103575827SQ201310561748
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2013年11月9日 優(yōu)先權日:2013年11月9日
【發(fā)明者】張麗娟, 韓章潤, 曾洋洋, 蘭瑩, 邱培菊 申請人:中國海洋大學