明膠樣單元的用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及明膠樣單元的用途，提供了一類新型重組融合蛋白，其基本結(jié)構(gòu)為｛GLK｝p-R-｛GLK｝q，其中R是有生物學(xué)功能的蛋白或多肽，GLK為重組明膠樣蛋白(gelatin-like?protein，GLK)，具有(Gly-X-Y)n明膠結(jié)構(gòu)特征的蛋白序列。與未融合有GLK片段的原始蛋白/多肽相比較，這類重組明膠樣融合蛋白具有更高的親水性，在體內(nèi)具有更長的半衰期。本發(fā)明也包括編碼該融合蛋白的核苷酸序列，含核苷酸序列的表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化有該類載體的宿主細(xì)胞以及制備本發(fā)明所涉及的融合蛋白的方法。此外，還包含含有該類融合蛋白的藥用組合物以及用于治療、預(yù)防或緩解疾病的方法。
【專利說明】明膠樣單元的用途
[0001]本發(fā)明是申請?zhí)枮?00980103870.9的發(fā)明專利申請的分案申請。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)領(lǐng)域，更具體地，涉及一類新型的、具有生物活性和更長半衰期的重組融合蛋白及其制備和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0003]由于腎臟和肝臟以及降解等多種因素的作用，大部分臨床應(yīng)用的生物活性多肽/蛋白在體內(nèi)經(jīng)?？焖俚谋磺宄?，一般半衰期只有幾分鐘到幾個小時。在治療過程中，需要很大的量以及頻繁的注射來獲得保持有效的藥物濃度，不僅給病人帶來痛苦，而且因為血藥濃度波動帶來療效下降，毒副作用增加。
[0004]目前已經(jīng)有多種方法報道可以延長這些生物活性多肽/蛋白在體內(nèi)的半衰期。如利用水溶性高分子聚合物(例如:聚乙二醇，葡聚糖等)來修飾生物活性多肽/蛋白，并已經(jīng)成功應(yīng)用，如PEG-ADA，PEG-1FNa等。修飾后可以提高體內(nèi)半衰期，增加穩(wěn)定性和溶解度，降低免疫原性等。但是不幸的是這些修飾方法仍然存在很多問題。首先，化學(xué)修飾蛋白質(zhì)/多肽后一般均會使這些生物大分子的活性顯著下降甚至完全消失(VeroneseFM, Biomaterials, 22:405-417, 2001)。其次，高分子化合物都是與蛋白質(zhì)/多肽表面的氨基、巰基、咪唑基等基團(tuán)反應(yīng)，以共價鍵形式連接到蛋白質(zhì)/多肽分子上。但是，由于蛋白質(zhì)/多肽分子量巨大，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，因此其潛在的可與活性PEG反應(yīng)的基團(tuán)也是數(shù)目眾多。在不同的位點結(jié)合PEG，其產(chǎn)物的穩(wěn)定性，生物學(xué)活性等性質(zhì)都是不同的。更甚者，大部分化學(xué)合成的高聚物，如PEG等不能被生物體降解。例如，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)當(dāng)長期大劑量注射 PEG-干擾素(PEG-1FNa 2a)后會在腎臟中積累(Conover CD et al., ArtificialOrgans., 21:369-378, 1997 ；Bendele A et al., Toxicol Sc1.，42:152-157，1998)。從藥物設(shè)計角度而言，沒有這些積累的藥物顯然是更為安全的。另一方面，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)PEG修飾的蛋白能產(chǎn)生一種PEG抗體(被定義為多效半抗原)，從而影響藥物的半衰期(CalicetiP&Veronese FM, Adv Drug Deliv Rev.，55:1261-1277，2003)。
[0005]正是因為這些技術(shù)問題，雖然通過化學(xué)修飾的方法來改善蛋白質(zhì)/多肽體內(nèi)藥代特性的技術(shù)已經(jīng)面世很久，但是真正能在臨床中應(yīng)用的產(chǎn)品極少。
[0006]也有通過與一些特定的載體蛋白融合來增加生物活性多肽/蛋白的體外穩(wěn)定性或體內(nèi)半衰期的方法。如通過與白蛋白，抗體Fc片段，轉(zhuǎn)鐵蛋白(轉(zhuǎn)鐵蛋白突變體及其片段)融合來延長生物活性多肽/蛋白的半衰期，如美國專利5，876，969和5，766，88及7，176，278所述。之所以與這些蛋白質(zhì)融合后能延長半衰期，主要是這些蛋白質(zhì)都可以通過FcRn受體介導(dǎo)的循環(huán)作用，來提高其自身在體內(nèi)的穩(wěn)定性從而延長半衰期。理想的作為融合蛋白載體的蛋白質(zhì)應(yīng)該具備如下特征:1.自身在體內(nèi)具有較長的半衰期；2.不具有免疫原性；3.不具有任何與延長半衰期無關(guān)的生物學(xué)效應(yīng)；4.不影響治療蛋白的生物學(xué)活性。但是，目前已經(jīng)公開的技術(shù)方案都無法全部滿足以上要求。其存在的首要問題是免疫原性的增加，如Fc片段結(jié)構(gòu)本身并不保守，具有多種序列結(jié)構(gòu)，很容易產(chǎn)生免疫原性。另外，這些載體蛋白本身通常具有一些生物學(xué)效應(yīng)，如抗體片段Fc具有結(jié)合補(bǔ)體，與Fc受體結(jié)合后導(dǎo)致的變態(tài)反應(yīng)，調(diào)理吞噬，抗體依賴的細(xì)胞殺傷作用等廣泛的生理功能；HSA本身具有許多正常的體內(nèi)生理功能，參與許多物質(zhì)的運(yùn)輸和代謝。這些生物學(xué)特性的存在，對于作為融合蛋白載體來說都是不利的。而且，這些載體蛋白質(zhì)本身具有復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)，與活性蛋白融合后都會因為空間位阻效應(yīng)而使活性蛋白生物學(xué)活性顯著下降(Baggio LL et al.，Diabetes.，53:2492-2500，2004;Huang YS et al., Eur J PharmBiopharm., 67:301 - 308, 2007)。
[0007]綜上所述，現(xiàn)有改善活性蛋白體內(nèi)半衰期的方案存在如下弊端:1.產(chǎn)物不均一，工藝要求復(fù)雜；2.修飾物不被生物體降解，會在體內(nèi)蓄積；3.增加了免疫原性；4.導(dǎo)致蛋白生物學(xué)活性顯著下降甚至完全喪失；5.有可能引入了本身不需要的生物學(xué)活性功能。無論化學(xué)修飾，還是通過蛋白融合來改變活性蛋白體內(nèi)外半衰期的方案，都無法完全避免上述弊端。
[0008]為了避免白蛋白，F(xiàn)c片段這些天然載體蛋白存在的弊端，也進(jìn)行了人工構(gòu)建氨基酸序列作為載體蛋白的嘗試，如構(gòu)建富含Gly，Glu的氨基酸聚合物，將其作為融合載體來延長蛋白藥物半衰期，David ff.Leung等模仿化學(xué)合成的聚谷氨酸，人工合成聚谷氨酸序列用于作為融合載體來延長蛋白藥物半衰期(US20080176288)，或者人工合成多聚甘氨酸序列作為融合載體，(Schlapschy M et al., Protein Eng Des Sel.，20:273-284，2007),也有完全人工設(shè)計，選取一些親水性氨基酸，如Gly，Asp, Glu, Ser等人工構(gòu)建氨基酸聚合物，將其作為融合載體來延長蛋白藥物半衰期。但是這些完全重新設(shè)計的氨基酸聚合物作為融合載體實際效果很難預(yù)測，存在諸多問題。例如，1:人工設(shè)計的序列，雖然理論上含有很多親水性氨基酸，但是鑒于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能之間關(guān)系的復(fù)雜性，現(xiàn)有技術(shù)上很難預(yù)測完全人工設(shè)計序列的空間結(jié)構(gòu)(如二級結(jié)構(gòu)，三級結(jié)構(gòu)等)，因此其潛在的生物學(xué)功能和免疫原性是未知的；2人工設(shè)計重復(fù)序列不同于天然進(jìn)化所產(chǎn)生的蛋白序列，特別是那些重復(fù)序列極高的片段，很難進(jìn)行重組表達(dá)，實際表達(dá)量往往極低而無法實際應(yīng)用。發(fā)明人曾按照David W.Leung等(US20080176288)提供的方法通過重組表達(dá)聚谷氨酸用于作為融合載體來延長蛋白藥物，但是實際上按其所提供的方法，根本無法表達(dá)獲得其所聲稱的序列。
[0009]因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)一種有效簡便地改善蛋白質(zhì)/多肽的體內(nèi)外穩(wěn)定性，且無或幾乎無其他副作用的技術(shù)方案。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明的目的就是提供一種有效簡便地改善蛋白質(zhì)/多肽的體內(nèi)半衰期的方法，與現(xiàn)有技術(shù)相比較，該方法具有更多的優(yōu)勢。 [0011]在本發(fā)明的第一方面，提供了一種可用于延長蛋白體內(nèi)半衰期的重組的明膠樣單元，所述的明膠樣單元是結(jié)構(gòu)如下的多肽:
[0012](Gly-X-Y)n
[0013]式中，
[0014]Gly為甘氨酸殘基；
[0015]X和Y分別為20種天然氨基酸除了 Cys之外的任意氨基酸殘基；[0016]η 為 20-300;
[0017]并且，所述的明膠樣單元具有以下特征:
[0018](a)所述明膠樣單元中以下親水性氨基酸Asn, Asp, Gin, Glu, Lys, Pro, Ser, Hyp,Arg的氨基酸百分比含量總和為40%至2/3 (66.7%)；
[0019](b)所述明膠樣單元中，Pro和Hyp的數(shù)量之和與η的比值≥0.6 ；
[0020](c) Gly的數(shù)量之和與η的比值≥1.15 (更佳地≥1.05)；
[0021]附加條件是，所述的明膠單元不是天然的明膠蛋白。
[0022]在另一優(yōu)選例中，所述的明膠樣單元還具有以下特征:
[0023](d)等電點為3-7 (較佳地為3.2-6，更佳地為3.2-5.5)；
[0024](e)根據(jù)Kolaskar-Tongaonkar法計算平均抗原指數(shù)不高于0.98 ；
[0025](f)根據(jù)ProtParam公式計算，代表親水性的GRAVY值小于-1.1 (較佳地小于-1.4，更佳地小于-1.5)。
[0026]在另一優(yōu)選例中，所述的明膠樣單元的序列來源于或衍生自明膠。例如，在X，Y位上進(jìn)行取代，將部分或全部天然明膠中的疏水性氨基酸Ile，Leu，Met，Phe，Val等突變?yōu)橛H水性氨基酸，優(yōu)選的是突變?yōu)锳la, Asn, Gin, Glu, Lys, Pro, Ser, Hyp, Arg中任意一種和/或幾種，使得GRAVY值小于-1.4。
[0027]在另一優(yōu)選例中，所述的明膠樣單元的分子量為10-100kDa。
[0028]在本發(fā)明的第二方面，提供了一種多核苷酸，它編碼第一方面中所述的明膠樣單元。
[0029]在本發(fā)明的第三方面，提供了一種重組的融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白由生物活性多肽和第一方面中所述的明膠樣單元融合而形成。
[0030]在另一優(yōu)選例中，與不含所述明膠單元的生物活性多肽相比，所述融合蛋白在體內(nèi)的半衰期至少延長1倍；更佳地，半衰期延長至少2、3、4、5、6、或10倍。
[0031]在另一優(yōu)選例中，所述融合蛋白的表觀分子量(分子篩測定法)與理論分子量之比≥1.25，更佳地≥1.5，最佳地≥2。
[0032]在另一優(yōu)選例中，生物活性多肽的分子量為0.5-70Kda,更佳地為l_66Kda。
[0033]在另一優(yōu)選例中，所述的明膠單元位于所述融合蛋白中的氨基端、羧基端、兩端、或中間。
[0034]在另一優(yōu)選例中，所述的融合蛋白為單體或多聚體形式。
[0035]在另一優(yōu)選例中，所述融合蛋白是如式I所示的單體或其多聚體形式，
[0036](GLK)p-R- {GLK} q式 1
[0037]式中，
[0038]GLK表示如本發(fā)明第一方面中所述的明膠單元；
[0039]p和q獨立地為0或1，且p和q不同時為0;
[0040]R為不含所述的明膠單元的、具有生物學(xué)功能的蛋白，且所述的R不是明膠蛋白；和
[0041]表示肽鍵。
[0042]在另一優(yōu)選例中，所述融合蛋白內(nèi)所有(Gly-X_Y)n片段包含的η總和大于20，小于 300。[0043]在另一優(yōu)選例中，所述融合蛋白的分子量為20_500Kda。
[0044]在另一優(yōu)選例中，所述的融合蛋白為多聚體，且式I中的各R和GLK可相同或不同。
[0045]在本發(fā)明的第四方面，提供了一種多核苷酸，所述的多核苷酸編碼第三方面中所述重組的融合蛋白。
[0046]在本發(fā)明的第五方面，提供了含有第四方面所述的多核苷酸的序列的表達(dá)載體。
[0047]在 本發(fā)明的第六方面，提供了一種重組的宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞含有第五方面所述的表達(dá)載體、或者染色體中整合有第四方面所述的多核苷酸。
[0048]在本發(fā)明的第七方面，提供了一種制備所述的重組融合蛋白的方法，包括步驟:
[0049](1)培養(yǎng)第六方面所述的宿主細(xì)胞，從而表達(dá)所述的重組融合蛋白；和
[0050](2)分離出所述的重組融合蛋白。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0051]圖1為重組明膠樣融合蛋白幾種典型基本結(jié)構(gòu)。
[0052]圖2為pPIC_GLK1164表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建流程圖。
[0053]圖3為pPIC-GLK1164/G_CSF表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建流程圖。
[0054]圖4為rGLK1164/G-CSF純化過程中SDS-PAGE電泳(8%)分析，純化最終產(chǎn)品為單一條帶，表觀分子量介于66KD-97KD之間。左起:泳道1.低分子量蛋白Marker,泳道2.發(fā)酵液上清，3.SP柱洗脫峰，4.Q柱洗脫峰。
[0055]圖5 為 SEC-HPLC 分析純化的 rGLK1164/G_CSF，采用 TSK Gel G3000Swxl 柱，緩沖液為 50mM ΡΒ,Ο.25Μ NaCl, ρΗ7.0，檢測波長為 214nm，流速為 0.8ml/min。
[0056]圖6為反相高效液相色譜(RP-HPLC)分析純化的rGLK1164/G_CSF，RP-HPLC采用VYDAC protein C4TP5415柱，流動相A為:含0.1%TFA的水溶液，流動相B采用含0.1%TFA的9:1乙腈:水溶液，檢測波長為214nm，流速為0.8ml/min。
[0057]圖7為rGLK1164/G-CSF免疫印跡分析結(jié)果，所用一抗為抗G-CSF鼠多抗。
[0058]圖8顯示了利用rhG-CSF依賴株NSF60測定rGLK1164/G_CSF融合蛋白的體外生物學(xué)活性。
[0059]圖9SEC-HPLC分析rhG-CSF和rGLK1164/G_CSF體外穩(wěn)定性研究結(jié)果。
[0060]圖10rGLK1164和rGLK1164/G_CSF小鼠連續(xù)注射后血清抗體檢測結(jié)果。A為G-CSF包被，B為rGLK1164包被。
[0061]圖 11 不同劑量 rGLK1164/G-CSF 融合蛋白，rhG_CSF，rHSA/G_CSF 和 rGLK1164 在正常成年SD大鼠體內(nèi)的藥效學(xué)研究結(jié)果。
[0062]圖12不同劑量rGLK1164/G-CSF融合蛋白，rhG-CSF和rHSA/G-CSF在正常成年SD大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)研究結(jié)果。
[0063]圖13為pPIC_GLK1164/IFNa表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建流程圖。
[0064]圖14為rGLK1164/IFN a純化過程中SDS-PAGE電泳(8%)分析，純化最終產(chǎn)品為單一條帶，表觀分子量約為85KD。左起:泳道1.低分子量蛋白Marker，泳道2.發(fā)酵液上清，
3.Q柱洗脫峰。
[0065]圖15rGLK1164/IFNa在獼猴體內(nèi)藥代動力學(xué)研究結(jié)果。[0066]圖 16pPIC-Exendin-4/GLK1046 和 pPIC-Exendin_4/GLK1076 表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建流程圖。Exendin-4為艾塞那肽。
[0067]圖17為rExendin-4/GLK1046純化過程中SDS-PAGE電泳(10%)分析，表觀分子量介于66KD-97KD之間。左起:泳道1.低分子量蛋白Marker，泳道2.發(fā)酵液上清，3.SP柱洗脫峰，4.Q柱洗脫峰。
[0068]圖18利用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染有GLP-1R的BHK細(xì)胞測定rExendin_4/GLK1046和rExendin-4/GLK1076融合蛋白的體外生物學(xué)活性。
[0069]圖19rExendin_4/GLK1046和rExendin_4/GLK1076在正常成年稱猴體內(nèi)的藥代動
力學(xué)研究結(jié)果。
[0070]圖20pCEP4_EP0/GLK1074表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建流程圖。
[0071]圖21不同劑量rEP0/GLK1074融合蛋白和rhEPO在正常BALB/c小鼠體內(nèi)藥效的藥效學(xué)研究結(jié)果。
【具體實施方式】
[0072]本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，通過大量篩選，首次發(fā)現(xiàn)重組明膠樣蛋白(gelatin like protein, GLK)及其突變體非常適合作為融合蛋白的融合載體。本發(fā)明人將明膠樣單元作為融合載體，使其與活性蛋白融合后，可以顯著延長生物活性多肽/蛋白在機(jī)體內(nèi)的體內(nèi)半衰期。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
[0073]具體而言，試驗表明，將明膠樣單元與具有生物活性的蛋白融合表達(dá)后獲得的重組明膠樣融合蛋白，可以顯著改善生物活性蛋白的體外穩(wěn)定性，更重要的是可以明顯降低融合蛋白在體內(nèi)被清除的速度，改變活性蛋白在體內(nèi)的藥代分布，從而延長活性蛋白在體內(nèi)的半衰期。
[0074]在描述本發(fā)明所涉及的蛋白質(zhì)，核苷酸序列和各種方法學(xué)之前，可以理解的是本發(fā)明不局限于這些特定的方法，操作規(guī)程，細(xì)胞株，載體和試劑，因為這些是可以有所變動的。另外，在這里所使用的術(shù)語只是為了描述特定的實例，不是故意限定本發(fā)明的范圍。除非特別限定，否則這里所有的技術(shù)以及使用的科學(xué)術(shù)語與本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所理解的相同。本發(fā)明描述的只是一些優(yōu)選的方法，設(shè)備和材料，其他一些方法和材料相似或相當(dāng)于本發(fā)明中的一些描述，也可用于實踐或測試本發(fā)明。
[0075]明膠樣單元
[0076]如本文所用，術(shù)語“明膠樣單元”、“明膠樣蛋白”、或“GLK(gelatin-likeprotein) ”可互換使用。
[0077]天然明膠是來源于膠原的一類蛋白質(zhì)，它是經(jīng)膠原變性獲得的產(chǎn)物，其基本結(jié)構(gòu)有多個Gly-X-Y重復(fù)，結(jié)構(gòu)通式為(Gly-X-Y)n，其中X和Y經(jīng)常是脯氨酸和羥脯氨酸殘基，而且，脯氨酸和羥脯氨酸殘基的含量比例會影響其結(jié)構(gòu)和熔點。X，Y位氨基酸組成的不同，會影響膠原的親水性，等電點，二級結(jié)構(gòu)，免疫原性等特性。
[0078]明膠可通過處理動物的骨頭和毛皮而提取。然而，動物來源的明膠常常殘存的具有侵染能力的病毒。此外，動物源性明膠施用于人還存在生物相容性的問題。
[0079]分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展使得利用基因重組技術(shù)獲得基于人源明膠的生理特性穩(wěn)定、均一性高的重組明膠成為可能。目前，已有較多關(guān)于人源的重組膠原或明膠在微生物、動物細(xì)胞或者植物中表達(dá)的報道(美國專利US.5，593，859;US.6，428，978;US.6，617，431 ；fferten MW et al.，Yeast, 15:1087-1096，1999)。利用膠原基因不同的片段可以獲得具有不同生化特性的重組明膠，而眾多的研究結(jié)果表明，畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)可以用來生產(chǎn)不同來源的具有獨特生化特性的重組明膠或類明膠(Olsen D et al., Adv Drug DelivRev.，55:1547-1567，2003)。重組明膠同膠原水解獲得的天然明膠一樣具有穩(wěn)定蛋白的作用，已被用來作為疫苗的穩(wěn)定劑(US2006/0204511A1)。
[0080]在本發(fā)明中，明膠樣單元指序列源自或衍生自天然明膠的且通過重組表達(dá)的多肽片段，也包含具有天然明膠扣^^^結(jié)構(gòu)特征的經(jīng)過突變的明膠樣序列。
[0081]在本發(fā)明中，明膠樣單元的長度或分子量沒有特別限制。按長度計，每個明膠單元通常含60-1500個氨基酸殘基，較佳地200-1000個氨基酸殘基；按分子量計，每個明膠單元通常為6-150KDa，較佳地為20_80KDa。
[0082]重組明膠樣融合蛋白
[0083]本發(fā)明涉及一類新型的重組明膠樣融合蛋白，它由一個/數(shù)個來自于天然或人造的具有生物學(xué)功能的蛋白與明膠樣單元組成，使其具有診斷/治療/靶向作用。重組明膠樣融合蛋白的基本結(jié)構(gòu)是具有{GLK}p-R_ {GLK} q結(jié)構(gòu)的單體或其多聚體形式。其中GLK表示明膠樣單元；P和q為0或1，且p和q不同時為0 ;R為不含所述的明膠單元的、具有生物學(xué)功能的蛋白，且所述的P不是明膠蛋白；重組明膠樣融合蛋白如果成為多聚體形式，則成為{GLKUp-Rf {GLK2}q- {GLK3}p-R2, {GLKl}p-R「{GLK2}q- {GLK3}p-R2_ {GLK4}q, {GLKl}p-Rr {GLK2} q- {GLK3}p_R2_ {GLK4}q- {GLK5}p-R「{GLK6 } q 等結(jié)構(gòu)形式，其中Rh可以是相同的或不同的，GLK1至GLK6可以是相同的或不同的，但是至少包含一段GLK結(jié)構(gòu)和一段具有生物學(xué)活性功能的蛋白/多肽單元(如&或R2)。圖1顯示了幾種典型重組明膠樣融合蛋白的結(jié)構(gòu)。)
[0084]本發(fā)明是通過將一個或幾個生物活性蛋白及其片段與一段或幾段具有一定分子量的明膠樣蛋白GLK (gelatin-like protein)融合表達(dá)來實現(xiàn)的。用于融合表達(dá)的GLK不具有免疫原性，在生理條件下具有極好的水溶性。根據(jù)本發(fā)明制備的重組明膠樣融合蛋白，不僅體現(xiàn)出更好的體外穩(wěn)定性和體內(nèi)半衰期，而且與現(xiàn)有的蛋白質(zhì)修飾或融合方案相比，其結(jié)構(gòu)是均一的，而且出人意外地具有更高的生物學(xué)活性。并且，作為融合載體的GLK部分是生物相容的，具有無免疫原性，可被機(jī)體降解，不會在體內(nèi)蓄積等優(yōu)點。
[0085]在這里，“重組明膠樣融合蛋白”指具有基本結(jié)構(gòu)為{GLK}p-R_ {GLK} q的融合蛋白，蛋白/多肽R與(Gly-X-Y)n2間是直接通過肽鍵連接的。進(jìn)一步的，R與GLK之間還可以通過間隔物相連。術(shù)語“間隔物”指一個或多個分子，例如氨基酸，核酸或化學(xué)分子，例如聚乙二醇(PEG)，即可以插入一個或多個組分結(jié)構(gòu)域。間隔物可以用于提供需要組分之間的目標(biāo)位點，以方便操作，也可以是為了利于保持活性蛋白的空間結(jié)構(gòu)，或者活性蛋白與靶分子的相互作用。最適用于本發(fā)明的間隔物是短的連接肽，如一些富含Gly，Ser的短連接肽，如(GlyGlyGlyGlySer)n，n介于1-10之間；連接肽也可以采用其他目前已在廣泛應(yīng)用的連接妝，如 Darning Shan 所提及的妝段(Shan D et al., J Immunol., 162:6589-6595, 1999)。當(dāng)然，GLK本身也可以作為一段連接肽使用?？梢匀菀桌斫獾氖?，蛋白/多肽部分還可以重復(fù)出現(xiàn)，從而充當(dāng)一個間隔物的作用，形成如RfRfGLK，RrRrGLK-R^ GLK-& - R1；RrGLK-R2-R2,RrRrGLK-R^^`等結(jié)構(gòu)。圖1提供的僅是一些重組明膠樣融合蛋白的典型結(jié)構(gòu)，但是根據(jù)本發(fā)明的精神，并不僅限于圖1的結(jié)構(gòu)。
[0086]重組明膠樣融合蛋白中包含的GLK是具有(Gly-X_Y)n明膠結(jié)構(gòu)特征的高度重復(fù)蛋白序列，其序列可以是完全或者部分來源于天然明膠，也可以是天然明膠部分序列片段的簡單重復(fù)，也可以是經(jīng)過優(yōu)化的具有Gly-X-Y特征的人工序列。由于不同種屬間明膠序列的同源性差異較小，GLK的序列來源可以是非人源性的明膠序列，也可以是來源于人源性的明膠序列，如 David Olsen (Olsen D et al., Adv Drug Deliv Rev., 55:1547-1567, 2003)文中所提及的α1(Ι)膠原的序列片段；GLK序列可以完全是與天然序列一致的，也可以是選取其中一段天然序列，然后通過簡單重復(fù)來達(dá)到本發(fā)明所需要的大小?？梢赃x用的GLK序列來源是極其廣泛的，不管是天然來源序列或者人工合成來源的具有(Gly-X_Y)n特征的明膠樣序列，如US5801045，US6150081，US6428978，W001/34646A2等所涉及的明膠片段。只要是沒有免疫原性，在<40°C時水相中可溶的序列均可用于重組明膠樣融合蛋白的制備。[0087]進(jìn)一步的，為了更好的達(dá)到本發(fā)明的效果，
【發(fā)明者】還根據(jù)如下原則在天然明膠Gly-X-Y重復(fù)單元基礎(chǔ)上重新設(shè)計了一類重組明膠樣序列:
[0088]1.盡量選取天然明膠序列中出現(xiàn)頻率高的Gly-X-Y重復(fù)單元，如Gly-Pro-Hyp,Gly-Pro-Ala, Gly-Ala-Hyp, Gly-Glu-Lys, Gly-Pro-Lys, Gly-Glu-Hyp, Gly-Ser-Hyp, Gly-Gln-Hyp, Gly-Glu-Arg和Gly-Pro-Arg等單元將其重新組合；
[0089]2.盡量選取富含親水性氨基酸的Gly-X-Y重復(fù)單元將其重新組合，優(yōu)選的X，Y是親水性氨基酸，更優(yōu)選的，是Ala, Asn, Gin, Glu, Lys, Pro, Ser, Hyp, Arg中任意一種和/或幾種；
[0090]3.重新設(shè)計的GLK序列中盡量不含已知的具有免疫原性的序列。根據(jù)現(xiàn)有公開的技術(shù)文件已經(jīng)表明有免疫原性的位點，如H.Hori等報導(dǎo)的Ile-Pro-Gly-Glu-Phe-Gly-Leu-Pro-Gly-Pro(Hori H et al., J.Allergy Clin Immunol., 110:652-657, 2002)；
[0091]4.重新設(shè)計的GLK序列中盡量不含已知的蛋白酶作用位點的序列，如信號肽酶KEX-2位點等這類目前已知的蛋白酶作用位點。
[0092]5.重新設(shè)計的重組明膠樣序列經(jīng)Kolaskar-Tongaonkar法計算，平均抗原指數(shù)(Average antigenic propensity)不高于 0.98
[0093]改構(gòu)后的人工序列富含親水性氨基酸，其典型序列包括但并不限于SEQ ID N0:2,19，21 等。
[0094]重組明膠樣融合蛋白{GLK}p-R_ {GLK}q中，GLK的基本結(jié)構(gòu)Gly_X_Y重復(fù)單元數(shù)目(η)的大小，也就是GLK的分子量范圍是可變的。為了達(dá)到本發(fā)明的目的，首先重組明膠樣融合蛋白必須具有合適的分子量大小，以保證不被腎臟過濾清除。重組明膠樣融合蛋白分子量是由蛋白/多肽部分R和GLK共同決定的，對于一種特定的活性重組明膠樣融合蛋白，活性蛋白質(zhì)R的分子量是確定的，而且數(shù)目也是確定的話，重組明膠樣融合蛋白分子量是由GLK的大小和數(shù)目決定的。當(dāng)?shù)鞍?多肽R部分分子量較小的時候(如〈20KD)，為了避免重組明膠樣融合蛋白被腎小球濾過，GLK的分子量應(yīng)該至少在15-70KD之間，更大的分子量并不一定有利于延長重組明膠樣融合蛋白在機(jī)體內(nèi)的半衰期，反而不利于重組表達(dá)，而且容易被蛋白酶降解，意外的免疫原性也難以控制，因此合適的GLK分子量介于6-150KD之間，更優(yōu)的是介于20-80KD之間。當(dāng)R部分本來就比較大，或者可以形成二聚或多聚體，則GLK分子量范圍可以進(jìn)一步放寬，可以是介于lkDa-150KDa之間，例如約1000-2000Da，約2-20kDa之間，約 20_50kDa 之間，約 50_100kDa之間，約 100_150kDa 之間，約 150_200kDa 之間。
[0095]重組明膠樣融合蛋白的分子量沒有特別限定，通常為20_500KDa，較佳地為25-300KDa。
[0096]生物活性蛋白/多肽
[0097]“生物活性蛋白/多肽”指的是蛋白質(zhì)，抗體，多肽及其片段和變異體，具有一種或者多種藥理學(xué)和/或生物學(xué)活性，或靶向引導(dǎo)，多聚化等功能。它們可以是天然就存在的，也可以是人工構(gòu)建的?！吧锘钚缘鞍?多肽”包括酶，酶抑制劑，抗原，抗體，激素，凝血因子，干擾素，細(xì)胞因子，生長因子，分化因子，骨組織生長有關(guān)的因子，與骨質(zhì)因子吸收相關(guān)的因子，趨化因子(chemotactic factors),細(xì)胞運(yùn)動因子(cell motility factors),移動因子(migration factors),靜止因子(cytostatic factors),殺(細(xì))菌因子，抗真菌因子，血漿黏附分子，間質(zhì)黏附分子和細(xì)胞外基質(zhì)，受體配基及其片段等。
[0098]本發(fā)明所涉及的生物學(xué)活性蛋白/多肽，更特指表現(xiàn)出“治療活性”的蛋白/多肽，或者“治療上有活性”的蛋白/多肽，這種蛋白/多肽擁有一種或者更多已知的生物和/或治療活性。這些活性與一種或更多種在這里描述的，或者其他已知的治療蛋白相關(guān)。作為一個非限制性例子，“治療蛋白”是指一種對于治療，預(yù)防或者改善疾病，狀況，或者機(jī)能絮亂有用的蛋白。作為一個非限制性例子，“治療蛋白”可以是一種特異性的結(jié)合到特定細(xì)胞類型(正常(例如淋巴細(xì)胞)或者異常(例如癌細(xì)胞))并且用于將化合物(藥物，或者細(xì)胞毒性劑)特異性定位于該細(xì)胞類型的蛋白。
[0099]在另外的非限制性例子中，“治療蛋白”是指有生物活性的蛋白，特別是一種對于治療，防止和改善疾病有用的生物活性蛋白。非限制性的治療蛋白包括擁有以下生物活性的蛋白:如增加血管新生，抑`制血管新生，調(diào)節(jié)造血功能，促進(jìn)神經(jīng)發(fā)育，提高免疫反應(yīng)，抑制免疫反應(yīng)等。
[0100]正如上述提及中的一樣，“治療活性”或者“活性”可以指在人類、非人哺乳動物或其他種屬生物體中，得到與理想的治療結(jié)果一致的效果的活性。治療活性可以在體內(nèi)或者體外測量。
[0101]本發(fā)明中與重組明膠樣融合蛋白的治療性蛋白部分相應(yīng)的治療性蛋白，包括，但并不限于:VEGF受體，TNF受體，HER-2/神經(jīng)膜受體，人ErbB3受體分泌形態(tài)異構(gòu)體，轉(zhuǎn)化生長因子bill型受體胞外區(qū)，轉(zhuǎn)化生長因子b II型受體胞外區(qū)，IL-1受體，IL-4受體，尿激酶，β -葡糖腦苷脂酶，精氨酸脫亞胺酶，Arginase, herstatin,表皮生長因子，F(xiàn)GF-1,纖維原細(xì)胞生長因子_2，普通纖維細(xì)胞生長因子，神經(jīng)生長因子，血小板來源生長因子，VEGF-1，IL-1, IL-2, IL-3，IL-4, IL-6，IL-8, IL-10, IL-11, IL-12，IL-18，IL-21，IL-24，IL-1RA, RANKL, RANK, 0PG, LEPTIN，干擾素 α，干擾素 β，干擾素 Υ，干擾素 Ω，TGF- β，TGF- β -1，TGF- β -3，TNF α，心房鈉尿多肽，Β型鈉尿肽，促性腺激素，人黃體生成素，促卵泡激素，人生長激素，ΕΡ0, G-CSF，GM-CSF，ΤΡ0, M-CSF，SCF，VEGF, ΕΡ0 模擬肽，ΤΡ0 模擬肽，F(xiàn)LT3配體，Αρο2配體，骨細(xì)胞抑止因子，BMP-2，BMP-7, GLP-1及其類似物，Exendin_3，Exendin-4,胰島素及其類似物，GIP,胰高血糖素，內(nèi)皮抑制素(endostatin)，plasminogenkringleldomain, plasminogen kringle5domain, angiostatin 等。治療性蛋白也還可以是抗體及其片段，單鏈抗體scFv等。這些蛋白以及編碼這些蛋白的核酸序列都是大家熟知的，并且在如 Chemical Abstracts Services Databases (例如 CAS Registry)，GenBank 和GenSeq這樣的公共數(shù)據(jù)庫中可以找到。對于本專業(yè)人員來說，根據(jù)本發(fā)明的精神，容易理解的是現(xiàn)有已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的絕大部分生物活性蛋白都適用于本發(fā)明。當(dāng)然，同樣應(yīng)理解的是，在此發(fā)明以后新發(fā)現(xiàn)的具有生物學(xué)活性的蛋白/多肽，也同樣適用于本發(fā)明。
[0102]本發(fā)明中重組明膠樣融合蛋白中的生物活性蛋白，可以是非糖基化的，也可以是糖基化的，例如部分細(xì)胞因子，細(xì)胞表面蛋白和分泌性蛋白，經(jīng)常會被修飾，如結(jié)合一個或多個的寡糖基團(tuán)。糖基化一般有兩種主要類型:0-連接的寡糖糖基化，連接位點在絲氨酸或蘇氨酸殘基上；N-連接的寡糖糖基化，連接位點在Asn-X-Ser/Thr序列的天冬酰胺酸殘基位點上，在此，X可以是除了脯氨酸以外的任何氨基酸。
[0103]糖基化異構(gòu)體可以通過去除或者引入糖基化位點獲得，比如替換或者去除氨基酸殘基，象用谷氨酸代替天冬酰胺酸那樣，或者在不產(chǎn)生這種糖基化蛋白的宿主細(xì)胞中表達(dá)非糖基化重組蛋白，例如在大腸桿菌或者糖基化缺陷的酵母中表達(dá)。
[0104]作用機(jī)制
[0105]多肽/蛋白質(zhì)在體內(nèi)迅速被清除的機(jī)制是多樣的，包括腎小球過濾，受體介導(dǎo)內(nèi)吞，蛋白酶作用，淋巴系統(tǒng)清除，肝臟清除等多種機(jī)制?；钚缘鞍着cIgG的Fc片段或白蛋白融合后之所以可以保持較長的半衰期，是因為體內(nèi)存在特殊的FcRn介導(dǎo)的循環(huán)作用保護(hù)。
[0106]將明膠序列與活性蛋白融合表達(dá)后延長活性蛋白半衰期的確切機(jī)制尚未清楚。到目前為止尚未發(fā)現(xiàn)有類似的受體起作用。GLK序列本身不會與FcRn結(jié)合。本發(fā)明人將人血清包被酶標(biāo)板，加入GLK/G-CSF融合蛋白(同時以G-CSF作為陰性對照)，保溫孵育洗滌后用生物素標(biāo)記的G-CSF (Abeam pic.)抗體結(jié)合，經(jīng)HRP顯色證明GLK融合蛋白并沒有與血清中的任何組分有結(jié)合作用，因此排除了這種“GLK融合蛋白與血清中某些組分相互結(jié)合”的可能性。另外，可以肯定的是并不是純粹因為融合后增加了分子量而導(dǎo)致半衰期的延長，現(xiàn)有的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，純粹的增大融合蛋白分子量并不一定能延長其體內(nèi)半衰期，如Carlos A.(Buscaglia CA et al.，Blood.，93:2025-2032，1999)研究發(fā)現(xiàn)分子量大的 TSac蛋白(76KD)體內(nèi)半衰期(約幾小時)遠(yuǎn)小于比它分子量小的GST-Ag36 (60KD)(約30小時)。實施例7的數(shù)據(jù)也顯示，同樣的活性多肽，選用不同序列，但是分子量接近的明膠樣單元作為融合載體，最終獲得的融合蛋白卻具有不同的半衰期。
[0107]應(yīng)理解，本發(fā)明的保護(hù)范圍并不受作用機(jī)理的限制。本發(fā)明人提供以下機(jī)理是為了便于更好地理解本發(fā)明。融合后重組明膠樣融合蛋白能增加活性蛋白在體內(nèi)外穩(wěn)定性和半衰期的可能原因有:
[0108](l)GLK的Gly-X-Y結(jié)構(gòu)中Y位Pro (Hyp)的大量存在，使其在生理環(huán)境中保持了一種松散的結(jié)構(gòu)，從而形成了一道屏障保護(hù)了活性蛋白不被體內(nèi)蛋白酶降解。
[0109](2)GLK結(jié)構(gòu)中富含親水性氨基酸，因此有很大的水合分子半徑，也避免了其在腎臟過濾排出。理論分子量約為55KD的rGLK1164/G-CSF融合蛋白，用分子篩分析其表觀分子量約為154KD (表觀分子量:理論分子量=2.8)。
[0110](3)融合蛋白中GLK特別的帶電性質(zhì)導(dǎo)致了重組明膠樣融合蛋白在體內(nèi)更長時間的駐留。本發(fā)明的GLK具有較低的等電點，在正常生理條件下帶負(fù)電荷。很多血漿蛋白大多帶負(fù)電荷且具有運(yùn)輸功能，帶有負(fù)電荷的重組明膠樣融合蛋白減少了與這些血漿蛋白相互結(jié)合的可能性，因此可以在血漿中存留更長的時間。[0111](4)血管壁上內(nèi)皮細(xì)胞表面覆蓋的多糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物(glycocalyx)的存在降低了重組明膠樣融合蛋白的清除率。血管壁上的多糖-蛋白質(zhì)控制著血管內(nèi)與周圍基質(zhì)間的物質(zhì)運(yùn)輸(Simionescu M, Simionescu N,Annu.Rev.Physiol.,48:279-293, 1986) ? 多糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物在正常生理狀態(tài)下帶負(fù)電荷，而重組明膠樣融合蛋白也帶負(fù)電荷，由于同種電荷的排斥，也減少了重組明膠樣融合蛋白與glycocalyx的相互作用，從而減少了重組明膠樣融合蛋白從血管向組織中的滲透。
[0112]重組明膠樣融合蛋白的制備
[0113]本發(fā)明的融合蛋白可用固相技術(shù)通過直接合成肽而加以生產(chǎn)，也可以分別化學(xué)合成本發(fā)明蛋白的各片段，然后用化學(xué)方法加以連接以產(chǎn)生全長的分子。在優(yōu)選方案中，本發(fā)明的融合蛋白用重 組方法來制備。
[0114]重組方法來制備明膠融合蛋白涉及在原核宿主，真核宿主，植物或者動物中表達(dá)編碼重組目標(biāo)明膠融合蛋白核苷酸，以及獲得重組明膠樣融合蛋白的過程。任何可以表達(dá)重組蛋白的系統(tǒng)，包括原核，真核，轉(zhuǎn)基因動植物系統(tǒng)，都可應(yīng)用于本發(fā)明。例如，美國專利US6548653所提及的所有用于表達(dá)融合蛋白的方法,都適合于本專利。
[0115]更詳細(xì)的說，通過重組方法來獲得目標(biāo)重組明膠樣融合蛋白，首先需要獲得編碼所需重組明膠樣融合蛋白的核苷酸，編碼目標(biāo)核苷酸序列可用多種不同的常規(guī)方法制備。此外，為了得到上述序列的衍生或變異序列，可以對核苷酸序列進(jìn)行修飾或改動，例如通過基因工程技術(shù)。
[0116]更優(yōu)選地，在本發(fā)明的過程中，核苷酸序列是包含有轉(zhuǎn)錄起始區(qū)(啟動子序列)的表達(dá)框的一部分，在宿主細(xì)胞中，此轉(zhuǎn)錄起始區(qū)控制核苷酸序列的表達(dá)，并編碼本發(fā)明中的多肽。此區(qū)域可來自在所用的宿主菌中高度表達(dá)的，組成型或調(diào)控型基因的啟動區(qū)。例如對于酵母，可以是甲醇氧化酶(Α0Χ)，磷酸甘油酸酯激酶(PGK)以及類似基因的啟動子。表達(dá)框也可以包括在所使用的宿主菌中有功能的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)，緊密的連接在編碼本發(fā)明中多肽的核苷酸序列下游。
[0117]在優(yōu)選的方案中，編碼本發(fā)明中多肽的核苷酸序列之前帶有一段信號肽序列，用于引導(dǎo)新生的多肽在其宿主中進(jìn)入分泌途徑。
[0118]除了表達(dá)框，一個或幾個可用于篩選重組宿主菌的標(biāo)簽(Tag)都可以加入，例如酵母S.cerevisiae的URA3基因，pichia酵母中G418抗性基因，或其他任何選擇性標(biāo)簽。表達(dá)框和篩選標(biāo)記形成的單位可被直接引入到宿主細(xì)胞中，或者預(yù)先插入到功能性自我復(fù)制的表達(dá)載體中。可選用的表達(dá)載體來源是極其廣泛的，包括但并不限于:Kluyveromyces酵母常用的表達(dá)質(zhì)粒pKDl ;Saccharomyces屬酵母優(yōu)選的2 μ質(zhì)粒；pichia系統(tǒng)常用的pPIC9, pPIC9K, pPICZa 表達(dá)質(zhì)粒等。
[0119]在構(gòu)建了上述重組表達(dá)質(zhì)粒以后，可以根據(jù)常見的分子生物學(xué)文獻(xiàn)，如《分子克隆實驗指南》第三版(Sambrook J, Russell DW, Molecular cloning:A laboratorymanual.3rd edition, New York:Cold Spring Harkbor Laboratory Press, 2001)或商業(yè)公司提供的常規(guī)技術(shù)，將重組質(zhì)粒引入到所選的宿主細(xì)胞中，并篩選成功整合有重組質(zhì)粒的宿主菌細(xì)胞。可以實用任何可將外源DNA引入到細(xì)胞中的常規(guī)方法，如轉(zhuǎn)化，電轉(zhuǎn)化，接合等。任何可以表達(dá)重組蛋白的系統(tǒng)，包括原核，真核，轉(zhuǎn)基因動植物系統(tǒng)，都可應(yīng)用于本發(fā)明。[0120]在轉(zhuǎn)化細(xì)胞篩選后，表達(dá)上述融合蛋白的細(xì)菌或細(xì)胞會被接種培養(yǎng)。融合蛋白的收獲會在連續(xù)培養(yǎng)過程的細(xì)胞生長階段，也可以是在生長末期的培養(yǎng)階段，視宿主細(xì)胞的表達(dá)特性而定。融合蛋白可以表達(dá)在宿主菌內(nèi)部，如絕大部分原核表達(dá)系統(tǒng)，也可以分泌在培養(yǎng)基中，如酵母、動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，一般都是胞外分泌的。通過相應(yīng)的離心，破菌，超濾，沉淀，層析等多種方法的組合，可以獲得高度純化的重組明膠樣蛋白或重組明膠樣樣-活性蛋白融合蛋白。純化后的融合蛋白可用于結(jié)構(gòu)鑒定，體內(nèi)外生物學(xué)活性測定，或者藥物代謝動力學(xué)等用途。
[0121]由于表達(dá)載體和宿主菌的差異，通過有些真核系統(tǒng)表達(dá)的重組明膠樣蛋白結(jié)構(gòu)中的Ρι.ο可能會被部分或者全部轉(zhuǎn)化為Hyp，但是這個變化并不影響本發(fā)明的實施效果。雖然酵母中一般不存在脯氨酰-4-羥化酶(P4H)，但通過某些特殊的手段，在酵母系統(tǒng)中也可以實現(xiàn)Pro部分或者全部轉(zhuǎn)化為Hyp,例如，Vuorela(Vuorela et al., EMBOJ.，16:6702-6712，1997)及Vaughan (Vaughan et al., DNA cell Biol.，17: 511-518，1998)的研究結(jié)果表明，在釀酒酵母或畢赤酵母中共同表達(dá)明膠和脯氨酰-4-羥化酶(P4H)基因可以獲得羥基化的明膠。
[0122]重組明膠樣融合蛋白的性質(zhì)
[0123](a)理化性質(zhì)
[0124]本發(fā)明的融合蛋白中的所述明膠樣單元(Gly-X_Y)n具有以下部分或全部理化特性:
[0125](1)親水性氨基酸 Asn, Asp, Gin, Glu, Lys, Pro, Ser, Hyp, Arg 的氨基酸百分比含量較高，總和為40%至2/3 (66.7%)；
[0126](2) Pro和Hyp的數(shù)量之和與η的比值≥0.6 ；
[0127](3) Gly的數(shù)量之和與η的比值≤1.15 (更佳地≤1.05)；
[0128](4)等電點為3-7 (較佳地為3.2-6,更佳地為3.2-5.5)；
[0129](5)根據(jù)Kolaskar-Tongaonkar法計算平均抗原指數(shù)不高于0.98 ；
[0130](6)根據(jù)ProtParam公式計算，代表親水性的GRAVY值小于-1.1 (較佳地小于-1.4，更佳地小于-1.5)。
[0131]表1.實施例1-12中涉及的部分明膠單元的特性
[0132]
【權(quán)利要求】
1.明膠樣單元的用途，用于作為融合載體，延長生物活性多肽在機(jī)體內(nèi)的體內(nèi)半衰期；其中，所述的明膠樣單元是結(jié)構(gòu)如下的多肽:(Gly-X-Y)n式中，Gly為甘氨酸殘基；X和Y分別為20種天然氨基酸除了 Cys之外的任意氨基酸殘基，以及Hyp ；n為 20-300 ；并且，所述的明膠樣單元具有以下特征:(a)所述明膠樣單元中以下親水性氨基酸Asn,Asp, Gin, Glu, Lys, Pro, Ser, Hyp, Arg的氨基酸百分比含量總和為40%至2/3 ；(b)所述明膠樣單元中，Pro和Hyp的數(shù)量之和與n的比值≥0.6 ；(c)Gly的數(shù)量之和與n的比值≤1.15 ；且，根據(jù)ProtParam公式計算，代表親水性的GRAVY值小于-1.5 ；附加條件是，所述的明膠樣單元不是天然的明膠蛋白。
2.如權(quán)利要求1所述的明膠樣單元，其特征在于，所述的明膠樣單元還具有以下特征:(d)等電點為3-7；(e)根據(jù)Kolaskar-Tongaonkar法計算平均抗原指數(shù)不高于0.98。
3.如權(quán)利要求1所述的明膠樣單元，其特征在于，所述的明膠樣單元的分子量為10-100kDa。
4.如權(quán)利要求1所述的明膠樣單元，其特征在于，所述的明膠樣單元的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，或所述的明膠樣單元的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
【文檔編號】C07K14/00GK103641896SQ201310524308
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2009年11月19日 優(yōu)先權(quán)日:2009年11月19日
【發(fā)明者】黃巖山, 周林福, 陳智 申請人:浙江大學(xué)