一種利用聚電解質刷固定蛋白的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用聚電解質刷固定蛋白的方法。本發(fā)明采用具有3D結構的聚電解質刷為載體，在其對蛋白物理吸附有利的條件下吸附大量蛋白，然后通過偶聯(lián)化學手段將蛋白以化學鍵穩(wěn)定結合在聚電解質刷載體上。本發(fā)明大大提高了蛋白的結合量，并且實現(xiàn)了聚電解質刷對蛋白的穩(wěn)定結合，使其能夠高效應用于下游的各種生物技術中。
【專利說明】—種利用聚電解質刷固定蛋白的方法
【技術領域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及生物材料【技術領域】，尤其涉及一種蛋白的固定化方法。
【背景技術】
[0002]蛋白的固定化過程在生物傳感器、蛋白分離純化、診斷檢測與分析、固定化酶催化等諸多生物技術中扮演著重要的角色。在很多應用中，需要載體具有高的蛋白結合量以提高載體在分離、檢測、分析、催化等過程中的應用性能。聚電解質刷是一種新型的載體，它是由載體和接枝在載體表面聚電解質鏈段所組成，由于接枝在載體表面的聚電解質鏈段密度極高，在良溶劑中，聚電解質鏈段在載體表面向外伸展呈現(xiàn)類似毛刷狀的結構。根據載體的形狀可分為聚電解質板刷和聚電解質球刷。聚電解質板刷最早由RUhe等人在1999年通過表面引發(fā)聚合手段合成，聚電解質球刷也由Ballauff等在同一年合成。在這一載體中，單體在微球表面生長形成向外舒展，具有“3D”結構的聚電解質刷結構，為蛋白的結合提供了大量位點，具有實現(xiàn)多層蛋白結合，大幅提高蛋白結合量的潛在能力。另外，聚電解質刷也可以通過先合成聚電解質鏈段，然后嫁接到載體表面的方式形成。
[0003]對現(xiàn)有技術的文獻檢索發(fā)現(xiàn)，Ballauff等在《Physical ChemistryChemicalPhysics))2003年第5卷1671~1677頁發(fā)表的《聚電解質球刷在水溶液中對蛋白的吸附〉〉(Adsorption of proteins on spherical polyelectrolyte brushes in aqueoussolution, Phys.Chem.Chem.Phys., 2003, 5, 1671 - 1677)首次證明了聚電解質球刷能以靜電吸附方式結合大量的蛋白。Bruening等在2006年發(fā)表于《Langmuir》的論文《聚丙烯酸刷及其衍生物對蛋白的高結合量固定化》(High-Capacity Binding of Proteins byPoly (Acrylic Acid) Brushes and Their Derivatives, Langmuir, 2006，22，42744281)中報道帶負電的聚丙烯酸板刷能夠以靜電吸附方式結合一種帶正電的蛋白——溶菌酶，其結合量高達80層。上述研究證明物理吸附作為一種簡單有效的方法，能夠發(fā)揮聚電解質刷大量結合蛋白的潛能。但是，物理吸附的特性決定了這種結合具有不穩(wěn)定性。上述文獻也表明，在較高的鹽濃度(例如生理環(huán)境)和環(huán)境pH改變的情況下，大量的蛋白會從聚電解質刷載體上釋放出來。而在生物傳感器、診斷檢測與分析、固定化酶催化等實際應用過程中，通常要求蛋白與載體的復合物在生理條件以及各種復雜環(huán)境和操作過程中具有高度的穩(wěn)定性，這使得單純通過物理吸附結合蛋白的載體無法勝任某些應用。而化學結合恰恰能夠彌補這一不足。
[0004]針對蛋白在聚電解質球刷上的化學共價固定化，現(xiàn)有的技術方案中對于不同的蛋白和聚電解質刷，得到的蛋白固定量差異巨大。例如，同樣采用基于水溶性碳二亞胺EDC的偶聯(lián)方法，Bruening等在其發(fā)表于《Langmuir》的論文中(High-Capacity Binding ofProteins by Poly (Acrylic Acid)Brushes and Their Derivatives, Langmuir, 2006, 22, 42744281)就提到聚丙烯酸板刷對BSA的固定化效率較低，其結合量低于單層蛋白結合量的2倍。另一篇文獻報道的采用聚合度為1000以上的聚丙烯酸刷用同樣的方法結合RNA酶(RNase A)結合量為單層結合量的 16 倍(Polymeric Brushes as Functional Templatesfor Immobilizing Ribonuclease A:Study of Binding Kinetics and Activity, Langmuir, 2008，24，913-920)，盡管結合量有所提升，但是對于如此高長度的聚丙烯酸刷而言，其對刷子內部空間利用率仍處于較低水平。因此，在這一領域中，亟需建立一種簡便高效而具有普適性的化學共價固定化蛋白的方法，使得人們能夠以一種可控的方式，充分提升聚電解質刷內部空間大量位點的利用率，將大量蛋白穩(wěn)定結合到聚電解質刷載體上，以提高其應用性能。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明針對現(xiàn)有技術存在的上述不足，發(fā)明一種聚電解質刷對蛋白的高結合量的化學共價固定化方法。
[0006]首先，在物理吸附有利的條件下，將蛋白吸附于聚電解質刷上。對于某種聚電解質刷和蛋白，通過控制體系的pH、鹽濃度和溫度等條件，使得蛋白能夠通過靜電、氫鍵、疏水作用或范德華力等作用力大量吸附到聚電解質刷上。其次，在物理吸附有利的條件下進行洗滌，除去體系中過量的蛋白以及與聚電解質刷表面疏松結合的蛋白。再次，在物理吸附有利的條件下通過偶聯(lián)化學反應將蛋白以化學鍵牢固結合在刷上。最后，洗滌除去過量反應物并將聚電解質刷-蛋白復合物分別轉移至適應其各自下游應用所需的環(huán)境中。與在聚電解質刷上采用物理吸附方式固定蛋白相比，采用本發(fā)明提出的蛋白化學共價固定法可以保證蛋白與聚電解質刷穩(wěn)定結合，不會因pH、鹽濃度等外界環(huán)境改變而使得蛋白從聚電解質刷上脫落或解離下來。另外，與現(xiàn)有直接進行化學共價固定蛋白技術相比，采用本發(fā)明提出的化學共價結合蛋白方法在聚電解質刷表面結合的蛋白量為在載體表面單層吸附量的數倍至數十倍，可以有效克服在聚電解質刷上采用直接化學共價固定法固定的蛋白荷載量低且實驗重現(xiàn)性不佳的問題。
[0007]本發(fā)明是通過以下技術方案來解決上述技術問題的:
[0008]本發(fā)明提供了一種利用聚電解質刷固定蛋白的方法，可以在聚電解質刷上實現(xiàn)超高蛋白荷載量的化學共價固定化，包括如下步驟，
[0009]步驟一、將聚電解質刷分散于緩沖液中，將溶有蛋白的緩沖液加入上述聚電解質刷分散液中，混合吸附2小時，蛋白吸附到聚電解質刷上；
[0010]步驟二、離心洗滌聚電解質刷-蛋白復合物2~3次，除去體系中過量的蛋白以及與聚電解質刷表面疏松結合的蛋白，將聚電解質刷-蛋白復合物重新懸浮于緩沖液中制得聚電解質刷-蛋白復合物體系；
[0011]步驟三、向含有聚電解質刷-蛋白復合物的體系中加入化學交聯(lián)試劑，混合后室溫反應2小時；
[0012]步驟四、離心后洗滌聚電解質刷-蛋白復合物2~3次，以除去過量的化學交聯(lián)劑。
[0013]本發(fā)明中，緩沖液優(yōu)選為對所用的聚電解質刷及其擬吸附的蛋白是物理吸附有利的緩沖液。所述的對所用的聚電解質刷及其擬吸附的蛋白是物理吸附有利的緩沖液是指，但不限于，
[0014]以所吸附的蛋白的等電點小于6.0為例，緩沖液的選擇規(guī)則如下:
[0015]針對含有羧酸功能基團的聚電解質刷，緩沖液可以選擇pH=4.0~6.0的MES緩沖液；
[0016]針對含有氨基的聚電解質刷， 緩沖液可以選擇pH=7.0~8.0的磷酸鹽緩沖液；
[0017]針對含有羥基的聚電解質刷，緩沖液可以選擇pH=6.0~8.0磷酸鹽緩沖液；
[0018]針對含有巰基的聚電解質刷時，緩沖液可以選擇pH=6.0~8.0磷酸鹽緩沖液。
[0019]以所吸附的蛋白的等電點大于6.0為例，緩沖液的選擇規(guī)則如下:
[0020]針對含有羧酸功能基團的聚電解質刷，緩沖液可以選擇pH=5.0~7.0的MES緩沖液或磷酸鹽緩沖液；
[0021]針對含有氨基的聚電解質刷，緩沖液可以選擇pH=7.0~9.0的硼酸鹽緩沖液；
[0022]針對含有羥基的聚電解質刷，緩沖液可以選擇pH=6.0~8.0磷酸鹽緩沖液；
[0023]針對含有巰基的聚電解質刷時，緩沖液可以選擇pH=6.0~8.0磷酸鹽緩沖液。
[0024]優(yōu)選的，緩沖液濃度為5mM-10mM，緩沖液中加入0.05%w/v的Tween-20。
[0025]步驟一中，聚電解質刷由固相載體和接枝在載體表面的聚電解質鏈段組成。聚電解質鏈段的一端接枝在載體表面并向外伸展呈現(xiàn)刷子結構。其中，載體可以是平板，或者是粒徑5納米至1000納米的微球，聚電解質為帶有電荷且具有可反應基團的聚合物。
[0026]優(yōu)選地，步驟一中，聚電解質刷為聚丙烯酸球刷或聚N- (2-氨基乙基)丙烯酰胺球刷。
[0027]優(yōu)選地，步驟一中，吸附溫度為25_37°C。
[0028]優(yōu)選地，步驟三中，化學交聯(lián)劑的選擇規(guī)則如下:針對聚丙烯酸等含有羧酸功能基團的聚電解質刷，優(yōu)選化學交聯(lián)劑為I~20mMl-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDC)的水溶液；針對含有氨基的聚電解質刷，優(yōu)選化學交聯(lián)劑為戊二醛水溶液；針對含有羥基的聚電解質刷，優(yōu)選化學交聯(lián)劑為高碘酸鈉水溶液；針對含有巰基的聚電解質刷時，優(yōu)選化學交聯(lián)劑為馬來酰亞胺試劑。
[0029]步驟四中，洗滌聚電解質刷-蛋白復合物的洗滌液優(yōu)選但不限于，與生理環(huán)境相似的等滲溶液，如PBS、生理鹽水、Tris-HCl等。
[0030]本發(fā)明的一個優(yōu)選地實施路線為，將聚電解質刷置于對蛋白物理吸附有利的合適的pH和鹽濃度的水溶液中，將過量的蛋白溶解在相同的水溶液中加入上述聚電解質刷的體系中，在合適的溫度下恒溫混合2小時，使蛋白吸附到聚電解質刷上。用聚電解質球刷吸附蛋白所用的水溶液洗滌聚電解質刷-蛋白復合物2~3次，除去體系中過量的蛋白以及與聚電解質刷表面疏松結合的蛋白。向含有聚電解質刷-蛋白復合物的體系中加入可使聚電解質刷上的功能基團與蛋白進行化學共價交聯(lián)反應的含有化學交聯(lián)試劑的水溶液混合后室溫反應2小時。所述的水溶液和聚電解質刷吸附蛋白所用的水溶液相同。用洗滌液洗滌聚電解質刷-蛋白復合物2~3次，以除去過量的化學交聯(lián)劑，最終根據其下游應用所需，將聚電解質刷-蛋白復合物分散在適應其各自下游應用所需的環(huán)境中。
[0031]優(yōu)選地但不限于，所述的聚電解質刷采用的是《膠體與界面科學雜志》2013年第398卷82~87頁發(fā)表的表面引發(fā)RAFT聚合法得到具有可控聚電解質毛刷鏈段厚度、聚電解質鏈段分子量分布窄且球刷粒徑分布小的聚電解質刷。
[0032]在本發(fā)明較佳的實施方式中，所述的物理吸附有利的條件是指具有合適pH、鹽濃度的溶液和合適的吸附溫度。溶液優(yōu)選濃度為10mM，pH=4.0~6.0的MES緩沖液。吸附溫度優(yōu)選為25 °C -37 °C。[0033]在本發(fā)明的具體的實施方式中，所述的化學交聯(lián)試劑是指但不限于，針對聚丙烯酸等含有羧酸功能基團的聚電解質刷，優(yōu)選使用I~20mMl-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDC)的水溶液；針對含有氨基的聚電解質刷，可以選用戊二醛等水溶液；針對含有羥基的聚電解質刷，可以采用高碘酸鈉水溶液；針對含有巰基的聚電解質刷時，可以采用馬來酰亞胺試劑等。
[0034]在本發(fā)明的具體的實施方式中，所需的應用環(huán)境是指結合了蛋白的聚電解質刷在后續(xù)的應用中所需的環(huán)境?？梢允悄M體液環(huán)境的磷酸鹽緩沖液(PBS)生理鹽水或血清、血漿以及全血等生理環(huán)境。
[0035]在上述過程中，最終聚電解質刷上的蛋白化學結合量可以通過BCA蛋白定量法分別測定加入的聚電解質懸浮體系中的蛋白量以及未被結合到聚電解質球刷上的反應體系上清液和蛋白固定化洗滌過程中洗滌液中的蛋白含量，并通過加入蛋白前后的差減量計算得到。
【具體實施方式】
[0036]下面對本發(fā)明的實施例作詳細說明，本實施例在以本發(fā)明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護范圍不限于下述的實施例。在實施例中，所采用的試劑除另有說明外均為市售商品。
[0037]實施例1
[0038]采用聚丙烯酸球刷對小牛血清白蛋白(BSA蛋白)進行化學固定化。
[0039]首先，采用《膠體與界面科學雜志》2013年第398卷82~87頁發(fā)表的表面引發(fā)RAFT聚合法制備得到球核為100納米的氧化硅，聚電解質毛刷狀鏈段長度為40納米，接枝密度為0.24nm_2的聚丙烯酸電解質球刷。
[0040]采用離心-重懸的方式，將上述球刷用IOmM MES緩沖液(pH=5.0，含有0.05%w/v的Tween-20)洗滌2次，超聲分散在上述緩沖液中。同時，用該緩沖液溶解BSA蛋白配制成蛋白溶液，并加入到含有球刷的分散液中，均勻混合。最終球刷濃度為0.8mg/ml，蛋白濃度為 lmg/ml0
[0041]在25°C烘箱中恒溫孵育2小時，使蛋白充分吸附于聚電解質毛刷鏈段表面。
[0042]離心，棄去上清，并用上述MES緩沖液洗滌產物2次。同時用該緩沖液溶解EDC配制成濃度為5mM的EDC溶液，并加入到含有產物的離心管中，混合均勻。繼續(xù)在25°C培養(yǎng)2小時，使吸附在球刷上的蛋白通過化學鍵連接在球刷上。
[0043]離心，棄去上清，用上述MES緩沖液洗滌產物2次除去過量的EDC，再用IOmM PBS緩沖液(pH=7.2)洗滌產物2次，并將產物分散在PBS中。
[0044]經BCA法測試，用上述方法得到的聚丙烯酸球刷-BSA復合物的蛋白結合量為790 yg BSA/mg球刷，為單層飽和結合量的6倍，且復合物在PBS等條件下能夠穩(wěn)定存在，不存在蛋白釋放現(xiàn)象。
[0045]實施例2
[0046]采用聚丙烯酸球刷對溶菌酶蛋白進行化學固定化。
[0047]采用的聚電解質刷與實施例1中相同。
[0048]采用離心-重懸的方式，將上述球刷用IOmM MES緩沖液(pH=6.0，含有0.05%w/v的Tween-20)洗滌2次，超聲分散在上述緩沖液中。同時，用該緩沖液溶解溶菌酶蛋白配制成蛋白溶液，并加入到含有球刷的分散液中，均勻混合。最終球刷濃度為0.5mg/ml,蛋白濃度為 1.5mg/ml。
[0049]在37°C烘箱中恒溫培養(yǎng)2小時，使蛋白充分吸附于聚電解質刷表面。
[0050]離心，棄去上清，并用上述MES緩沖液洗滌產物2次。同時用該緩沖液溶解EDC配制成濃度為2mM的EDC溶液，并加入到含有產物的離心管中，混合均勻。繼續(xù)在37°C培養(yǎng)2小時，使吸附在球刷上的蛋白通過化學鍵連接在球刷上。
[0051]離心，棄去上清，用上述MES緩沖液洗滌產物2次除去過量的EDC，再用IOmM PBS緩沖液(pH=7.2)洗滌產物2次，并將產物分散在PBS中。
[0052]經BCA法測試，用上述方法得到的聚丙烯酸球刷-BSA復合物的蛋白結合量為2400 μ g BSA/mg球刷，為單層飽和結合量的35倍，且復合物在PBS等條件下能夠穩(wěn)定存在，不存在蛋白釋放現(xiàn)象。
[0053]實施例3
[0054]采用聚N- (2-氨基乙基)丙烯酰胺球刷對BSA蛋白進行化學固定化。
[0055]聚電解質球刷的合成方法與實施例1和2相同，其中，將單體由丙烯酸替換為N- (2-氨基乙基)丙烯酰胺，得到球核為100納米氧化硅，聚電解質毛刷鏈段長度為60納米，接枝密度為0.15nm2的聚丙烯酸電解質球刷。
[0056]球刷的化學固定化方法與實施例2相同，經BCA法測試，得到的聚N- (2_氨基乙基)丙烯酰胺球刷-BSA復合物的蛋白結合量為1500 μ g BSA/mg球刷，為單層飽和結合量的11倍，且復合物在PBS等條件下能夠穩(wěn)定存在，不存在蛋白釋放現(xiàn)象。
[0057]實施例4
[0058]采用硅平板接枝的聚丙烯酸板刷對BSA蛋白進行化學固定化。
[0059]聚電解質板刷的合成方法與實施例1~3基本相同。其中，將聚丙烯酸鏈段固定的載體由IOOnm氧化硅微球改為硅平板，得到聚電解質鏈段長度為100納米，接枝密度為
0.2nm2的聚丙烯酸板刷。
[0060]聚丙烯酸板刷對蛋白的化學固定化方法與實施例2相同，經BCA法測試，得到的聚丙烯酸板刷-BSA復合物的蛋白固定密度為6.0 μ g/cm2，為單層飽和結合量的15倍，且復合物在PBS等條件下能夠穩(wěn)定存在，不存在蛋白釋放現(xiàn)象。
[0061]實施例5
[0062]采用球核為1000納米的聚丙烯酸球刷對BSA蛋白進行化學固定化。
[0063]聚電解質球刷的合成方法與實施例1~4基本相同。其中，將例I~3中的球核由IOOnm氧化硅微球改為IOOOnm氧化硅微球，得到聚電解質鏈段長度為120nm，接枝密度為
0.55nm2的聚丙烯酸球刷。
[0064]球刷對蛋白的化學固定化方法與實施例2相同，經BCA法測試，得到的聚丙烯酸板刷-BSA復合物的蛋白固定密度為450 μ g BSA/mg，為單層飽和結合量的36倍，且復合物在PBS等條件下能夠穩(wěn)定存在,不存在蛋白釋放現(xiàn)象。
[0065]以上詳細描述了本發(fā)明的較佳具體實施例。應當理解，本領域的普通技術無需創(chuàng)造性勞動就可以根據本發(fā)明的構思作出諸多修改和變化。因此，凡本【技術領域】中技術人員依本發(fā)明的構思在現(xiàn)有技術的基礎上通過邏輯分析、推理或者有限的實驗可以得到的技術.方案，皆應在由權利要求書所確定的保護范圍內。
【權利要求】
1.一種利用聚電解質刷固定蛋白的方法，包括如下步驟: 步驟一、將聚電解質刷分散于緩沖液中，將溶有蛋白的緩沖液加入上述聚電解質刷分散液中，混合吸附2小時，蛋白吸附到聚電解質刷上； 步驟二、離心洗滌聚電解質刷-蛋白復合物2~3次，除去體系中過量的蛋白以及與聚電解質刷表面疏松結合的蛋白，將聚電解質刷-蛋白復合物重新懸浮于緩沖液中制得聚電解質刷-蛋白復合物體系； 步驟三、向含有聚電解質刷-蛋白復合物的體系中加入化學交聯(lián)劑，混合后室溫反應2小時； 步驟四、離心后洗滌聚電解質刷-蛋白復合物2~3次，以除去過量的化學交聯(lián)劑；所述步驟一中，聚電解質刷由固相載體和接枝在載體表面的聚電解質鏈段組成，聚電解質鏈段的一端接枝在載體表面并向外伸展呈現(xiàn)刷子結構，其中，載體為平板，或者為粒徑5nm-1000nm的微球，聚電解質鏈段為帶有電荷且具有可反應基團的聚合物。
2.如權利要求1所述的方法，其中，所述緩沖液選擇方法如下， 當所吸附的蛋白的等電點小于6.0時: 針對含有羧酸功能基團的聚電解質刷，選擇PH=4.0~6.0的MES緩沖液； 針對含有氨基的聚電解質刷，選擇PH=7.0~8.0的磷酸鹽緩沖液； 針對含有羥基的聚電解質刷，選擇PH=6.0~8.0磷酸鹽緩沖液； 針對含有巰基的聚電解質刷，選擇pH=6.0~8.0磷酸鹽緩沖液；或者 當所吸附的蛋白的等電點大于6.0時: 針對含有羧酸功能基團的聚電解質刷，選擇pH=5.0~7.0的MES緩沖液或磷酸鹽緩沖液； 針對含有氨基的聚電解質刷，選擇PH=7.0~9.0的硼酸鹽緩沖液； 針對含有羥基的聚電解質刷，選擇PH=6.0~8.0磷酸鹽緩沖液； 針對含有巰基的聚電解質刷，選擇PH=6.0~8.0磷酸鹽緩沖液。
3.如權利要求2所述的方法，其中，所述緩沖液濃度為5mM-10mM，所述緩沖液中加入0.05%w/v 的 Tween-20。
4.如權利要求1所述的方法，其中，步驟一中，聚電解質刷為，聚丙烯酸刷或聚N-(2-氨基乙基)丙烯酰胺刷。
5.如權利要求1所述的方法，其中，步驟一中，吸附溫度為25-37°C。
6.如權利要求1所述的方法，其中，步驟三中，化學交聯(lián)劑的選擇規(guī)則如下: 針對含有羧酸功能基團的聚電解質刷，化學交聯(lián)劑為1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDC)水溶液； 針對含有氨基的聚電解質刷，化學交聯(lián)劑為戊二醛水溶液； 針對含有羥基的聚電解質刷，化學交聯(lián)劑為高碘酸鈉水溶液； 針對含有巰基的聚電解質刷時，化學交聯(lián)劑為馬來酰亞胺試劑。
7.如權利要求1所述的方法，其中，步驟四中，洗滌聚電解質刷-蛋白復合物的洗滌液為與生理環(huán)境相似的等滲溶液。
8.如權利要求7所述的方法，其中，所述等滲溶液為PBS緩沖液、生理鹽水或Tris-HCl緩沖液。
9.如權利要求1所述 的方法，其中，所述蛋白為小牛血清白蛋白或溶菌酶蛋白。
【文檔編號】C07K17/08GK103467603SQ201310447554
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年9月26日 優(yōu)先權日:2013年9月26日
【發(fā)明者】徐宏, 瞿振元, 古宏晨 申請人:上海交通大學