以二氧化鈦為固相對(duì)樣品中核苷的萃取方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種基于二氧化鈦材料對(duì)核苷的吸附方法。該方法利用二氧化鈦材料對(duì)順式二醇結(jié)構(gòu)的親和作用，通過(guò)固相萃取模式，實(shí)現(xiàn)快速、高效吸附生物樣品中大量存在的正常核苷類物質(zhì)的目的。與目前廣泛應(yīng)用的傳統(tǒng)酶解法除核苷相比，該方法體現(xiàn)出成本低、速度快、特異性高的優(yōu)勢(shì)。
【專利說(shuō)明】以二氧化鈦為固相對(duì)樣品中核苷的萃取方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種以二氧化鈦為固相對(duì)正常核苷(腺苷、胞苷、尿苷、尿苷)的萃取方法，屬于樣品預(yù)處理技術(shù)。
【背景技術(shù)】
[0002]DNA/RNA的修飾與人體的各項(xiàng)生理過(guò)程息息相關(guān)，對(duì)其的研究一直是相關(guān)學(xué)科的重點(diǎn)。而在體內(nèi)，由于正常核苷的豐度較高，容易干擾2’ -脫氧核苷及2’ -O修飾的核苷的檢測(cè)。在分析2’-脫氧核苷前，通常采用預(yù)酶解RNA、沉淀DNA的步驟以降低最終樣品中正常核苷的含量。而這種酶解法包含一系列多步處理過(guò)程(如RNase酶酶解、苯酚/氯仿溶液萃取、異丙醇低溫沉淀、清洗復(fù)溶等)，需要近12個(gè)小時(shí)的處理時(shí)間。另外，頻繁的樣品轉(zhuǎn)移與溶劑交換導(dǎo)致樣品回收率降低、重現(xiàn)性變差。而且，實(shí)際上，該方法去除核苷的效率并不高。另外，對(duì)于分析2’ -O修飾的核苷，目前還未出現(xiàn)有效去除水解RNA時(shí)共生成的正常核苷的手段。
[0003]二氧化鈦是一種常見(jiàn)的金屬氧化物材料，價(jià)格低廉、用途廣泛。這類材料對(duì)于含有順式羥基結(jié)構(gòu)的物質(zhì)具有獨(dú)特的親和能力，相關(guān)研究一直是光催化領(lǐng)域的熱點(diǎn)。相對(duì)于2’_脫氧核苷及2’-0修飾的核苷，正常核苷戊糖基團(tuán)上存在有一對(duì)順勢(shì)羥基。我們利用該結(jié)構(gòu)與二氧化鈦間的特異性作用，以各種形式的二氧化鈦材料為吸附介質(zhì)，達(dá)到除去生物樣品中高豐度正常核苷的目的。這種以二氧化鈦材料特異性吸附核苷的概念和方法為本專利首次提出。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的問(wèn)題在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種步驟少、效率高的去除樣品中正常核苷的前處理方法。
[0005]為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明利用二氧化鈦材料對(duì)樣品中正常核苷的特異性萃取，達(dá)到在檢測(cè)2’ -脫氧核苷及2’ -O修飾的核苷前，除去樣品中存在的大量正常核苷的目的。
[0006]具體方案為:
將DNA或RNA樣品溶于水中，通過(guò)二氧化鈦柱，然后用水淋洗，所得洗脫液中不含核苷；或者將DNA或RNA樣品溶于水中，溶解液和二氧化鈦混合，渦旋15分鐘以上,然后離心分離，所得清液不含核苷。
[0007]上述的二氧化鈦，粒徑為20微米到40微米。
[0008]上述的二氧化鈦，可以包覆于其他材料的表面，如TiO2包裹SiO2材料。
[0009]各種形式的二氧化鈦材料均可以用于相關(guān)處理過(guò)程，如納米顆粒、纖維、薄膜、微球、粉末、涂層等等。吸附形式亦有多種選擇，如固相萃取，分散固相萃取等。經(jīng)過(guò)測(cè)定，樣品中正常核苷濃度在較寬的范圍內(nèi)均可以得到有效去除(如500μ g/mL)，符合各種實(shí)際樣品中應(yīng)用的要求?！緦＠綀D】

【附圖說(shuō)明】
[0010]圖1為本發(fā)明中涉及到的固相萃取流程示意圖。
[0011]圖2為實(shí)施例1中涉及到的LC-UV色譜分析圖。(I)為4種正常核苷及4種脫氧核苷混合樣品直接進(jìn)樣分析結(jié)果；(II)為4種正常核苷及4種脫氧核苷混合樣品經(jīng)過(guò)TiO2固相萃取后分析結(jié)果。
[0012]圖3為實(shí)施例2中涉及到的LC-UV色譜分析圖。(I)為腺苷及2’ -脫氧腺苷混合樣品直接進(jìn)樣分析結(jié)果；(II)為利用商品化的TiO2納米顆粒對(duì)樣品進(jìn)行分散固相萃取后的分析結(jié)果；(III)為利用液相沉積法制備的TiO2包裹SiO2材料對(duì)樣品進(jìn)行分散固相萃取后的分析結(jié)果；(IV)為利用實(shí)施例1中使用的TiO2粉末對(duì)樣品進(jìn)行分散固相萃取后的分析結(jié)果。
[0013]圖4為實(shí)施例3中涉及到的正常核苷的LC-MS/MS選擇離子流圖。(A)腺苷；(B)尿苷；(C)胞苷；(D)鳥(niǎo)苷。(I)為酵母樣品直接分析結(jié)果；(II)為酵母樣品利用傳統(tǒng)酶解法處理一次后分析結(jié)果；(III)為酵母樣品利用傳統(tǒng)酶解法處理兩次后分析結(jié)果；(IV)為利用TiO2固相萃取后分析結(jié)果。
[0014]圖5為實(shí)施例3中涉及到的2’-脫氧核苷的LC-MS/MS選擇離子流圖。(A)2’_脫氧腺苷；(B)胸苷；(C) 2’ -脫氧胞苷；(D) 2’ -脫氧鳥(niǎo)苷。(I)為酵母樣品直接分析結(jié)果；
(II)為酵母樣品利用傳統(tǒng)酶解法處理一次后分析結(jié)果；(III)為酵母樣品利用傳統(tǒng)酶解法處理兩次后分析結(jié)果；(IV)為利用TiO2固相萃取后分析結(jié)果。
[0015]圖6為實(shí)施例4中涉及到的正常核苷及2’ -O修飾核苷的LC-MS/MS選擇離子流圖。(A)為宮頸癌細(xì)胞樣品直接分析結(jié)果；(B)為宮頸癌細(xì)胞樣品利用TiO2固相萃取后分析結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0016]1.TiO2粉末的制備
O° C下混合冰醋酸(0.lg)、水(Ig)及乙醇(25g)。將鈦酸四丁酯(IOg)加入其中，混合均勻。將此混合溶液置于40° C下反應(yīng)10小時(shí)。生成的白色凝膠分別用乙醇和水進(jìn)行清洗，在30° C下充分干燥。所得固體經(jīng)研磨和篩分得到20-40 μ m顆粒，用于后續(xù)固相萃取及分散固相萃取實(shí)驗(yàn)。
[0017]2.商品化TiO2納米顆粒購(gòu)于阿拉丁試劑(T104936)。
[0018]3.液相沉積TiO2包裹SiO2材料的制備
首先，二氧化硅微球經(jīng)稀鹽酸和去離子水清洗后在真空環(huán)境下烘干。然后，干燥后的硅膠分散于100 mL 0.1 M (NH4)2TiF60.3 M H3BO3溶液中。懸濁液在真空環(huán)境下保持I h后，于35 ° C下震蕩16 h。最后，得到的復(fù)合微球經(jīng)去離子水清洗后置于120 ° C干燥4 h。制備所得復(fù)合微球置于馬弗爐中，以I ° C/min的速度升溫至300 ° C并保持2 h。
[0019]4.細(xì)胞中的DNA/RNA利用相應(yīng)商品化試劑盒(如DNAiso reagent)進(jìn)行提取。
[0020]5.傳統(tǒng)酶解法除樣品中正常核苷(即除DNA中的RNA污染)步驟
6.150 μ L 提取的 DNA (100μg)中加入 2 μ L RNase Tl (25 unit/μ L)及 10 μ LRNase A (10 mg/mL)后置于37°C下孵育6小時(shí)。利用等體積的苯酹/氯仿(1: 1，v/v)及氯仿分別萃取兩次后，取水層加入15 μ L醋酸鈉溶液(3Μ，pH 5.2)和150 μ L冰異丙醇混勻。在-20°C下保存30分鐘后，4°C下離心15分鐘得到DNA沉淀。用70%乙醇清洗三次后，于室溫下自然干燥，利用tris-HCl (pH 8.0)復(fù)溶。總耗時(shí)約12小時(shí)。
[0021]7.DNA/RNA 水解
提取的DNA/RNA首先于95°C下加熱5分鐘，然后在冰浴中淬火2分鐘。然后加入1/10體積比的緩沖液(30 mM CH3COONa, pH 4.6，280 mM NaCl, I mM ZnSO4)及 SI nuclease(600 units)。將上述溶液(20yL)置于37°C下孵育2小時(shí)后，加入2yL緩沖液(50mMTris-HCl, 10 mM MgCl2, pH 9.0)及 venom phosphodiesterase I (0.02 units)和喊性磷酸酶(30 units)，繼續(xù)孵育2小時(shí)。所得溶液利用等體積的苯酚/氯仿(1:1，v/v)及氯仿分別萃取后，取水層干燥即可。
[0022]8.萃取過(guò)程
TiO2固相萃取:制得的TiO2粉末(75mg)填充于ImL注射器內(nèi)，兩端利用聚丙烯篩板固定(如圖1)。樣品溶解于80 μ L純水中以40 μ L/min流速進(jìn)行上樣。完成上樣后，用320 μ L純水進(jìn)行清洗(200 μ L/min)。合并上樣流出液及清洗流出液即可進(jìn)行后續(xù)LC-UV及LC-MS分析。萃取過(guò)程耗時(shí)約5分鐘。
[0023]分散固相萃取:將TiO2粉末、商品化TiO2納米顆?；蛞合喑练eTiO2包裹SiO2材料(IOmg)加入100 μ L腺苷及2’ -脫氧腺苷混合溶液(I μ g/mL)中，渦旋15分鐘后，10000轉(zhuǎn)離心5分鐘取上層清液進(jìn)行LC-UV分析。
[0024]9.分析條件
實(shí)施例1 和 2 中使用的色譜柱為 Hisep C18 (150mm x 4.6mm 1.d., 5 μ m, WeltechC0., Ltd.)。流動(dòng)相為5mM甲酸/甲醇(93/7，v/v)。流速為lmL/min。檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm。進(jìn)樣體積為5μ L。
[0025]實(shí)施例3和 4 中使用的色譜柱為 Hisep C18-T column (150 mm x 2.1 mm 1.d.，5μ m, Weltech C0., Ltd.)。流速為 0.2mL/min。實(shí)施例 3 中使用的梯度為:5min 5%B, 20min5-50%B,5min 50%B, IOmin 5%B ;實(shí)施例 4 中使用的梯度為:15min 5%B,5min 5_15%B, IOmin5%B (A為5mM甲酸銨溶液、B為甲醇)。
[0026]以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的介紹。
[0027]實(shí)施例1:標(biāo)準(zhǔn)樣品中核苷的萃取
配制4種核苷(腺苷、尿苷、胞苷、鳥(niǎo)苷)及4種2’ -脫氧核苷(2’ -脫氧腺苷、2’ -脫氧尿苷、2’ -脫氧胞苷、2’ -脫氧鳥(niǎo)苷)的混合溶液(I μ g/mL)，進(jìn)行TiO2固相萃取后分析。結(jié)果如圖2所示。與直接進(jìn)樣分析(0.2 μ g/mL)相比，經(jīng)過(guò)Ti02萃取后，4種核苷的信號(hào)均完全消失，僅余4種2’ -脫氧核苷信號(hào)，說(shuō)明制備的TiO2粉末對(duì)于核苷有良好的萃取效果。
[0028]實(shí)施例2:不同TiO2材料對(duì)核苷的萃取
配制腺苷及2’-脫氧腺苷的混合溶液(I μ g/mL),分別利用商品化的TiO2納米顆粒、液相沉積法制備的TiO2包裹SiO2材料和實(shí)施例1中的TiO2粉末對(duì)樣品進(jìn)行分散固相萃取后分析。結(jié)果如圖3所示。與直接進(jìn)樣分析相比，經(jīng)過(guò)萃取后，對(duì)于所有實(shí)驗(yàn)組，腺苷的信號(hào)都有不同程度的下降。說(shuō)明3種不同制備方法得到的TiO2材料對(duì)于核苷均有明顯的萃取效果。說(shuō)明了本發(fā)明對(duì)于各類TiO2材料的普適性。
[0029]實(shí)施例3:利用TiO2材料吸附酵母細(xì)胞提取的DNA酶解物中的正常核苷，以檢測(cè)其中的2’ -脫氧核苷 將不同方法處理后的酵母細(xì)胞DNA酶解物溶于水中，進(jìn)行LC-MS分析。正常核苷的選擇離子流圖如圖4。即使經(jīng)過(guò)兩次傳統(tǒng)酶解法的處理，仍然有明顯的核苷殘留(4%到21%);而經(jīng)過(guò)TiO2固相萃取后，所有核苷得以有效除去(均低于2%)。2’-脫氧核苷的選擇離子流圖如圖5。經(jīng)過(guò)兩次酶解法處理后，2’ -脫氧核苷回收率相對(duì)較低(50%到62%);而TiO2固相萃取對(duì)2’ -脫氧核苷的回收率影響較小(70%到97%)。以上結(jié)果說(shuō)明本發(fā)明所涉及TiO2材料吸附核苷方法相比于傳統(tǒng)酶解方法具有吸附效果好、特異性高、速度快的優(yōu)勢(shì)。
[0030]實(shí)施例4:利用TiO2材料吸附宮頸癌細(xì)胞提取的RNA酶解物中的正常核苷，以檢測(cè)其中的2’ -O甲基化的核苷
將宮頸癌細(xì)胞提取的RNA酶解物溶于水中，經(jīng)過(guò)TiO2固相萃取后，進(jìn)行LC-MS分析。結(jié)果如圖6所示。當(dāng)直接進(jìn)樣分析時(shí)，譜圖中的主要信號(hào)為樣品中較高濃度的正常核苷；而經(jīng)過(guò)TiO2固相萃取后，所有正常核苷均得以有效除去，譜圖中僅余2’-0甲基化核苷信號(hào)。此結(jié)果說(shuō)明了本發(fā)明所涉及TiO2材料吸附核苷方法適用于在檢測(cè)2’ -O修飾的核苷前，有效去除體系中的正常核苷干擾。
【權(quán)利要求】
1.一種以二氧化鈦為固相對(duì)核苷的萃取方法,其特征在于， 將DNA或RNA樣品溶于水中，通過(guò)二氧化鈦柱，然后用水淋洗，所得洗脫液中不含核苷；或者將DNA或RNA樣品溶于水中，溶解液和二氧化鈦混合，渦旋15分鐘以上,然后離心分離，所得清液不含核苷。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的萃取方法，其特征在于，上述的二氧化鈦，粒徑為20微米到40微米。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的萃取方法，其特征在于，所述二氧化鈦材為顆粒、纖維、薄膜、微球或粉末。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的萃取方法，其特征在于，所述的二氧化鈦，包覆于其他材料的表面。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的萃取方法，其特征在于，所述的二氧化鈦，為T(mén)iO2包裹SiO2材料。
【文檔編號(hào)】C07H1/06GK103439174SQ201310426856
【公開(kāi)日】2013年12月11日 申請(qǐng)日期:2013年9月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月18日
【發(fā)明者】馮鈺锜, 王少亭 申請(qǐng)人:武漢大學(xué)