棉花同源結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子基因GbHDTF1及應(yīng)用的制作方法【專利摘要】本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，涉及從海島棉中分離得到一個(gè)調(diào)控棉花內(nèi)源抗病相關(guān)激素茉莉酸合成和響應(yīng)的基因GbHDTF1。該基因的cDNA序列如SEQ?ID?NO：1所示；其編碼蛋白質(zhì)的序列如SEQ?ID?NO：2所示。還公開了含有SEQ?ID?NO.1所示序列的基因的表達(dá)載體，通過(guò)表達(dá)由上述核酸序列形成的雙鏈核酸分子并用于抑制棉花內(nèi)源基因GbHDTF1的表達(dá)以促進(jìn)茉莉酸的合成及響應(yīng)。提供了含有表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，其包括大腸桿菌和農(nóng)桿菌。GbHDTF1基因具有調(diào)控棉花內(nèi)源抗病相關(guān)激素茉莉酸合成和響應(yīng)的功能，通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化可應(yīng)用于抗黃萎病棉花新材料的培育?！緦＠f(shuō)明】棉花同源結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子基因GbHDTFI及應(yīng)用【
技術(shù)領(lǐng)域：
】[0001]本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域。具體涉及ー種棉花同源結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子基因GbHDTFl的克隆及在控制棉花黃萎病中的應(yīng)用。本發(fā)明通過(guò)采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的方法，對(duì)棉花抗黃萎病反應(yīng)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄組分析，分離克隆的GbHDTFl基因?yàn)檎{(diào)控棉花抗病相關(guān)激素茉莉酸合成及響應(yīng)的基因，能影響棉花對(duì)黃萎病的抗性。【
背景技術(shù)：
】[0002]棉花黃萎病被稱為棉花的“癌癥”，是由大麗輪枝菌和黑白輪枝菌引起的土傳真菌維管束病害。病原菌通過(guò)棉花根部侵染，引起葉片失綠變黃，萎蔫脫落，甚至造成植株死亡，嚴(yán)重威脅棉花產(chǎn)量及纖維品質(zhì)。棉花黃萎病于1914年在美國(guó)被首次發(fā)現(xiàn)后，很快蔓延到世界上其他產(chǎn)棉國(guó)。隨著1935年從美國(guó)引種棉花黃萎病傳入中國(guó)，20世紀(jì)50-60年代在部分省份造成危害，20世紀(jì)90年代后，該病已經(jīng)蔓延到全國(guó)各棉區(qū)，是目前危害我國(guó)棉花生產(chǎn)的主要病害之一，對(duì)棉花常年造成減產(chǎn)10-20%，嚴(yán)重時(shí)部分地區(qū)發(fā)病高達(dá)70%(簡(jiǎn)桂良等，CurrentstatusandcountermeasureofVerticilliumwiltofcottoninChina.中國(guó)棉花，2003，(3):13-14)。近年來(lái)棉花黃萎病在我國(guó)發(fā)生日趨嚴(yán)重，特別是在黃河流域和新疆等主要棉產(chǎn)區(qū)大面積發(fā)生。長(zhǎng)期的植物生產(chǎn)實(shí)踐表明選育和種植抗病棉花品種是防治棉花黃萎病的高效措施。但由于陸地棉抗黃萎病資源缺乏及田間抗病性鑒定結(jié)果受多種環(huán)境因素影響，傳統(tǒng)育種方法選育抗黃萎病品種進(jìn)展緩慢，因此生產(chǎn)上還沒(méi)有高抗棉花黃萎病的品種大面積推廣應(yīng)用。[0003]同源盒基因家族是ー類廣泛存在于各種真核生物體內(nèi)的同源結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子，參與生物體的生長(zhǎng)發(fā)育和對(duì)環(huán)境的響應(yīng)。同源盒基因編碼的蛋白都包含ー個(gè)由60個(gè)氨基酸組成的DNA結(jié)合區(qū)域,稱為同源結(jié)構(gòu)域或同源框(Homeodomain,HD)。同源結(jié)構(gòu)域在三維結(jié)構(gòu)上形成3個(gè)相鄰的a螺旋，其中第二個(gè)和第三個(gè)螺旋形成ー個(gè)螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu)。根據(jù)氨基酸序列的相似性，植物體內(nèi)的同源結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子可以分為14類(R.Derelle1P.Lopez,Homeodomainproteinsbelongtotheancestralmoleculartoolkitoieukaryotes.EvolDev，2007，(9):212-219)。[0004]茉莉酸(JA)是ー種脂肪酸源的信號(hào)分子，參與了植物花粉和種子的發(fā)育，以及對(duì)傷ロ、臭氧、昆蟲和病原微生物的防御反應(yīng)(CreelmanRA,MulletJE.Biosyntnesisandactionofjasmonatesinplants.AnnRevPlantPhysio丄PlantMolBiolj1997，(48):355-381)。茉莉酸和乙烯(ET)參與不依賴SA的防衛(wèi)反應(yīng)。在這ー過(guò)程中硫素(thionin，Thil.2，一種含半胱氨酸的植物抗病蛋白)和防衛(wèi)素(defensin，PDF1.2)會(huì)被誘導(dǎo)表達(dá)。PDF1.2受JA、ET和非寄主病原真菌(Alternariabrassicola)的誘導(dǎo)表達(dá)，但不受SA的誘導(dǎo)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)在nprl和cprl(constitutivePRl)突變體中及NahG轉(zhuǎn)基因植株中PDF1.2的表達(dá)都不受影響，而在ein2和coil(coronatineinsensitivel)突變體中表達(dá)受到抑制，這些突變體對(duì)JA和ET是不敏感的。而11.2和1.2的表達(dá)模式相同。說(shuō)明Thil.2和TOF1.2參與依賴JA和ET的系統(tǒng)抗病途徑是不同于依賴SA的SAR途徑，PDF1.2的表達(dá)需同時(shí)依賴于JA和ET(ReymondP，F(xiàn)armerEE,Jasmonateandsalicylateasglobalsignalsfordefensegeneexpression.CurrOpinPlantBiol,1998，(I):404-411)。[0005]雖然在擬南芥及水稻中克隆到了許多茉莉酸相關(guān)的基因，但目前對(duì)于棉花，茉莉酸合成及其詳細(xì)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)仍不是很清楚。本發(fā)明證明了GbHDTFl能參與調(diào)控棉花體內(nèi)茉莉酸的合成以及下游信號(hào)的傳遞，從而參與棉花抗黃萎病。申請(qǐng)人:認(rèn)為利用本發(fā)明的基因可通過(guò)調(diào)控激素響應(yīng)來(lái)影響棉花對(duì)黃萎病菌的抗性，對(duì)創(chuàng)制抗黃萎病的棉花材料具有極其重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0006]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，在前期研究工作中通過(guò)對(duì)海島棉(Gossypiumbarbadense)受黃萎病菌(Verticilliumdahliae)誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析的基礎(chǔ)上，克隆ー個(gè)可能參與棉花抗黃萎病反應(yīng)的基因。通過(guò)氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)其具有同源結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子的特征，我們將該基因命名為GbHDTFl基因。通過(guò)病毒誘導(dǎo)的基因沉默(virus-1nducedgenesilencing,VIGS)技術(shù),在陸地棉(Gossypiumhirsutum)中沉默GbHDTFl基因，表明該基因可調(diào)控棉花抗病激素茉莉酸(JA)合成及相關(guān)信號(hào)路徑，并增強(qiáng)棉花對(duì)黃萎病菌的抗性。[0007]本發(fā)明的另ー個(gè)目的在于提供了ー種用GbHDTFl基因進(jìn)行高效轉(zhuǎn)化棉花的方法。還提供了ー種含有SEQIDNO:1所示序列基因的表達(dá)載體，該載體通過(guò)表達(dá)由上述核酸序列形成的雙鏈核酸分子并用于抑制棉花內(nèi)源基因GbHDTFl的表達(dá)。本發(fā)明還提供了ー種含有以上表達(dá)載體的宿主細(xì)胞,所述的宿主細(xì)胞包括大腸桿菌和農(nóng)桿菌。[0008]本發(fā)明再ー個(gè)目的是在于提供了ー種棉花同源結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子GbHDTFl在控制棉花抗黃萎病中的應(yīng)用，即通過(guò)調(diào)控GbHDTFl基因在棉花植株中的表達(dá)來(lái)達(dá)到調(diào)控棉花茉莉酸的合成和響應(yīng)，從而應(yīng)用于棉花抗黃萎病品系的培育。[0009]本發(fā)明GbHDTFl基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主是棉花，可用于培育抗黃萎病的棉花品系和品種。[0010]實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)方案如下所述:[0011]本發(fā)明是申請(qǐng)人:前期工作是研究海島棉‘海7124’接種黃萎病菌后根部轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的數(shù)據(jù)(徐理等，LigninmetabolismhasacentralroleintheresistanceofcottontothewiltfungusVerticilliumdahliaeasrevealedbyRNA—Seq-dependenttranscriptionalanalysisandhistochemistry.JExpBot,2011,(62):5607-5621),發(fā)現(xiàn)ー個(gè)在接種黃萎病菌后表達(dá)下調(diào)的基因。將此基因利用半定量PCR(RT-PCR)鑒定表明該基因在抗病的海島棉‘海7124’中具有組織表達(dá)特異性，在子葉、真葉和纖維中優(yōu)勢(shì)表達(dá)(圖1A)。該基因在葉片接種黃萎病菌‘V991’(中國(guó)農(nóng)科院植物保護(hù)所簡(jiǎn)桂良副研究員惠贈(zèng))和灰霉病菌(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)李國(guó)慶教授惠贈(zèng))后與接水的對(duì)照相比表現(xiàn)出下調(diào)模式(圖1B)，并且在噴施植物抗病信號(hào)分子水楊酸和茉莉酸甲酯之后，相對(duì)與噴施無(wú)水こ醇的對(duì)照分別表現(xiàn)出被誘導(dǎo)和被抑制的表達(dá)，而其他激素(包括赤霉素、生長(zhǎng)素和こ烯利)處理后，相對(duì)于水處理的對(duì)照GbHDTFl基因表達(dá)沒(méi)有變化(圖1C)。[0012]在海島棉‘海7124’的總DNA、RNA中擴(kuò)增得到GbHDTFl的DNA、cDNA和ORF序列。ー種棉花同源結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子基因，其序列為SEQIDNO:1所示的核苷酸序列，序列長(zhǎng)度為1044bp。[0013]通過(guò)氨基酸序列比對(duì)確定SEQIDNO:1所編碼的氨基酸序列SEQIDN0:2具有同源結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)特征(圖2)。因此我們認(rèn)為這個(gè)序列為ー個(gè)同源結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子基因，將該基因命名為GbHDTFl。[0014]本發(fā)明還提供了棉花同源結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子基因GbHDTFl在控制棉花抗黃萎病中的應(yīng)用，其應(yīng)用方法是:[0015]在將TRV-GbHDTFl載體利用農(nóng)桿菌接種生長(zhǎng)2周的陸地棉品系‘YZ1’(Jin,Identificationofanovelelitegenotypeforinvitrocultureandgenetictransformationofcotton.BiologiaPlantarum,2006，50:519-524)。經(jīng)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化3周后對(duì)沉默棉花植株分單株提取葉片和根部的RNA，對(duì)沉默棉花植株進(jìn)行GbHDTFl的表達(dá)量分析。表達(dá)分析顯示GbHDTFl沉默的棉花幼苗中GbHDTFl基因的表達(dá)相對(duì)對(duì)照植株明顯下降(圖4A)。[0016]將GbHDTFl沉默后的棉花幼苗用于棉花黃萎病菌接種處理。通過(guò)對(duì)照植株和GbHDTFl基因沉默植株接種后植株表型和發(fā)病情況統(tǒng)計(jì)進(jìn)行分析，表明GbHDTFl基因沉默之后棉花對(duì)黃萎病菌的抗性顯著提高，表現(xiàn)為具有黃萎病病癥的棉株明顯減少(圖4B)。病指和發(fā)病率的統(tǒng)計(jì)也表明發(fā)病植株的發(fā)病程度在GbHDTFl基因沉默植株中的顯著降低(圖4C)。通過(guò)以上分析說(shuō)明轉(zhuǎn)GbHDTFl基因沉默棉花的抗病性與GbHDTFl表達(dá)量降低相關(guān)聯(lián)。[0017]此外，利用QRT-PCR方法對(duì)GbHDTFl沉默棉花植株和對(duì)照植株中的茉莉酸信號(hào)路徑的標(biāo)志基因GbLOXl，Gb0PR3,GbAOS,GbMYC2,GbJAZl,GbJAZ3和GbJAZ6的表達(dá)量進(jìn)行了分析(圖5A)，結(jié)果表明GbHDTFl基因沉默之后能激活棉花茉莉酸的合成和響應(yīng)相關(guān)的信號(hào)路徑。利用對(duì)照植株和GbHDTFl基因沉默植株葉片提取激素，并進(jìn)行激素含量測(cè)定，發(fā)現(xiàn)GbHDTFl基因沉默茉莉酸含量上升。證明在棉花中沉默GbHDTFl基因?qū)岳蛩岬暮铣梢约跋掠雾憫?yīng)有正向調(diào)控作用。因此GbHDTFl基因可能是ー個(gè)負(fù)調(diào)控棉花體內(nèi)茉莉酸合成的基因，通過(guò)調(diào)控GbHDTFl基因表達(dá)水平可以影響棉花抗黃萎病，對(duì)培育棉花抗黃萎病品系具有重要意義。[0018]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn):[0019]從抗病的海島棉‘海7124’受黃萎病菌誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄組中鑒定了參與棉花抗黃萎病反應(yīng)的基因GbHDTFl，并對(duì)其完成了分離克隆、功能驗(yàn)證和應(yīng)用。GbHDTFl基因編碼的蛋白質(zhì)具有同源結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子的典型特征。GbHDTFl基因具有負(fù)調(diào)控茉莉酸合成及響應(yīng)的功能，通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化可應(yīng)用于棉花抗黃萎病品系的培育，同時(shí)可作為棉花抗黃萎病反應(yīng)的標(biāo)志基因。[0020]1.本發(fā)明克隆GbHDTFl基因?qū)γ藁ㄜ岳蛩岷铣珊晚憫?yīng)有顯著影響，這對(duì)闡明GbHDTFl的生物學(xué)功能和進(jìn)ー步研究植物茉莉酸和合成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)有重要意義。[0021]2.抑制表達(dá)GbHDTFl的棉花能顯著增強(qiáng)對(duì)黃萎病菌的抗性，同時(shí)提高茉莉酸合成和響應(yīng)信號(hào)路徑的相關(guān)基因表達(dá)量，這說(shuō)明GbHDTFl基因?qū)γ藁ㄜ岳蛩岬暮铣杉绊憫?yīng)影響很明顯，通過(guò)基因工程技術(shù)精確調(diào)控GbHDTFl基因的表達(dá)量能夠控制棉花體內(nèi)茉莉酸的合成。[0022]3.茉莉酸的合成調(diào)控直接影響植物抗病性，通過(guò)基因工程技術(shù)精確調(diào)控GbHDTFl基因的表達(dá)量能夠起到控制棉花茉莉酸合成的目的，GbHDTFl基因的克隆將有助于棉花抗黃萎病材料的創(chuàng)制。[0023]4.選育抗病的棉花材料一直為棉花育種家所重視,調(diào)控棉花茉莉酸合成響應(yīng)基因的發(fā)現(xiàn)和利用將有助于解決生產(chǎn)上棉花抗黃萎病性差的難題。由于目前生產(chǎn)上黃萎病發(fā)生造成的棉花產(chǎn)量損失巨大，使得選育抗黃萎病的品種顯得尤其重要，GbHDTFl基因的克隆和功能驗(yàn)證將有助于培育高抗的棉花品種。[0024]5.通過(guò)GbHDTFl基因深入探討棉花茉莉酸合成和響應(yīng)的分子機(jī)理以及茉莉酸在棉花與黃萎病菌互作過(guò)程中的作用具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值?！緦＠綀D】【附圖說(shuō)明】[0025]序列表SEQIDNO:1是本發(fā)明克隆的GbHDTFl基因的核苷酸序列，序列長(zhǎng)度為1044bp。[0026]序列表SEQIDNO:2是GbHDTFl基因編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列，其編碼347個(gè)氨基酸。[0027]圖1為ー種利用RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)GbHDTFl在棉花不同組織、不同病原菌和激素誘導(dǎo)處理情況下的表達(dá)差異。其中:圖1A=GbHDTFl在不同棉花組織中中表達(dá)量的示意圖，該基因子葉、真葉和纖維中表達(dá)量最高。圖1B:用黃萎病菌和灰霉病菌接種后GbHDTFl在葉片中下調(diào)表達(dá)。圖1C=GbHDTFl在生長(zhǎng)素、赤霉素和こ烯利處理下無(wú)變化。在水楊酸、茉莉酸處理之后GbHDTFl分別表現(xiàn)出上調(diào)和下調(diào)的基因表達(dá)模式。[0028]圖2為ー種采用DNAMAN軟件對(duì)GbHDTFI蛋白質(zhì)序列和擬南芥At0CP3、水稻0sGF14c-1nt、葡萄VvSS0AEB28YD18、蕃茄S1LEFL1032DD01蛋白序列進(jìn)行比對(duì)分析的示意圖。結(jié)果表明GbHDTFl具有PINTO`X類同源結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子的典型特征PINTOX結(jié)構(gòu)域和同源結(jié)構(gòu)域HD。[0029]圖3:是本發(fā)明構(gòu)建的三種質(zhì)粒載體的圖譜，其中:圖3A、圖3B和圖3C分別為一種通過(guò)病毒誘導(dǎo)的基因沉默(virus-1nducedgenesilencing,VIGS)載體構(gòu)建pTRV2-GbHDTFl，RNAi載體pHellsgate4_GbHDTFl和超量表達(dá)載體pK2GW7.0-GbHDTFl的物理圖譜。[0030]圖4為一種通過(guò)VIGS技術(shù)在陸地棉品系‘YZ1’中？幾默該基因之后棉花接種黃委病菌的分析示意圖。[0031]利用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)對(duì)照植株和沉默植株中GbHDTFl表達(dá)量，證實(shí)產(chǎn)生表型的沉默植株體內(nèi)GbHDTFl基因的表達(dá)量在根和葉片中均顯著低于對(duì)照植株(圖4A)，表明沉默植株GbHDTFl基因通過(guò)VIGS技術(shù)被抑制。[0032]通過(guò)傷根接種法接種棉花黃萎病菌‘V991’表明，干涉植株的抗性明顯增強(qiáng)，植株發(fā)病率，病指均顯著低于對(duì)照(圖4B，圖4C)。[0033]圖5為ー種利用QRT-PCR的方法鑒定GbHDTFl的的沉默植株中茉莉酸信號(hào)途徑相關(guān)標(biāo)志基因的表達(dá)變化以及測(cè)定榮莉酸含量變化的不意圖。榮莉酸合成途徑相關(guān)標(biāo)志基因GbLOXl、Gb0PR3和GbAOS，茉莉酸響應(yīng)相關(guān)基因GbMYC2和GbJAZ3的表達(dá)量均高于對(duì)照植株(圖5A)，干涉植物的茉莉酸含量也高于對(duì)照植株(圖5B)。【具體實(shí)施方式】[0034]實(shí)施例1:GbHDTFl基因分離克隆[0035]本發(fā)明申請(qǐng)人:前期工作是研究海島棉‘海7124’(中國(guó)棉花種質(zhì)資源庫(kù)，北京，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，作物品種資源研究所)接種黃萎病菌后根部轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)ー個(gè)在接種黃萎病菌后表達(dá)下調(diào)的基因。[0036]利用已得到的EST序列在棉花D基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中(http://www.phytozome.net/cotton,php)進(jìn)行序列比對(duì)，得到與基因匹配的候選DNA序列，以該DNA序列為模板，設(shè)計(jì)引物GbHDTFl-OE-F(5，GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCCATGGCTTCTGCTTTGTCAGT3’)和GbHDTFl-OE-R(5，GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCACATTGTCATCCCTAAACAGTAAAC3’)，在海島棉‘海7124’的總DNA、cDNA中分別擴(kuò)得GbHDTFl的DNA、cDNA和ORF序列。ー種棉花同源結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子基因，其序列為SEQID勵(lì):1所示的核苷酸序列，序列長(zhǎng)度為104仙？。[0037]通過(guò)用DNAMAN軟件將GbHDTFl氨基酸序列與其他物種中的同源結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行比對(duì)確定SEQIDNO:1所編碼的氨基酸序列SEQIDNo:2具有同源結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)特征(圖2)。因此我們認(rèn)為這個(gè)序列為ー個(gè)同源結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子基因，并將該基因命名為GbHDTFl。[0038]實(shí)施例2=GbHDTFl在棉花不同組織的表達(dá)分析和對(duì)植物抗病信號(hào)分子的響應(yīng)[0039]以海島棉‘海7124’為材料，提取根、莖、子葉、真葉、纖維、胚珠、花瓣和花藥8個(gè)不同組織的RNA,提取方法為異硫氫酸胍法(Zhu等，AnimprovedsimpleprotocolforisolationofhighqualityRNAfromGossypiumspp.suitableforcDNAlibraryconstruction.ActaAgronomicaSinica.2005，31:1657-1659)。RNA提取完成后后用DNaseI(購(gòu)自Promega公司)處理，RNA完整性通過(guò)1.2%(w/v)瓊脂糖膠(EtBr)電泳檢測(cè)(5V/cm)。核酸濃度的測(cè)定在BeckmanDU800spectrophotometer(購(gòu)自美國(guó)貝克曼公司)上進(jìn)行。RNA260/280比值在1.9到2.1之間，260/230比值大于2.0的RNA用于下ー步的分析。用RT-PCR檢測(cè)GbHDTFl基因的表達(dá)水平。cDNA的合成是以3yg總RNA為模版，與Iu1500iig/mloligo-dT(15)引物(購(gòu)自Promega公司，美國(guó))，IiillOmMdNTP,DEPC-water混合，總體積為12UI;然后65°C變性5min冰上驟冷；再加入8UI含有4UIRTbuffer,2U10.1Mdithiothreitol,40unitsofRNasin?RibonucleaseInhibitor(購(gòu)自Promega公司)，和200unitsofSuperscriptIIIRT(購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司)的混合液；50°C溫浴Ih合成第一鏈；反應(yīng)結(jié)束后75°C處理15min使SuperscriptIIIRT失活。每份cDNA稀釋到300iU后-20°C保存待用。以上述反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，以實(shí)施例1中獲得的基因設(shè)計(jì)特異引物GbHDTFlRt-F(5’GGCTTCTGCTTTGTCAGTGAACT3’)和GbHDTFlRt-R(5，CGTCGITGCCGTCTTCCTC3’)對(duì)GbHDTFl基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。同時(shí)用引物UB7-F(5’GAAGGCATTCCACCTGACCAAC3，)和UB7-R(5，CTTGACCTTCTTCTTCTTGTGCTTG3’)對(duì)棉花GhUbi7(GenBank登陸號(hào):DQ116441)基因做特異擴(kuò)增，作為內(nèi)對(duì)照進(jìn)行相對(duì)半定量分析。結(jié)果表明:本發(fā)明克隆的基因GbHDTFl在棉花各個(gè)組織中表達(dá)具有組織特異性，在子葉、真葉和纖維中表達(dá)量最高。[0040]對(duì)照植株和GbHDTFl沉默植株葉片接種黃萎病菌‘V991’(中國(guó)農(nóng)科院植物保護(hù)所簡(jiǎn)桂良副研究員惠贈(zèng))和灰霉病菌(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)李國(guó)慶教授惠贈(zèng))，接水作為對(duì)照，接種方法為:保存于_80°C的病原菌孢子置于含有PDA培養(yǎng)基的平皿上活化4天，挑取直徑7cm的菌塊于另ーPDA平皿上，生長(zhǎng)7天之后在平皿中加入5ml蒸餾水，用涂布器輕刮菌落表面將病原菌孢子洗脫到蒸餾水中。孢子液用雙層醫(yī)用紗布過(guò)濾，在顯微鏡下對(duì)孢子液濃度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。利用蒸餾水稀釋孢子液至其終濃度分別為1O7孢子/ml(黃萎病菌)和IO5孢子/ml(灰霉病菌)，然后對(duì)對(duì)照植株和GbHDTFl沉默植株葉片分別進(jìn)行噴施，以蒸餾水噴施作為對(duì)照。病原菌接種之后在0h、6h、12h和24h取樣，分離RNA進(jìn)行RT-PCR鑒定。[0041]對(duì)照植株和GbHDTFl沉默植株葉片進(jìn)行激素誘導(dǎo)處理，具體方法是:赤霉素(GA，購(gòu)自SIGMA公司)、生長(zhǎng)素(D引哚こ酸即IAA，購(gòu)自SIGMA公司)和こ烯利(ETH，購(gòu)自SIGMA公司)用蒸餾水溶解，使終濃度分別為0.5PM、5iiM和200PM。茉莉酸甲酯(MeJA，購(gòu)自SIGMA公司)和水楊酸(SA，購(gòu)自SIGMA公司)用こ醇溶解，終濃度分別為IOOiiM和10mM。對(duì)對(duì)照植株和GbHDTFl沉默植株葉片進(jìn)行噴施，蒸餾水和こ醇噴施作為對(duì)照。病原菌接種之后在Oh,0.5h、Ih和3h取樣，分離RNA進(jìn)行RT-PCR鑒定。利用引物GbHDTFlRt-F和GbHDTFlRt-R對(duì)GbHDTFl基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。同時(shí)用引物UB7-F和UB7-R作為內(nèi)對(duì)照進(jìn)行相對(duì)半定量分析。結(jié)果表明:該基因在海島棉‘海7124’接種黃萎病菌‘V991’和灰霉病菌后與接水的對(duì)照相比表現(xiàn)出表達(dá)下降模式(圖1B)，并且在植物抗病信號(hào)分子水楊酸和茉莉酸甲酯的誘導(dǎo)之后，相對(duì)與噴施こ醇的對(duì)照分別表現(xiàn)出被誘導(dǎo)和被抑制的表達(dá)，而其他激素(包括赤霉素、生長(zhǎng)素和こ烯利)處理后表達(dá)沒(méi)有變化(圖1C)。[0042]實(shí)施例3:病毒干涉載體、RNAi抑制表達(dá)載體和超量表達(dá)載體的構(gòu)建和VIGS介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化[0043]根據(jù)GbHDTFl的基因序列設(shè)計(jì)了如下引物:正向引物GbHDTFl-trv_s(5’CGACGACAAGACCCTGGCGAGGAAGACGGCAACGAC3’)，反向引物GbHDTFl-trv-a(5，GAGGAGAAGAGCCCTATGITTGGITTCAGGCAITGGT3’)，再以GbHDTFl基因cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到的產(chǎn)物及pTRV:RNA2載體(荷蘭瓦格寧根大學(xué)Thomma博士惠贈(zèng))質(zhì)粒分別用限制性內(nèi)切酶BamHl和Kpnl(購(gòu)自NEB公司，中國(guó))進(jìn)行雙酶切。將酶切后的PCR產(chǎn)物與酶切回收的pTRV:RNA2質(zhì)粒片段用T4連接酶(購(gòu)自Invitrogen公司，美國(guó))進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物即為病毒沉默載體pTRV2-GbHDTFl(見(jiàn)圖3A)(圖4A)，將該載體進(jìn)行熱激轉(zhuǎn)化(按照大腸桿菌轉(zhuǎn)化說(shuō)明書操作)，轉(zhuǎn)入大腸桿菌TOPlO(購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司)中，挑取單克隆用引物GbHDTF1-trv-s和GbHDTFl-trv-a進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)后的陽(yáng)性克隆擴(kuò)繁后提取質(zhì)粒，再轉(zhuǎn)化農(nóng)桿MGV3101(Roger等，AguidetoAgroDacteriumbinaryTivectors.Trendsinplantscience.2000.5，1360-1385.)。檢測(cè)后于-80保存?zhèn)溆?圖4A)。[0044]設(shè)計(jì)GbHDTFl基因的RNAi抑制表達(dá)載體構(gòu)建引物，在引物的兩端分別加上用于重組的attB位點(diǎn)序列及保護(hù)堿基，即正義引物5’端加上5’GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGC3’接頭，反義引物5’端加上5’GGGGACCACITTGTACAAGAAAGCTGGGTG3’接頭，分別將該引物命名為GbHDTFl-R1-s(5’GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGCGGCTTCTGCTTTGTCAGTGAACT3’)和GbHDTFl-R1-a(5’GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGCGTCGITGCCGTCTTCCTC3’)，再以GbHDTFl基因cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到的產(chǎn)物通過(guò)BP重組反應(yīng)(BP重組反應(yīng)試劑盒購(gòu)自Invitrogen,美國(guó))導(dǎo)入RNAi載體pHellsgate4(購(gòu)自Invitrogen,美國(guó))。RNAi載體見(jiàn)Wesley等(ConstructdesignIorefficient,effectiveandhigh-throughputgenesilencinginplants.PlantJ.2001.27:581-590)，構(gòu)建得到RNAi載體pHellsgate4_GbHDTFl(見(jiàn)圖3B)。[0045]根據(jù)GbHDTFl基因的ORF設(shè)計(jì)引物，分別將該引物命名為:GbHDTF1-OE-F和GbHDTFl-OE-R0再以GbHDTFl基因的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到的PCR產(chǎn)物通過(guò)BP反應(yīng)構(gòu)建到中間載體PDN0R221(購(gòu)自Invitrogen公司，美國(guó))上，BP反應(yīng)體系(5yl)如下:PCR產(chǎn)物1，pDN0R221載體IU1，BP酶(購(gòu)自Invitrogen公司，美國(guó))IuI,TE(pH8.0)IUI。然后再將含有GbHDTFl基因的pDN0R221載體和pK2GW7.0(購(gòu)自比利時(shí)國(guó)立根特大學(xué))載體進(jìn)行LR重組反應(yīng)，將GbHDTFl基因構(gòu)建到pK2GW7.0的載體上，從而獲得超量表達(dá)載體pK2GW7.0-GbHDTFl(該表達(dá)載體含有如序列表SEQIDNO:1所示的核苷酸序列，見(jiàn)圖3C)。LR反應(yīng)體系(5ill)如下:含有GbHDTFl基因的pDN0R221載體liil，pK2GW7.0載體2iil，LR酶(購(gòu)自Invitrogen公司)IuI,TE(pH8.0)Iu10所述的超表達(dá)載體pK2GW7.0-GbHDTFl含有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列，以及植物表達(dá)載體pK2GW7.0(圖3C)。[0046]VIGS介導(dǎo)的棉花基因沉默的方法參考Fradin等(Fradin,E.F.,Z.Zhang,etal.2009.beneticdissectionoiVerticilliumwiltresistancemediatedbytomatoVel.PlantPhysioll50(I):320-332)。具體步驟為:將帶有質(zhì)粒TRV:RNAl,TRV:RNA2和TRViGbHDTFl的農(nóng)桿菌菌株在50ug/mLKanamycin(購(gòu)于Sigma公司)LB培養(yǎng)皿上活化。接種前兩天，挑取ー個(gè)單克隆接種于5mlLB培養(yǎng)液。培養(yǎng)液中加入50iig/mLKanamycin。在搖床上28°C，轉(zhuǎn)速50rpm過(guò)夜。將活化后的菌液分別接種于IOOml含有50ug/mL的KanamycinLB培養(yǎng)液中，并加入IOmMMES(2-(4morpholino)-ethanesulfonicacid),20uM乙酸丁香酮。于28°C轉(zhuǎn)速50rpm的搖床上過(guò)夜。當(dāng)農(nóng)桿菌液濃度0D600=0.8左右，將菌液收集于50mL離心管中，于4000rpm，離心5分鐘。用重懸液(IOmMMgCl2,IOmMMES和200yM乙酰丁香酮)重懸，調(diào)整濃度至0D600=1.2-1.5。重懸后的菌液在常溫放置2h。將要沉默的棉花幼苗每片子葉背面用針頭扎幾個(gè)小孔。將重懸液TRV:RNAl，分別與TRV:RNA2和TRV:GbHDTFl按1:1體積混合均勻，用2ml注射器將混合后的菌液沿著小孔注射滲入棉花子葉。用黒色塑料膜將注射接種后的棉花幼苗避光24h。24h后，保持培養(yǎng)條件為25°C,120uEm^S^1光強(qiáng)，16h亮/8h暗。[0047]實(shí)施例4:TRV:GbHDTFI轉(zhuǎn)基因植株相關(guān)分析[0048]1、TRV=GbHDTFl轉(zhuǎn)基因植株基因表達(dá)分析[0049]對(duì)照植株和GbHDTFl沉默植株分別提取葉片和根系RNA(Zhu等，AnimprovedsimpleprotocolforisolationofhighqualityRNAfrombossypiumspp.suitableforcDNAlibraryconstruction.ActaAgronomicaSinica.2005,31:1657-1659),利用反轉(zhuǎn)錄酶SuperscriptIII(購(gòu)自Invitrogen公司，美國(guó))將其反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,以GbHDTFl-Rt-F和GbHDTFl-Rt-R引物進(jìn)行RT-PCR，同時(shí)用引物UB7-F和UB7-R擴(kuò)增棉花GhUbi7基因做內(nèi)參，PCR擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)。對(duì)沉默棉花植株進(jìn)行GbHDTFl的表達(dá)量分析。表達(dá)分析表明GbHDTFl沉默的棉花幼苗中GbHDTFl基因的表達(dá)相對(duì)對(duì)照植株均明顯下降(圖4A)。[0050]2、TRV=GbHDTFl轉(zhuǎn)基因植株抗病性鑒定。[0051]農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化后3周后的棉花幼苗用于棉花黃萎病菌接種處理，接種方法為傷根接種法(馬平等，AnewinoculationmethodforVerticilliumwiltoncottonanditsapplicationinevaluatingpathogenesisandhostresistance.ActaPhytopathologicaSinica,2004,34(6):536_541)。接種一周之后觀察棉花黃萎病的發(fā)病率和病指，統(tǒng)計(jì)方法依據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T22101.5-2009棉花抗病蟲性評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范第5部分:棉花黃萎病)。通過(guò)對(duì)對(duì)照植株和GbHDTFl基因沉默植株接種后植株表型和發(fā)病情況統(tǒng)計(jì)進(jìn)行分析，表明GbHDTFl基因沉默之后植物對(duì)黃萎病菌的抗性有顯著提高，表現(xiàn)出黃萎病病癥的植株明顯減少(圖4B)。病指和發(fā)病率的統(tǒng)計(jì)也表明發(fā)病植株的發(fā)病程度在GbHDTFl基因沉默植株中的顯著降低(圖4C)。[0052]3、TRV=GbHDTFl轉(zhuǎn)基因植株茉莉酸信號(hào)途徑相關(guān)基因分析[0053]取對(duì)照植株和GbHDTFl沉默植株分別提取葉片提取RNA(Zhu等，AnimprovedsimpleprotocolforisolationofhighqualityRNAfrombossypiumspp.suitableforcDNAlibraryconstruction.ActaAgronomicaSinica.2005,31:1657-1659),用QRT-PCR檢測(cè)TRV=GbHDTFl沉默后，茉莉酸路徑相關(guān)基因表達(dá)變化。相關(guān)引物的DNA序列如下:[0054]L0X1-RF(5’GCTTATGTTGCTGTAAATGACTCTGG3’)[0055]L0X1-RR(5’CACACTAAGTTGTCGGTTCGTTG3’)[0056]AOS-RF(5’TGCCACCTGGTCCTTTCATTTC3’)[0057]AOS-RR(5’GCGTGTTTGGGCTCGGAAGGGTCG3’)[0058]0PR3-RF(5，AGAGGTCCACTCCTGGCGGCTT3’)[0059]0PR3-RR(5’CCACCTGTTCTTCATTGTAGATTCC3’)[0060]MYC-2RF(5’GCTCCGCCACTACCGTGCTC3’)[0061]MYC-2RR(5’CTCGAAGCACTTTTTTACGGTGTTC3’)[0062]Jazl-RF(5，AGCCTCAAAAAGGAAGACCTCAAAC3，)[0063]Jazl-RR(5’TGGCTGCTCAATCACCATAGTAATC3’)[0064]JAZ3-RF(5，TGATTTTGCTCAAGGAGATAACGCT3’)[0065]JAZ3-RR(5’TGATTGCCTACTCGTTGCCTGT3’)[0066]JAZ6-RF(5，GGCATCAATATGGCGGTTCAGGAC3’)[0067]JAZ6-RR(5’TTCATCGGGTTTAGGTGGCAGAGT3’)[0068]同時(shí)用引物UB7-F和UB7-R對(duì)棉花GhUbi7基因做特異擴(kuò)增作為內(nèi)對(duì)照進(jìn)行相對(duì)定量分析。定量PCR儀為ABI7500，定量PCR試劑購(gòu)自Bio-Rad公司。PCR反應(yīng)體系(20yl)包括:1Ul稀釋后的cDNA(等于IOng起始總RNA)，10U12XPCRMasterMix,200nM的引物。反應(yīng)條件為:95°C30sec；95°C5sec，60°C35sec，40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)過(guò)程中進(jìn)行熒光檢測(cè)實(shí)時(shí)定量分析。結(jié)果表明:在本發(fā)明克隆的基因GbHDTFl被干涉植株中，茉莉酸合成相關(guān)基因受誘導(dǎo)，茉莉酸下游響應(yīng)相關(guān)基因及茉莉酸下游相關(guān)基因都受到不同程度的誘導(dǎo)(參見(jiàn)附圖5A)，表明GbHDTFl基因參與了植物抗病反應(yīng)信號(hào)路徑。[0069]4、TRV=GbHDTFl轉(zhuǎn)基因植株茉莉酸含量分析[0070]對(duì)照植株和沉默植株分別取葉片提取茉莉酸并測(cè)定其含量，具體方法參照Shindy等用到的茉莉酸提取方法(IdentificationofPlantHormonesfromCottonOvules.PlantPhysiol.1975,55(3):550-554)。具體過(guò)程如下:分別取對(duì)照植株和沉默植株的葉片，用液氮研磨成粉末，稱取0.1g粉末，加入80%甲醇溶液600yl，于4°C并避光振蕩24h后，在9000Xg，4°C離心10分鐘，取上清轉(zhuǎn)入ー支新的離心管中。再往沉淀中加入400u180%甲醇溶液于4°C并避光振蕩4h后，9000g，4°C離心10分鐘。把上清與前一次的上清混合。把兩次的有機(jī)相溶液用氮?dú)獯蹈?，加?00μI甲醇溶解。用HPLC液相色譜測(cè)定其茉莉酸濃度。結(jié)果表明GbHDTFl被干涉植株中，茉莉酸合成增加(參見(jiàn)附圖5Β)。這與在GbHDTFl被干涉植株中參與茉莉酸合成相關(guān)基因受誘導(dǎo)，茉莉酸下游響應(yīng)相關(guān)基因及茉莉酸下游相關(guān)基因都受到不同程度的誘導(dǎo)相一致，表明GbHDTFl參與了茉莉酸合成的負(fù)調(diào)控?！緳?quán)利要求】1.一種分離的同源結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子基因GbHDTFl，其特征在于，該基因的核苷酸序列如序列表SEQIDN0:1所示。2.如權(quán)利要求1所述的GbHDTFl基因，其蛋白質(zhì)的序列如SEQIDNO:2所示。3.ー種表達(dá)載體pK2GW7.0-GbHDTFl，其特征在于含有權(quán)利要求1所述的基因。4.ー種表達(dá)載體pHellSgate4-GbHDTFl，其特征在于含有權(quán)利要求1所述的基因。5.ー種表達(dá)載體pTRV2-GbHDTFl，其特征在于含有權(quán)利要求1所述的基因。6.權(quán)利要求1所述的基因GbHDTFl在控制棉花黃萎病中的應(yīng)用?！疚臋n編號(hào)】C07K14/415GK103451189SQ201310345168【公開日】2013年12月18日申請(qǐng)日期:2013年8月9日優(yōu)先權(quán)日:2013年8月9日【發(fā)明者】朱龍付,張獻(xiàn)龍,高巍,龍璐申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)