專利名稱：一種從豬皮中提取i型膠原的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物化工分離領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種類型均一的膠原制備方法。
背景技術(shù)：
膠原是一種由動物細胞表達的天然生物高分子，作為細胞外基質(zhì)的主要成分幾乎存在于所有組織，約占哺乳動物體內(nèi)總蛋白的33%。膠原對于維持組織的結(jié)構(gòu)與機械強度十分關(guān)鍵，膠原與蛋白和多糖等相互作用構(gòu)成復(fù)雜的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，不僅起到細胞結(jié)構(gòu)支架的作用，而且對細胞和組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)、新陳代謝、生長、分化都有重要影響。膠原由3條鏈組成，每條肽鏈約1000個氨基酸殘基，根據(jù)其每條鏈的氨基酸組成差異，膠原可分為多種類型，目前在哺乳動物體內(nèi)已發(fā)現(xiàn)27種不同類型的膠原，不同類型膠原的性質(zhì)存在一定差異。膠原具有良好的生物相容性、弱抗原性、生物可降解、生物可吸收性以及良好的吸水性，膠原作為一種理想的生物材料，可用于組織工程、醫(yī)療器械、組織修復(fù)、藥物控釋和動物細胞培養(yǎng)等領(lǐng)域，如膠原可用于制造人工器官、止血材料、組織修復(fù)與再生材料、組織填充材料、支架材料、神經(jīng)缺損修復(fù)材料以及動物細胞培養(yǎng)等。不同類型膠原的功能、機械強度及其熱穩(wěn)定性存在一定差異，與其它生物分子、細胞或材料界面之間的相互作用也存在一定差異，因此，制備不同生物材料對膠原類型及其比例等存在一定要求。在組織工程材料方面，Ohno T等證明使用膠原制備三維支架接種軟骨細胞并用于軟骨組織修復(fù)和再生時，I型和II型膠原對結(jié)果影響十分顯著(Materials Science andEngineering:C, 2004, 24-3:407 - 411);膠原蛋白用于制備止血材料方面，不同類型的膠原與血小板之間的相互作用也存在一定差異，如Zhu JQ證明血小板表面上存在可與不同類型膠原結(jié)合的活性位點，且結(jié)合位點種類與膠原類型密切相關(guān)(Thrombosis Research,2007，119-1:111-119)。在組織再生材料方面，I型和III型膠原對于膀胱壁的無細胞基質(zhì)的移植和再生效果影響十分顯著(European Urology Supplements, 2003, 2-1:121)。因此，提高膠原的類型均一性對改進組織工程產(chǎn)品或醫(yī)療器械等產(chǎn)品十分關(guān)鍵，制備類型均一的膠原具有廣闊的應(yīng)用前景。由于膠原在天然狀態(tài)下不溶于水溶液，直接分離不同類型的膠原存在一定難度，也是近年來的生物材料領(lǐng)域中膠原研究的熱點。范代娣等采用基因工程的方法制備了一種重組膠原蛋白(范代娣，馬曉軒，嚴建亞等，重組膠原蛋白，專利申請?zhí)朇N102351954.A)，楊樹林等采用基因重組的方法制備了人III型膠原的具有序列(一種重組人源膠原蛋白及其制備方法申請?zhí)?02443057.A)?；诨虻哪z原制備技術(shù)不同于以動物皮膚或骨為原料制備膠原的方法，其成本較低，制備的膠原純度較高，但基因重組技術(shù)只能制備出膠原的一條鏈活局部序列，而在制備具有三螺旋結(jié)構(gòu)的膠原方面存在難度。任偉業(yè)申請的一種具有三螺旋結(jié)構(gòu)的活性膠原的制備方法(申請?zhí)朇N102391372.A)公開了一種制備具有三螺旋結(jié)構(gòu)膠原的方法，但該方法只能制備出混合膠原，而不涉及不同類型膠原的分離。李潔等以動物軟骨為原料，經(jīng)過粉碎后采用胃蛋白酶進行降解，采用鹽析和離心的方法獲得非變性II型膠原蛋白(李潔、朱大開，龔輝，非變性II型膠原蛋白生產(chǎn)方法，專利申請?zhí)朇N102154425.A)，該過程需要反復(fù)的鹽析處理和離心過程。蔣波等采用新鮮新生牛皮為原料，采用酶解、鹽析、變性和復(fù)性的技術(shù)制備了牛III型膠原(蔣波，李霞、陳露等，醫(yī)用級III型膠原的制備方法，申請?zhí)?00910216686.7)，該專利用于制備牛III型膠原。從實際應(yīng)用效果分析，已有方法制備的膠原純度以及膠原的分子量范圍存在不穩(wěn)定性，用于制備生物材料時，尤其是對I型膠原純度要求較高的生物材料時，其應(yīng)用效果難以滿足實際要求。不同類型膠原的熱變性溫度存在一定差異，熱變性后的膠原可通過非膠原類的酶進行降解。因此，通過溫度控制可實現(xiàn)不同類型膠原的變性，加入酶后可實現(xiàn)不同類型膠原的選擇性酶解，是實現(xiàn)分離不同類型膠原的一種良好方法。

發(fā)明內(nèi)容
針對I型膠原制備難度高以及醫(yī)療器械類生物材料對I型膠原純度要求高的情況，本發(fā)明目的在于提供一種從豬皮中提取I型膠原的方法，制備的豬I型膠原純度超過98%且保持三螺旋的天然結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的一種從豬皮中提取I型膠原的方法，該方法包括以下步驟:(1)稱重:取新鮮的豬皮，準確稱重，其重量作為后續(xù)處理步驟的計量依據(jù)。(2)清洗: 使用2-3倍豬皮重量的清水在常溫下將新鮮的豬皮直接清洗，去除附著物。(3)冷凍:將豬皮在-20°c以下冷凍24-36小時。(4)切片:使用刀具在豬皮平面的垂直方向上將豬皮切成片狀，切片厚度小于Imm0(5)打漿:向豬皮切片中加入2-4倍重量的清水，均勻懸浮后將其冷凍到0-4°C，使用勻漿機或膠體磨將切片后的豬皮處理成漿狀。(6)第一次萃取:向勻漿中加入1-2倍勻漿液體積的正己烷、氯仿或石油醚等有機溶劑，在室溫下震蕩2-4小時，將其轉(zhuǎn)移到分液器中萃取，收集水溶液；(7)第二次萃取:向步驟(6)收集的水溶液總加入1-2倍勻漿液體積的正己烷、氯仿或石油醚等有機溶劑，在室溫下震蕩2-4小時，將其轉(zhuǎn)移到分液器中萃取，收集水溶液。(8)過濾:使用孔徑為5微米的微濾膜過濾水溶液，收集透過液；(9)加鹽:向步驟(8)獲得的透過液中加入NaCl，控制NaCl的濃度為0.2-1.0mol/L，加入磷酸氫二鈉調(diào)節(jié)pH至7.5-8.5。(10)控溫:將步驟(9)獲得的溶液溫度準確控制在40.5±1°C。(11)酶解:向步驟(10)溶液中加1/50-1/20倍豬皮重量的蛋白酶，在40.5 土 1°C條件下酶解16-24小時，以去除非I型膠原。(12)離心:將酶解后的溶液在12000-16000r/m條件下離心，收集沉淀物。(13)洗滌:使用2-4倍沉淀物重量的去離子水將步驟(12)獲得的沉淀物懸浮，離心后收集沉淀物，重復(fù)上述過程兩次。(14)干燥:將洗滌后的沉淀物在_20°C冷凍，置于冷凍干燥機內(nèi)干燥，干燥后的粉末即為I型膠原蛋白。
優(yōu)選的，所述的步驟(4)切片過程中，使用刀具在豬皮平面的垂直方向上將豬皮切成片狀。優(yōu)選的，所述的步驟(6)第一次萃取過程中，直接向豬皮勻漿中加入有機溶劑。優(yōu)選的，所述步驟(10 )控溫過程中，溶液的溫度準確控制在40.5 ± I °C。優(yōu)選的，所述的步驟(11)酶解過程中，使用的酶可以是固定化酶，或在40.5 ± IV保持活性的游離酶。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其優(yōu)點包括:(I)將豬皮切片處理后進行勻漿，有利于后續(xù)的萃取等步驟，脫脂徹底。(2)使用了固定化酶，提供了酶的耐受溫度，固定化酶易于回收，有利于降低生產(chǎn)成本。(3)操作簡便，工藝條件對儀器設(shè)備的依賴性較低，易于實現(xiàn)。(4)制備出的I型膠原純度高，分子量高。
具體實施例下面通過具體實施例對本發(fā)明進行具體的描述，值得提出的是，本實施例只是用于對本發(fā)明一種實施方法，并不能代表本發(fā)明專利的全部，更不能理解為對本發(fā)明保護范圍的限制，在不脫離本發(fā)明實質(zhì)的構(gòu)思的前提條件下，還可以做出若干調(diào)整或改進，這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。實施例1:( I)稱重:稱量新鮮豬皮1kg。(2)清洗:使用2kg的清水在常溫下將新鮮豬皮正反兩面清洗干凈。(3)冷凍:將豬皮在-20°C以下冷凍24小時。(4)切片:將豬皮平鋪在桌面，在其垂直方向使用刀片進行切片，切片厚度為
0.6mm-0.8mm。(5)打漿:向切除薄片的豬皮切片中加入4kg清水，混合均勻后將其冷凍到0_4°C，使用勻漿機將豬皮切片打成漿狀。(6)第一次萃取:向勻漿中加入2L倍勻漿液體積的正己烷，震蕩2小時，將懸浮液轉(zhuǎn)移到分液器，收集下層溶液，收集水溶液。(7)第二次萃取:向步驟(6)獲得的水相中加入2L倍勻漿液體積的正己烷，震蕩2小時，將懸浮液轉(zhuǎn)移到分液器，收集下層溶液，收集水溶液。(8)過濾:使用孔徑為5微米的微濾膜過濾水溶液，收集透過液，獲得透過液4kg ；(9)加鹽:向步驟(8)獲得的透過液中加入200g NaCl，加入磷酸氫二鈉直至溶液pH 至 8.0。(10)控溫:將步驟(8)獲得的溶液轉(zhuǎn)移到帶夾套的攪拌釜中，準備控制攪拌釜內(nèi)的溫度為41 °C。(11)酶解:向步驟(10)溶 液中加300g堿性蛋白酶，在41°C條件下酶解20小時，酶法法去除非I型膠原。(12)離心:將酶解后的溶液在12000-16000r/m條件下離心，收集沉淀物，濕重
0.9kg。
(13)洗滌:使用0.9kg去離子水將步驟(12)獲得的沉淀物懸浮，在室溫、5000r/m條件下離心，收集沉淀物，重復(fù)上述過程兩次，收集沉淀物。 (14)干燥:將洗滌后的沉淀物在_20°C冷凍，置于冷凍干燥機內(nèi)干燥，干燥后獲得豬皮I型膠原蛋白0.3kg。
權(quán)利要求
1.一種從豬皮中提取I型膠原的方法，其特征在于提取方法包括以下步驟: (1)稱重:取新鮮的豬皮，準確稱重，其重量作為后續(xù)處理步驟的計量依據(jù)。
(2)清洗:使用2-3倍豬皮重量的清水在常溫下將新鮮的豬皮直接清洗，去除附著物。
(3)冷凍:將豬皮在_20°C以下冷凍24-36小時。
(4)切片:使用刀具在豬皮平面的垂直方向上將豬皮切成片狀，切片厚度小于1mm。
(5)打漿:向豬皮切片中加入2-4倍重量的清水，均勻懸浮后將其冷凍到0-4°C，使用勻漿機或膠體磨將切片后的豬皮處理成漿狀。
(6)第一次萃取:向勻漿中加入1-2倍勻漿液體積的正己烷、氯仿或石油醚等有機溶齊U，在室溫下震蕩2-4小時，將其轉(zhuǎn)移到分液器中萃取，收集水溶液； (7)第二次萃取:向步驟(6)收集的水溶液總加入1-2倍勻漿液體積的正己烷、氯仿或石油醚等有機溶劑，在室溫下震蕩2-4小時，將其轉(zhuǎn)移到分液器中萃取，收集水溶液。
(8)過濾:使用孔徑為5微米的微濾膜過濾水溶液，收集透過液； (9)加鹽:向步驟(8)獲得的透過液中加入NaCl，控制NaCl的濃度為0.2-1.0mol/L，加入磷酸氫二鈉調(diào)節(jié)PH至7.5-8.5。
(10)控溫:將步驟(9)獲得的溶液溫度準確控制在40.5±1°C。
(11)酶解:向步驟(10)溶液中加1/50-1/20倍豬皮重量的蛋白酶，在40.5土 1°C條件下酶解16-24小時，以去除非I型膠原。
(12)離心:將酶解后的溶液在12000-16000r/m條件下離心，收集沉淀物。
(13)洗滌:使用2-4倍沉淀物重量的去離子水將步驟(12)獲得的沉淀物懸浮，離心后收集沉淀物，重復(fù)上述過程兩次。
(14)干燥:將洗滌后的沉淀物在_20°C冷凍，置于冷凍干燥機內(nèi)干燥，干燥后的粉末即為I型股原蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種從豬皮中提取I型膠原的方法，其特征在于豬皮切片過程中，在豬皮平面的垂直方向上將豬皮切成片狀，切片厚度小于1mm。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種從豬皮中提取I型膠原的方法，其特征在于酶解法去除非I型膠原過程的溫度控制在40.5± 1°C。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從豬皮中提取I型膠原的方法，該方法首先將新鮮豬皮在-20℃以下冷凍后切片，切片厚度小于1mm，采用勻漿法將豬皮制成勻漿，使用有機溶解萃取后在40.5±1℃條件下進行酶解以去除非I型膠原，根據(jù)不同類型膠原的熱穩(wěn)定性差異進行選擇性酶解，離心法去除酶解后的多肽，收集不溶性的固體，多次洗滌，干燥后獲得豬皮I型膠原。制備的豬I型膠原純度超過99%且保持三螺旋的天然結(jié)構(gòu)。該方法具有操作簡單，制備出的I型膠原純度高和隨機降解率低等優(yōu)點。
文檔編號C07K1/14GK103215334SQ201310173789
公開日2013年7月24日 申請日期2013年5月13日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月13日
發(fā)明者王云松, 吳士龍 申請人:河北考力森生物科技有限公司