一種熱激轉(zhuǎn)錄因子基因AtHSFA1d及其編碼蛋白與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于植物分子生物學(xué)與轉(zhuǎn)基因相關(guān)【技術(shù)領(lǐng)域】。具體為擬南芥熱激轉(zhuǎn)錄因子基因AtHSFA1d抗高溫功能的驗證，以及該基因在抗高溫植物新品種培育中的應(yīng)用。本發(fā)明以模式植物擬南芥為材料，利用AtHSFA1d基因T-DNA插入純合突變體株系salk_058618研究AtHSFA1d基因在植物抗高溫方面的功能。實驗結(jié)果顯示：AtHSFA1d基因敲除突變體在熱激脅迫下表現(xiàn)敏感表型，且在存活率、電導(dǎo)率、滲透壓、丙二醛、SOD和POD酶活性等生理指標(biāo)方面均與野生型有顯著或極顯著差異；說明AtHSFA1d基因在植物應(yīng)答熱激脅迫的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中具有重要的作用，預(yù)計該基因的過量表達(dá)可提高植物的耐熱性并在植物抗逆分子育種中具有較大經(jīng)濟價值。
【專利說明】—種熱激轉(zhuǎn)錄因子基因AtHSFAId及其編碼蛋白與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】:
[0001]本發(fā)明涉及植物分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體為擬南芥熱激轉(zhuǎn)錄因子(Heat ShockTranscription Factors, HSFs)家族成員AtHSFAld抗高溫新功能的驗證，以及該基因在抗高溫植物新品種培育中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】:
[0002]溫度的變化對植物生長發(fā)育具有重要的影響，適宜的溫度能夠保證或促進(jìn)植物正常的生長發(fā)育，而不適宜的溫度條件則會抑制植物的生長，甚至使植物死亡。自二十世紀(jì)以來，隨著世界人口的飛速增長及工業(yè)化程度的不斷加深，溫室效應(yīng)越來越嚴(yán)重，全球溫度的逐步升高已成為作物正常生長、發(fā)育和獲得高產(chǎn)的一個重要限制因素?，F(xiàn)代分子生物學(xué)和基因工程相關(guān)技術(shù)的日益成熟，使人們從分子水平上探知植物對高溫脅迫的響應(yīng)及高溫誘導(dǎo)相關(guān)信號在植物體內(nèi)的傳導(dǎo)途徑成為現(xiàn)實，并且為改良作物的抗高溫性能開辟了新的途徑，在了解植物響應(yīng)高溫的分子機制的基礎(chǔ)上，充分利用植物自身的基因資源，發(fā)掘植物抗高溫相關(guān)基因，對培育抗高溫性能提高的作物具有重要的指導(dǎo)意義。
[0003]擬南芥(Arabidopsis thaliana)屬十字花科,蕓薹屬植物，它不僅是第一個被測定基因組序列的模式植物(Athanasios Theologis.et al., NATURE.2000, V0L408:816-820)，而且具有基因組規(guī)模較小、植株株型矮小、生長周期短、自花授粉而又易于雜交等優(yōu)點。因此以擬南芥作為分子遺傳學(xué)和基因工程研究的模式植物，從中鑒定和克隆與熱脅迫相關(guān)的基因，并結(jié)合轉(zhuǎn)基因操作技術(shù)是培育耐高溫性能增強植物的一條有效途徑。
[0004]轉(zhuǎn)錄因子(Transcription factors, TFs)又稱反式作用因子，是一類和專一性DNA序列特異結(jié)合并能激活或抑止相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)分子。熱激轉(zhuǎn)錄因子(Heatstress transcription factors, HSFs)是一類能夠調(diào)控不同熱激蛋白(Heat shockprotein,HSP)基因表達(dá)的專`用轉(zhuǎn)錄因子?；蚪M研究發(fā)現(xiàn)擬南芥中包含21個HSF基因家族成員。已有研究證明HSFAls亞家族(包括HSFAla、HSFAlb、HSFAld和HSFAle)在應(yīng)答熱脅迫信號和控制生長發(fā)育等過程中起到重要作用，其中HSFAld和HSFAle雙重突變體表現(xiàn)出耐熱功能的缺失(Ayako Nishizawa Yoko1.et al.,Plant Cell Physiol.(2011)52(5):933-945);而肥?八18四重敲除突變體(Quadruple Knock Out, QK)在發(fā)芽率、存活率等方面均與野生型(Col-O)有顯著差異(Hsiang-Chin Liu, Hsiu-Ting Liao&Yee-Yung Charng,Plant Cell and Environment (2011) 34, 738-751)。但至今還沒有關(guān)于 HSFAls 亞家族單基因熱脅迫反應(yīng)的報道，這就給人們理解該亞家族各成員的功能和相互作用關(guān)系增加了難度，同時也使得通過轉(zhuǎn)基因手段培育抗高溫作物新品種變得更為煩瑣，多基因轉(zhuǎn)化不僅技術(shù)難度增大，而且后代功能和表型的不確定性也相應(yīng)增多，相關(guān)的理論和技術(shù)研究也往往因此而變得無所適從。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一個擬南芥熱激轉(zhuǎn)錄因子(HSF)基因，以及該基因在應(yīng)答熱激脅迫反應(yīng)中的功能和在培育抗高溫植物中的作用。
[0006]所提供的HSF 基因為 AtHSFAld (AT1G32330)。
[0007]上述基因具有SEQ ID N0.1的堿基序列。
[0008]上述基因編碼的蛋白質(zhì)具有SEQ ID N0.2的氣基酸序列。
[0009]AtHSFAld 基因的 T-DNA 插入突變體 salk_058618 是從 ABRC(ArabidopsisBiological Resource Center)定購獲得。通過PCR鑒定獲得純合插入突變體,通過RT-PCR在mRNA水平上鑒定基因的敲除情況。
[0010]通過上述鑒定，獲得 AtHSFAld基因T-DNA插入突變體salk_058618的純合株系，并以之為材料進(jìn)行熱激處理，觀察熱脅迫表型并拍照。然后對熱脅迫處理后的擬南芥幼苗進(jìn)行耐高溫相關(guān)指標(biāo)的測定，包括:存活率統(tǒng)計，相對電導(dǎo)率測定和滲透壓測定，相關(guān)酶活
性測量，丙二醛含量測量。
【專利附圖】

【附圖說明】:
[0011]圖1顯示野生型和突變體PCR和RT-PCR檢測的電泳結(jié)果，結(jié)果表明所獲AtHSFAld基因突變株系salk_058618為T-DNA純合插入株系，其轉(zhuǎn)錄本被敲除。
[0012]圖2顯示野生型和突變體熱脅迫6天后的表型圖片，結(jié)果表明突變體經(jīng)熱脅迫處理后多數(shù)白化死亡，表現(xiàn)熱敏感表型。
[0013]圖3顯示熱脅迫后野生型和突變體存活率差異，結(jié)果表明突變體存活率極顯著低于野生型(P = 0.006)。
[0014]圖4顯示熱脅迫后野生型和突變體電導(dǎo)率的差異，結(jié)果表明突變體在緩苗12h以后電導(dǎo)率極顯著高于野生型(P = 0.001)，表現(xiàn)為熱敏感。
[0015]圖5顯示熱脅迫后野生型和突變體滲透壓差異，結(jié)果表明突變體滲透壓極顯著高于野生型(P = 0.002)。
[0016]圖6顯示熱脅迫前后野生型和突變體丙二醛(MDA)含量差異，結(jié)果表明熱脅迫前突變體MDA含量顯著低于野生型(P = 0.034)，而熱脅迫后突變體MDA含量極顯著高于野生型(P = 0.007)。
[0017]圖7顯示熱脅迫后野生型和突變體POD和SOD活性差異，結(jié)果表明突變體P0D、S0D活性顯著低于野生型(P = 0.007 ；P = 0.023)。
【具體實施方式】:
[0018]下面結(jié)合實驗方法和數(shù)據(jù)進(jìn)一步闡述本發(fā)明。
[0019]1.擬南芥幼苗培養(yǎng):
[0020]野生型和突變體種子分別用0.5%次氯酸鈉溶液浸泡消毒lOmin，消毒后的種子放入4°C冰箱春化2天后點布于含I %瓊脂的MS (Murashige and Skoog)固體培養(yǎng)基上,置于22°C光照培養(yǎng)箱中萌發(fā)生長。
[0021]2.純合突變體鑒定:
[0022]DNA提取:所用實驗藥品均購自中科瑞泰生物工程有限公司。取約0.5g擬南芥新鮮葉片，研磨成糊狀，加 400 μ I SDS 提取液(0.5% SDS(ff/V) ；200mMTris-HCl, pH = 8.0 ；250mM NaCl ；25mM EDTA) ;12，OOOr/min離心3min ;取上清，加等體積異丙醇輕輕搖晃，靜置30min ; 13，OOOr/min離心5min ;棄上清,用lml95%酒精沖洗1_2次后，自然風(fēng)干,加去離子水30μ 1，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0023]RNA提取:所用實驗藥品均購自中科瑞泰生物工程有限公司。所用研缽、槍頭、離心管等一應(yīng)物品事先用1 % DEPC水浸泡過夜后高溫高壓滅菌備用。取新鮮幼苗約1g左右，于液氮中研磨成粉狀，加1ml TR1ZOL提取液混勻，靜置10min ;4°C下12，OOOr/min離心1Omin ;取上清加300 μ 1氯仿混勻,靜置10min后4°C, 12, OOOr/min離心15min,樣品分為3層，RNA位于上層水相中；取500 μ 1上層水相轉(zhuǎn)移到新離心管中，加等體積異丙醇沉淀 10-20min ; 12，OOOr/min 離心 1Omin,棄上清;用 75% 酒精洗漆 1-2 次,7，000r/min離心2min,晾干1min左右，加60 μ 1無RNase水，輕輕震蕩使RNA溶解，置于_70°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br> [0024]RT-PCR:所用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(#kl621)購自 Fermentas。F1rst strand cDNAsynthes1s:管中加入 RNAl μ 1, ol1go(dT) 18pr1merlμ 1, RNase-free waterlμ 1,65 °C處理5m1n后迅速冰浴冷卻；然后再加5XReact1on buffer4 μ1, R1bolock?RNase1nh1b1tor (20u/ul)1 μ 1,10mM dNTP Μ?χ2μ 1, RevertA1d? H M1nus M-MuLV ReverseTranscr1ptase (200u/μ 1) 1 μ 1，42°C反應(yīng) 60m1n ;70°C終止反應(yīng) 5m1n，產(chǎn)物于 _20°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br> [0025]PCR檢測:所用實驗藥品均購自中科瑞泰生物工程有限公司，引物由上海生工生物工程有限公司合成。我們設(shè)計了 2對引物，1對用于T-DNA插入檢測(LPl:5, -TCTCATCCCCCTAAGTTTGTATG-3' ,R Pl:5/ -TCTGATGGAATTTGAAAAGATTG-3')，并結(jié)合 T-DNA左邊界通用引物L(fēng)Bbl.3:5' -ATTTTGCCGA TTTCGGAAC-3;;另外1對用于轉(zhuǎn)錄本檢測(LP2:5'-AAGTTATCTCTCTCTCTCACCTATTG-3' ,RP2:5/ -CTGTATCTCA GAAGCTGTAGGC-3' ^PCR 反應(yīng)體系如下:10 X buffer2 μ 1，dNTP0.8 μ 1，Pr1mer LP/RP 各 1 μ 1，DNAl μ 1，dH2014 μ 1，Taq 酶
0.2μ 1。PCR 程序如下:94°C，3min；(94°C,45sec ；58°C,45sec ；72°C,60sec) X30cycles ；72°C，5min。產(chǎn)物采用1% (ff/V)瓊脂糖凝膠電泳分離，恒壓100V電泳20m1n，用B1O-RAD凝膠成像掃描儀拍照記錄檢測結(jié)果。
[0026]3.熱脅迫處理:
[0027]在含1%瓊脂的固體MS培養(yǎng)基上生長5天的幼苗，轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基中，野生型和突變體各轉(zhuǎn)5-6株，排列整齊以便于觀察表型。24h后置于烘箱中熱激，熱激條件為:38°C，lh30min ;22°C，4h ；48°C, lh45min ;22°C光照培養(yǎng)箱中生長6天后拍照并統(tǒng)計存活率。
[0028]結(jié)果表明熱脅迫處理后突變體更多地出現(xiàn)白化死亡現(xiàn)象，存活率極顯著低于野生型(P = 0.006)，表現(xiàn)熱敏感表型。
[0029]4.相對電導(dǎo)率測定:
[0030]植物受高溫等逆境脅迫后，細(xì)胞膜受到傷害，膜透性增大，細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)(尤其是電解質(zhì))大量外滲，從而引起質(zhì)外體空間的電導(dǎo)率發(fā)生變化，通過測定外滲液電導(dǎo)率的變化，就可反映出質(zhì)膜的傷害程度和所測材料抗逆性的大小。
[0031]熱激后的苗分別于Oh、12h、24h和48h取樣，野生型和突變體各取10株，用去離子水沖洗后放入干凈的1Oml離心管中，加入去離子水5ml，室溫下靜置過夜后用HANNA EC215型電導(dǎo)率儀測定浸泡液的電導(dǎo)率(S1);再于沸水中煮沸l(wèi)Omin，冷卻至室溫后再一次測定浸泡液的電導(dǎo)率(S2);相對電導(dǎo)率(L) = S1/S2，每個處理設(shè)3次重復(fù)。[0032]結(jié)果表明突變體的電導(dǎo)率在緩苗24h后極顯著地高于野生型(P = 0.001)，說明AtHSFAld基因敲除后，突變體植株在高溫脅迫后細(xì)胞膜受到不可逆損害的程度遠(yuǎn)較野生型的嚴(yán)重。這也是突變體表現(xiàn)熱敏感表型的主要原因之一。
[0033]5.滲透壓的測定:
[0034]植物受高溫等逆境脅迫后，細(xì)胞膜受損，細(xì)胞內(nèi)容物大量外滲，從而引起細(xì)胞外液的滲透勢發(fā)生變化，通過測定滲透壓的變化，就可反映出質(zhì)膜受傷害的程度和所測材料抗逆性的大小。
[0035]熱激后分別取野生型和突變體幼苗各100株，用去離子水沖洗后放入干凈的注射器，用力擠壓，擠出細(xì)胞外液，取10 μ I用VAPR05520型滲透壓儀測量溶液滲透壓，每個處理設(shè)3次重復(fù)。 [0036]結(jié)果表明突變體在熱脅迫處理后其滲透壓極顯著地高于野生型(P = 0.002)，說明AtHSFAld基因敲除后，突變體植株的細(xì)胞膜受傷害程度遠(yuǎn)大于野生型。
[0037]6.丙二醛含量測定:
[0038]植物在高溫下產(chǎn)生的超氧自由基自由基、過氧化物等活性氧，能將膜脂中不飽和脂肪酸過氧化為丙二醛，與酶蛋白發(fā)生鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng)，使酶蛋白失去活性而對植物體造成傷害。因此丙二醛含量能夠代表植物細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化程度。
[0039]熱激后野生型和突變體幼苗分別取鮮樣0.15g，提取丙二醛，提取及測量方法參考湯章城等編著《現(xiàn)代植物生理學(xué)實驗指南》(科學(xué)技術(shù)出版社)。
[0040]結(jié)果表明熱脅迫前突變體MDA含量顯著低于野生型(P = 0.034)，而熱脅迫后突變體MDA含量極顯著高于野生型(P = 0.007)，說明AtHSFAld基因敲除后，突變體植株的細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化程度大于野生型。
[0041]7.酶活性測定:
[0042]植物受高溫等逆境脅迫后，能夠激活或提高植物體內(nèi)清除活性氧、保護(hù)膜系統(tǒng)的抗氧化防御系統(tǒng)的活性。因此以超氧化物歧化酶(S0D)、過氧化氫酶(POD)等為代表的植物細(xì)胞保護(hù)酶的活性能夠代表植物的高溫耐受能力。
[0043]熱激后野生型和突變體幼苗分別取鮮樣0.15g，提取酶液，分別測量SOD和POD活性，提取及測量方法參考湯章城等編著《現(xiàn)代植物生理學(xué)實驗指南》(科學(xué)技術(shù)出版社)。
[0044]結(jié)果表明突變體POD、SOD活性顯著低于野生型(P = 0.007 ；P = 0.023)，說明AtHSFAld基因敲除后，突變體植株的高溫耐受能力低于野生型。
【權(quán)利要求】
1.擬南芥熱激轉(zhuǎn)錄因子基因AtHSFAld，其堿基序列如SEQIDN0.1。
2.權(quán)利要求1所述的熱激轉(zhuǎn)錄因子基因AtHSFAld編碼的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列如SEQID N0.2。
3.權(quán)利要求1所述的熱激轉(zhuǎn)錄因子基因AtHSFAld突變體的熱脅迫處理方法及條件。
4.權(quán)利要求1所述的熱激轉(zhuǎn)錄因子基因AtHSFAld突變體在熱脅迫處理下所獲得的表型及其相關(guān)試驗數(shù)據(jù)。
5.權(quán)利要求1所述的熱激轉(zhuǎn)錄因子基因AtHSFAld及其同源基因在制備耐熱及其它抗性轉(zhuǎn)基因植物中的 應(yīng)用。
【文檔編號】C07K14/415GK103667311SQ201310113302
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年4月3日 優(yōu)先權(quán)日:2013年4月3日
【發(fā)明者】徐江, 徐小棟, 張少斌, 東方陽, 魯黎明, 王西瑤, 遲志海, 洪雪, 麻艷超, 趙明, 丁在松, 付金東 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所