專利名稱：一種攜帶ptd的抗人cd3單鏈抗體的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種攜帶PTD的抗人CD3單鏈抗體的制備方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
⑶3是T淋巴細胞的一種分化抗原，由Y、δ、ε、P 28 4條多肽鏈組成的多聚體，它與T細胞抗原受體(TCR) —起構(gòu)成TCR — CD3復(fù)合物，在T細胞識別抗原及活化過程中起重要作用。80年初，美國Ortho公司運用淋巴細胞雜交瘤技術(shù),研制出人淋巴細胞表面抗原的單克隆抗體(ant1-Q)3 Monclonalantibody, ant1-Q)3McAb),由于其許多的獨特免疫調(diào)節(jié)活性引起人們的極大興趣。對鼠源性抗體的改造、完全人源化抗體的制備、篩選高親和性的突變抗體以及與其它生物活性物質(zhì)交聯(lián)形成雙功能結(jié)構(gòu)等均成為現(xiàn)實，甚至不需要通過動物免疫即可獲得抗體分子基因，使基因工程抗體的研究在診斷、治療、生物導(dǎo)向等領(lǐng)域的應(yīng)用廣泛而深入，并取得了一些令人振奮的結(jié)果。
蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(PTD)是人類免疫缺陷病毒(HIV) -1所編碼的反式激活蛋白TAT的一段多肽片段，具有獨特的跨膜轉(zhuǎn)運方式，其特點是轉(zhuǎn)導(dǎo)速度快，效率高。PTD能將多肽、寡核苷酸、抗體、酶等多種的生物大分子在短期內(nèi)導(dǎo)入100%的靶細胞。如果將特殊功能的肽段-PTD的基因與抗CD3抗體基因重鏈和輕鏈的可變區(qū)基因選擇性融合，可得到攜帶PTD抗CD3單鏈抗體基因，使CD3進入更快穿透細胞，發(fā)揮其生物功能。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種采用高效疏水相互作用色譜法一步實現(xiàn)攜帶PTD抗人⑶3單鏈抗體(PTD-⑶3)復(fù)性與純化的制備方法。
本發(fā)明實現(xiàn)過程如下: 一種攜帶PTD的抗人CD3單鏈抗體的制備方法，包括以下步驟: (1)天然抗CD3抗體基因與肽段-PTD基因融合得到攜帶PTD抗CD3單鏈抗體基因，將攜帶PTD抗⑶3單鏈抗體基因插入疋coli表達載體pBV220表達，獲得攜帶PTD的抗人⑶3單鏈抗體(PTD-⑶3)重組菌； (2)PTD-⑶3單鏈抗體重組菌在疋coli中的表達產(chǎn)物為含PTD-⑶3的包涵體，將包涵體溶解于6.0 8.0 mol/L脲溶液，使用結(jié)構(gòu)式(I)或(II)所示的高效疏水色譜介質(zhì)進行復(fù)性與純化，收集色譜餾分，得到復(fù)性與純化的PTD-CD3 ；
權(quán)利要求
1.一種攜帶PTD的抗人CD3單鏈抗體的制備方法，包括以下步驟: (1)天然抗CD3抗體基因與肽段-PTD基因融合得到攜帶PTD抗CD3單鏈抗體基因，將攜帶PTD抗⑶3單鏈抗體基因插入疋coli表達載體pBV220表達，獲得攜帶PTD的抗人⑶3單鏈抗體重組菌； (2)PTD-⑶3單鏈抗體重組菌在疋coli中的表達產(chǎn)物為含PTD-⑶3的包涵體，將包涵體溶解于6.0 8.0 mol/L脲溶液，使用結(jié)構(gòu)式(I)或(II)所示的高效疏水色譜介質(zhì)進行復(fù)性與純化，收集色譜餾分，得到復(fù)性與純化的PTD-CD3 ；
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的攜帶PTD的抗人CD3單鏈抗體的制備方法，其特征在于:步驟(I)中，肽段-PTD序列為GRKKRRQRRRPPQ，獲得的PTD-⑶3單鏈抗體重組菌為pBV220/PTD-CD3/DH5 α。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的攜帶PTD的抗人CD3單鏈抗體的制備方法，其特征在于:步驟(2)中，含PTD-⑶3的包涵體用強變性劑6.0 8.0 mol/L脲溶解，放置12小時以上分離，得到含PTD-CD3包涵體變性抽提液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的攜帶PTD的抗人CD3單鏈抗體的制備方法,其特征在于:步驟(2)中，結(jié)構(gòu)式(I)所示的高效疏水相互作用色譜固定相中η等于20。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的攜帶PTD的抗人CD3單鏈抗體的制備方法，其特征在于:步驟(2)中，高效疏水相互作用色譜柱分別為10X20 mm 1.D.餅型分析型或10X50 mm 1.D.半制備色譜柱，裝填色譜柱的壓力大于40 MPa。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的純化PTD-CD3的制備方法，其特征在于，步驟(3)中的體積排阻色譜介質(zhì)為Superdex75R。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種攜帶PTD的抗人CD3單鏈抗體(簡稱PTD-CD3)復(fù)性與純化的制備方法。首先將形成PTD-CD3單鏈抗體包涵體溶解在脲溶液中，采用硅膠基質(zhì)高效疏水相互作用色譜(HPHIC)柱或色譜餅進行PTD-CD3單鏈抗體復(fù)性并同時純化。對該方法色譜條件優(yōu)化和HPSEC除鹽獲得質(zhì)量回收率為46%，純度為96%的PTD-CD3單鏈抗體，競爭結(jié)合抑制作用證實PTD-CD3具有天然CD3單鏈抗體的生物活性。
文檔編號C07K1/16GK103173478SQ20131006600
公開日2013年6月26日 申請日期2013年3月4日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月4日
發(fā)明者王驪麗, 高棟, 耿信篤 申請人:西北大學(xué)