專利名稱：一種治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的膠原蛋白制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種膠原蛋白制備方法，尤其涉及一種治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的膠原蛋白制備方法。
背景技術(shù)：
風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis)是一種常見(jiàn)的急性或慢性結(jié)締組織炎癥。屬變態(tài)反應(yīng)性疾病，是風(fēng)濕熱的主要表現(xiàn)形式之一。多以急性發(fā)熱及關(guān)節(jié)疼痛起病，典型表現(xiàn)是輕度或中度發(fā)熱，游走性多關(guān)節(jié)炎，受累關(guān)節(jié)多為膝、踝、肩、肘、腕等大關(guān)節(jié)，常見(jiàn)由一個(gè)關(guān)節(jié)轉(zhuǎn)移至另一個(gè)關(guān)節(jié)，病變局部呈現(xiàn)紅、腫、灼熱、劇痛，部分病人也有幾個(gè)關(guān)節(jié)同時(shí)發(fā)病，不典型的病人僅有關(guān)節(jié)疼痛而無(wú)其他炎癥表現(xiàn)，急性炎癥一般于2-4周消退，不留后遺癥，但常反復(fù)發(fā)作。若風(fēng)濕活動(dòng)影響心臟，則可發(fā)生心肌炎，甚至遺留心臟瓣膜病變。風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的病因尚未完全明了。根據(jù)癥狀、流行病學(xué)及免疫學(xué)的資計(jì)分析，認(rèn)為與人體溶血性鏈球菌感染密切相關(guān)，目前注意到病毒感染與本病也有一定關(guān)系。目前治療的方式主要有五種一、中醫(yī)推拿能對(duì)風(fēng)濕病癥狀的緩解起到輔助作用，這是風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的中醫(yī)治療方法；二、藥物治療藥物治療的原則在于早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療，并能及早合理、聯(lián)合用藥；三、外科療法包括不同的僥幸手術(shù)，人工關(guān)節(jié)的置換、滑膜切除等。手術(shù)不能治愈風(fēng)濕病，只能改善關(guān)節(jié)功能和生活的能力；四、物理、康復(fù)、職業(yè)訓(xùn)練、心理等其它的治療方法，是風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的中醫(yī)治療方法；五、膏藥治療使用膏藥外治法，針對(duì)性給藥，使藥效得到充分吸收，從而實(shí)現(xiàn)舒筋活絡(luò)，散寒定痛，調(diào)肝益腎，通利關(guān)節(jié)之功效，達(dá)到治愈風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的目的。II型膠原蛋白存在于軟骨等組織中，口服同種屬或異種屬II型膠原蛋白均有抑制、減輕動(dòng)物模型關(guān)節(jié)炎和人類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)的作用，是一種很好的藥物治療成分，但現(xiàn)有的制備方法所制備的II型膠原蛋白，蛋白質(zhì)含量低，分子量大，不能滿足醫(yī)藥需要，因此，需要一種提高蛋白質(zhì)的含量，降低分子量的制備方法來(lái)滿足醫(yī)藥工業(yè)需要。`

發(fā)明內(nèi)容
為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的問(wèn)題，本發(fā)明的目的是提供一種治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的膠原蛋白制備方法。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)手段是一種治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的膠原蛋白制備方法，其制備步驟如下
一、除雜取定量新鮮動(dòng)物軟骨，剝?nèi)ス悄?，置于液氮下冷凍，再磨成粉末，將軟骨粉末置于容器中，加入其質(zhì)量15倍體積的鹽酸胍-Tris-HCl緩沖液，于4 °C下攪拌處理16h，鹽酸胍-Tris-HCl緩沖液中鹽酸肌的濃度為6mol/L，Tris濃度為O. lmmol/L, pH值為7. 5 ；
二、提取處理完成后用冷凍離心機(jī)離心30min，轉(zhuǎn)速設(shè)置8000r/min，收集沉淀，用
O.6mmol/L乙酸充分洗漆,然后加入其質(zhì)量5倍體積的O. 6mmol/L乙酸，內(nèi)含1. 5g/L胃蛋白酶懸浮，于4°C下攪拌水解36h ；三、分離水解完成后，以12000r/min離心處理30min,收集上層清液,用2mmol/L的NaCl鹽析24h,離心，收集沉淀用O. 2mmol/L乙酸溶解后裝入透析袋,用緩沖液進(jìn)行透析溶解，緩沖液濃度及組成為O. lmmol/L Tris-HCl-0. 4mmol/L NaCl，pH=7. 4，此透析溶解液即為粗II型膠原蛋白；
四、純化將大孔離子交換樹(shù)脂NKA-9經(jīng)O.lmmol/L Tris-HCl和O. 4mmol/L NaCl，pH=7. 4平衡后，裝入交換柱內(nèi)，控制樹(shù)脂柱徑高比> 5，緩緩加入經(jīng)平衡液透析后的粗II型膠原蛋白，調(diào)節(jié)過(guò)柱流速為每小時(shí)3 4倍樹(shù)脂體積，用核酸蛋白檢測(cè)儀于280nm監(jiān)測(cè)流出液的第一個(gè)吸收峰，收集有吸收峰的流出液；
五、脫鹽干燥向流出液中加入2mmol/LNaCl溶液，鹽析II型膠原蛋白，于4°C下沉淀10-12h,用冷凍離心機(jī)離心20min,轉(zhuǎn)速設(shè)置8000r/min,收集沉淀用O. 6mmol/L乙酸重新溶解，裝入透析袋中，對(duì)水透析過(guò)夜，最后冷凍干燥，獲得純化II型膠原蛋白。進(jìn)一步的，所述步驟五中所得的純化II型膠原蛋白為白色粉末，蛋白質(zhì)含量彡94%，平均分子量400-800道爾頓。本發(fā)明的有益效果在于通過(guò)本方法制備了高純度的能用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的膠原蛋白，蛋白質(zhì)含量>94%，平均分子量400-800道爾頓，且制備方法簡(jiǎn)便，利于規(guī)模生產(chǎn)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，以助于理解本發(fā)明的內(nèi)容。實(shí)施例1
一種治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的膠原蛋白制備方法，其制備步驟如下
一、除雜取3kg新鮮動(dòng)物軟骨，剝?nèi)ス悄?，置于液氮下冷凍，再磨成粉末，將軟骨粉末置于容器中，加入其質(zhì)量15倍體積的鹽酸胍-Tris-HCl緩沖液，于4 °C下攪拌處理16h，鹽酸胍-Tris-HCl緩沖液中鹽酸肌的濃度為6mol/L，Tris濃度為O. lmmol/L, pH值為7. 5 ；
二、提取處理完成后用冷凍離心機(jī)離心30min，轉(zhuǎn)速設(shè)置8000r/min，收集沉淀，用
O.6mmol/L乙酸充分洗漆,然后加入其質(zhì)量5倍體積的O. 6mmol/L乙酸，內(nèi)含1. 5g/L胃蛋白酶懸浮，于4°C下攪拌水解36h ；
三、分離水解完成后，以12000r/min離心處理30min,收集上層清液,用2mmol/L的NaCl鹽析24h,離心,收集沉淀用O. 2mmol/L乙酸溶解后裝入透析袋,用緩沖液進(jìn)行透析溶解，緩沖液濃度及組成為O. lmmol/L Tris-HCl-0. 4mmol/L NaCl，pH=7. 4，此透析溶解液即為粗II型膠原蛋白；
四、純化將大孔離子交換樹(shù)脂NKA-9經(jīng)O.lmmol/L Tris-HCl和0. 4mmol/L NaCl，pH=7. 4平衡后，裝入交換柱內(nèi)，控制樹(shù)脂柱徑高比> 5，緩緩加入經(jīng)平衡液透析后的粗II型膠原蛋白，調(diào)節(jié)過(guò)柱流速為每小時(shí)3倍樹(shù)脂體積，用核酸蛋白檢測(cè)儀于280nm監(jiān)測(cè)流出液的第一個(gè)吸收峰，收集有吸收峰的流出液；
五、脫鹽干燥向流出液中加入2mmol/LNaCl溶液，鹽析II型膠原蛋白，于4°C下沉淀IOh,用冷凍離心機(jī)離心20min,轉(zhuǎn)速設(shè)置8000r/min,收集沉淀用0. 6mmol/L乙酸重新溶解，裝入透析袋中，對(duì)水透析過(guò)夜，最后冷凍干燥，獲得純化II型膠原蛋白。 所得純化II型膠原蛋白為白色粉末，蛋白質(zhì)含量94. 7 %，平均分子量400-800道爾頓。實(shí)施例2
一種治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的膠原蛋白制備方法，其制備步驟如下
一、除雜取5kg新鮮動(dòng)物軟骨，剝?nèi)ス悄?，置于液氮下冷凍，再磨成粉末，將軟骨粉末置于容器中，加入其質(zhì)量15倍體積的鹽酸胍-Tris-HCl緩沖液，于4 °C下攪拌處理16h，鹽酸胍-Tris-HCl緩沖液中鹽酸肌的濃度為6mol/L，Tris濃度為O. lmmol/L, pH值為7. 5 ；
二、提取處理完成后用冷凍離心機(jī)離心30min，轉(zhuǎn)速設(shè)置8000r/min，收集沉淀，用
O.6mmol/L乙酸充分洗漆,然后加入其質(zhì)量5倍體積的O. 6mmol/L乙酸，內(nèi)含1. 5g/L胃蛋白酶懸浮，于4°C下攪拌水解36h ；
三、分離水解完成后，以12000r/min離心處理30min,收集上層清液,用2mmol/L的NaCl鹽析24h,離心，收集沉淀用O. 2mmol/L乙酸溶解后裝入透析袋,用緩沖液進(jìn)行透析溶解，緩沖液濃度及組成為O. lmmol/L Tris-HCl-0. 4mmol/L NaCl，pH=7. 4，此透析溶解液即為粗II型膠原蛋白；
四、純化將大孔離子交換樹(shù)脂NKA-9經(jīng)O.lmmol/L Tris-HCl和O. 4mmol/L NaCl，pH=7. 4平衡后，裝入交換柱內(nèi)， 控制樹(shù)脂柱徑高比> 5，緩緩加入經(jīng)平衡液透析后的粗II型膠原蛋白，調(diào)節(jié)過(guò)柱流速為每小時(shí)4倍樹(shù)脂體積，用核酸蛋白檢測(cè)儀于280nm監(jiān)測(cè)流出液的第一個(gè)吸收峰，收集有吸收峰的流出液；
五、脫鹽干燥向流出液中加入2mmol/LNaCl溶液，鹽析II型膠原蛋白，于4°C下沉淀12h,用冷凍離心機(jī)離心20min,轉(zhuǎn)速設(shè)置8000r/min,收集沉淀用O. 6mmol/L乙酸重新溶解，裝入透析袋中，對(duì)水透析過(guò)夜，最后冷凍干燥，獲得純化II型膠原蛋白。所得純化II型膠原蛋白為白色粉末，蛋白質(zhì)含量94. 6 %，平均分子量400-800道爾頓。本發(fā)明的實(shí)施例所表述的，并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，可輕易想到變化或替換，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的膠原蛋白制備方法，其特征在于，制備步驟如下 一、除雜取定量新鮮動(dòng)物軟骨，剝?nèi)ス悄?，置于液氮下冷凍，再磨成粉末，將軟骨粉末置于容器中，加入其質(zhì)量15倍體積的鹽酸胍-TriS-HCl緩沖液，于4 °C下攪拌處理16h，鹽酸胍-Tris-HCl緩沖液中鹽酸肌的濃度為6mol/L，Tris濃度為O. lmmol/L, pH值為7. 5 ； 二、提取處理完成后用冷凍離心機(jī)離心30min，轉(zhuǎn)速設(shè)置8000r/min，收集沉淀，用O.6mmol/L乙酸充分洗漆,然后加入其質(zhì)量5倍體積的O. 6mmol/L乙酸，內(nèi)含1. 5g/L胃蛋白酶懸浮，于4°C下攪拌水解36h ； 三、分離水解完成后，以12000r/min離心處理30min,收集上層清液,用2mmol/L的NaCl鹽析24h,離心,收集沉淀用O. 2mmol/L乙酸溶解后裝入透析袋,用緩沖液進(jìn)行透析溶解，緩沖液濃度及組成為O. lmmol/L Tris-HCl-0. 4mmol/L NaCl，pH=7. 4，此透析溶解液即為粗II型膠原蛋白； 四、純化將大孔離子交換樹(shù)脂NKA-9經(jīng)O.lmmol/L Tris-HCl和O. 4mmol/L NaCl，pH=7. 4平衡后，裝入交換柱內(nèi)，控制樹(shù)脂柱徑高比> 5，緩緩加入經(jīng)平衡液透析后的粗II型膠原蛋白，調(diào)節(jié)過(guò)柱流速為每小時(shí)3 4倍樹(shù)脂體積，用核酸蛋白檢測(cè)儀于280nm監(jiān)測(cè)流出液的第一個(gè)吸收峰，收集有吸收峰的流出液； 五、脫鹽干燥向流出液中加入2mmol/LNaCl溶液，鹽析II型膠原蛋白，于4°C下沉淀10-12h,用冷凍離心機(jī)離心20min,轉(zhuǎn)速設(shè)置8000r/min,收集沉淀用O. 6mmol/L乙酸重新溶解，裝入透析袋中，對(duì)水透析過(guò)夜，最后冷凍干燥，獲得純化II型膠原蛋白。
2.根據(jù)權(quán)力要求I所述的治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的膠原蛋白制備方法，其特征在于所述步驟五中所得的純化II型膠原蛋白為白色粉末，蛋白質(zhì)含量>94%，平均分子量400-800道爾頓。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的膠原蛋白制備方法，其步驟包括一、除雜；二、提取；三、分離；四、純化；五、脫鹽干燥，收集沉淀重新溶解，裝入透析袋中，對(duì)水透析過(guò)夜，最后冷凍干燥，獲得純化Ⅱ型膠原蛋白。通過(guò)本方法制備了高純度的能用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的膠原蛋白，蛋白質(zhì)含量≥94％，平均分子量400-800道爾頓，且制備方法簡(jiǎn)便，利于規(guī)模生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C07K1/18GK103060415SQ20131001305
公開(kāi)日2013年4月24日 申請(qǐng)日期2013年1月15日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月15日
發(fā)明者曹榮軍, 任憲君, 武鑫, 劉少芳, 張秋艷, 金海明, 姚秀芬, 臺(tái)文靜 申請(qǐng)人:青島貝爾特生物科技有限公司