陽離子和陰離子交換層析法
【專利摘要】本文報(bào)道了一種用于純化多肽的方法，所述方法包括以下步驟：i)將包含多肽的溶液施加于離子交換層析材料，和ii)用包含變性劑的溶液回收所述多肽，并由此純化所述多肽，其中所述離子交換層析材料包含已經(jīng)連接有離子配體的交聯(lián)的聚(苯乙烯-二乙烯基苯)基質(zhì)，并且其中所述施加于離子交換層析材料的包含多肽的溶液不含有變性劑，并且用恒定電導(dǎo)率的包含變性劑的溶液回收吸附在離子交換層析材料上的多肽。
【專利說明】陽離子和陰離子交換層析法
[0001]本文中報(bào)道了通過用包含變性劑的溶液從離子層析材料洗脫多肽來純化所述多肽的離子交換層析法。
[0002]發(fā)明背景
[0003]蛋白質(zhì)在當(dāng)今的醫(yī)療方案中發(fā)揮重要作用。現(xiàn)有技術(shù)中熟知生產(chǎn)重組多肽的表達(dá)系統(tǒng)。主要在原核細(xì)胞(諸如大腸桿菌)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞(諸如CHO細(xì)胞、NSO細(xì)胞、Sp2/0細(xì)胞、COS細(xì)胞、HEK細(xì)胞、BHK細(xì)胞、PER.C6?細(xì)胞等)中生產(chǎn)用于藥物應(yīng)用的多肽。
[0004]對于人類應(yīng)用，每種藥用物質(zhì)必須符合不同的標(biāo)準(zhǔn)。為確保生物藥劑對人類的安全性，例如，必須除去可導(dǎo)致嚴(yán)重傷害的核酸、病毒和宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)。為滿足監(jiān)管規(guī)格，在制造過程后必須有一個(gè)或多個(gè)純化步驟。除了其它因素以外，純度、處理量和產(chǎn)量在確定適當(dāng)?shù)募兓^程中起重要作用。
[0005]已經(jīng)確定地 建立了不同的方法，并廣泛用于蛋白質(zhì)純化，例如使用微生物蛋白質(zhì)的親和層析法(例如蛋白A或蛋白G親和層析法)、離子交換層析法(例如陽離子交換(磺丙基或羧甲基樹脂)、陰離子交換(氨基乙基樹脂)和混合模式離子交換)、親硫吸附(例如用β_巰基乙醇和其它SH配體)、疏水相互作用或芳族吸附層析法(例如用苯基-瓊脂、aza-arenophilic樹脂或間-氨基苯基硼酸)、金屬螯合親和層析法(例如用Ni (II)-和Cu(II)-親和材料)、尺寸排阻層析法，和電泳方法(例如凝膠電泳、毛細(xì)管電泳)(參見例如 Vijayalakshmi, M.A.，Appl.Biochem.Biotech.75 (1998) 93-102)。
[0006]Necina, R.,等人(Biotechnol.Bioeng.60 (1998) 689-698)報(bào)道了用表現(xiàn)出高電荷密度的離子交換介質(zhì)從細(xì)胞培養(yǎng)物上清液直接捕獲人單克隆抗體。在WO 89/05157中，報(bào)道了一種通過對細(xì)胞培養(yǎng)基直接進(jìn)行陽離子交換處理而純化產(chǎn)物免疫球蛋白的方法。Danielsson, A.，等人，J.1mmun.Meth.115 (1988) 79-88 描述了從小鼠腹水中一步純化單克隆IgG抗體。在WO 2004/024866中報(bào)道了一種通過離子交換層析法純化多肽的方法，其中使用梯度洗滌使目標(biāo)多肽與一種或多種污染物分開。在EP O 530 447中，報(bào)道了一種通過3個(gè)層析步驟的組合來純化IgG單克隆抗體的方法。Wang,等人(Wang, H.,等人，Peptides26 (2005) 1213-1218)報(bào)道了通過兩步陽離子交換層析法純化在大腸桿菌中表達(dá)的 hTFF3。
[0007]在WO 2010/063717中報(bào)道了多肽純化。在WO 2008/002235中報(bào)道了蛋白純化和鑒別。Cole，D.R.，報(bào)道了在含脲的緩沖液中的胰島素層析法(J.Biol.Chem.235(1960)2294-2299)。在US4，129，560中報(bào)道了一種使用非離子型去污劑純化高分子量肽的方法。在WO 2004/031213中報(bào)道了一種制備生長激素及其拮抗劑(其具有較低水平的其異形體雜質(zhì))的方法。在US 6，451，987中報(bào)道了蛋白質(zhì)和肽的離子交換層析法。在EP O 013 826中報(bào)道了一種純化胰島素的方法和如此制備的胰島素。
[0008]發(fā)明概沭
[0009]已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，用包含變性劑/離液劑的溶液可以從離子交換層析材料(陽離子和/或陰離子交換層析材料)回收多肽，其中在從離子交換層析材料回收多肽的過程中，施加的溶液的電導(dǎo)率維持恒定，即使電導(dǎo)率保持恒定。[0010]本文報(bào)道的一個(gè)方面是，一種通過離子交換層析法以結(jié)合和洗脫模式得到或純化多肽的方法，所述方法包括以下步驟:
[0011]-通過施加包含變性劑的溶液，從離子交換層析材料回收多肽，并由此得到或純化多肽，
[0012]其中所述離子交換層析材料包含已經(jīng)連接有離子配體的交聯(lián)的聚(苯乙烯-二乙烯基苯)基質(zhì)。
[0013]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括以下步驟:
[0014]-通過施加包含變性劑的溶液，從第一離子交換層析材料回收多肽，
[0015]-將所述回收的多肽施加于第二離子交換層析材料，和
[0016]-通過施加包含變性劑的溶液，從所述第二離子交換層析材料回收多肽，并由此得到或純化多肽。
[0017]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一離子交換層析材料是陰離子交換層析材料，并且所述第二離子交換層析材料是陽離子交換層析材料。
[0018]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一離子交換層析材料是陽離子交換層析材料，并且所述第二離子交換層析材料是陰離子交換層析材料。
[0019]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述變性劑是脲或脲衍生物。
[0020]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述變性劑是2種或3種變性劑的混合物。
[0021]在一個(gè)實(shí)施方案中，在所述回收中施加的溶液具有恒定的電導(dǎo)率。
[0022]在一個(gè)實(shí)施方案中，在所述洗滌步驟中施加的溶液具有恒定的電導(dǎo)率。
[0023]在一個(gè)實(shí)施方案中，在所述回收中施加的溶液具有恒定的pH值。
[0024]在一個(gè)實(shí)施方案中，在所述洗滌步驟中施加的溶液具有恒定的pH值。
[0025]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括以下步驟:
[0026]-將包含天然形式的多肽的溶液施加于離子交換層析材料，和
[0027]-通過施加包含變性劑的溶液，從離子交換層析材料回收多肽，并由此得到或純化多肽。
[0028]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述離子交換層析材料是陽離子交換層析材料。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述配體是磺丙基或羧甲基。
[0029]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述離子交換層析材料是陰離子交換層析材料。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述配體是聚乙烯亞胺或季銨化的乙烯亞胺。
[0030]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽是抗體、或抗體片段、或包含至少一個(gè)抗體結(jié)構(gòu)域的融合多肽。
[0031]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽是四連蛋白-載脂蛋白A-1融合蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述四連蛋白-載脂蛋白A-1融合蛋白具有SEQ ID N0:01、或SEQ ID NO:02、或SEQ ID NO:03、或 SEQ ID NO:04 的氨基酸序列。
[0032]本文報(bào)道的一個(gè)方面是，一種用于生產(chǎn)多肽的方法，所述方法包括以下步驟:
[0033]-培養(yǎng)原核或真核細(xì)胞，所述細(xì)胞包含編碼所述多肽的核酸，
[0034]-從細(xì)胞或/和培養(yǎng)基回收所述多肽，
[0035]-通過以包涵體形式回收所述多肽，溶解和/或重折疊所述多肽，
[0036]-用本文報(bào)道的離子交換層析法純化所述多肽，并由此生產(chǎn)所述多肽。[0037]發(fā)明詳沭
[0038]本文報(bào)道了用于純化多肽的以結(jié)合和洗脫模式運(yùn)行的可縮放的離子交換層析法，其中用包含變性劑的溶液從離子交換層析材料回收多肽，其中在回收步驟中使用的溶液的電導(dǎo)率維持恒定。 [0039]術(shù)語“施加于”及其語法等效詞表示純化方法的部分步驟，其中將含有待純化的目標(biāo)物質(zhì)的溶液與固定相接觸。這表示:a)將溶液加到固定相所在的層析裝置，或b)將固定相加到包含目標(biāo)物質(zhì)的溶液。在情況a)中，含有待純化的目標(biāo)物質(zhì)的溶液流過固定相，允許固定相和溶液中的物質(zhì)之間的相互作用。取決于條件，例如pH、電導(dǎo)率、鹽濃度、溫度和/或流速，溶液的一些物質(zhì)與固定相結(jié)合，并因而從溶液中除去。其它物質(zhì)留在溶液中。留在溶液中的物質(zhì)可在流通液中找到?！傲魍ㄒ骸敝冈谕ㄟ^層析裝置后得到的與其來源無關(guān)的溶液。它可以是含有目標(biāo)物質(zhì)的施加的溶液，或用于沖洗柱或用于洗脫結(jié)合于固定相的一種或多種物質(zhì)的緩沖液。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述層析裝置是柱或盒。通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的方法(例如沉淀、鹽析、超濾、滲濾、低壓凍干法、親和層析法或減少溶劑體積)進(jìn)行純化步驟后，可以從溶液回收目標(biāo)物質(zhì)，以得到純化的或甚至基本上均質(zhì)形式的目標(biāo)物質(zhì)。在情況b)中，將固定相(例如作為固體)加入含有待純化的目標(biāo)物質(zhì)的溶液中，允許固定相或溶液中的物質(zhì)之間的相互作用。在相互作用后，通過例如過濾除去固定相，目標(biāo)物質(zhì)結(jié)合于固定相并與之一起從溶液除去，或者目標(biāo)物質(zhì)不結(jié)合于固定相且留在溶液中。
[0040]如本申請中所用的術(shù)語“緩沖的”表示這樣的溶液:其中由于酸性或堿性物質(zhì)的加入或釋放導(dǎo)致的pH改變被緩沖物質(zhì)拉平。可使用任何導(dǎo)致此類效應(yīng)的緩沖物質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述緩沖物質(zhì)選自磷酸或其鹽、乙酸或其鹽、檸檬酸或其鹽、嗎啉、2-(N-嗎啉代)乙磺酸或其鹽、咪唑或其鹽、組氨酸或其鹽、甘氨酸或其鹽或三(羥甲基)氨基甲烷(TRIS)或其鹽。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述緩沖物質(zhì)選自咪唑或其鹽或者組氨酸或其鹽。任選地，緩沖的溶液也可包含額外的無機(jī)鹽。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述無機(jī)鹽選自氯化鈉、硫酸鈉、氯化鉀、硫酸鉀、檸檬酸鈉和檸檬酸鉀。
[0041]“多肽”是由通過肽鍵連接的氨基酸組成的聚合物，無論是天然產(chǎn)生的還是合成的。具有少于約20個(gè)氨基酸殘基的多肽可稱為“肽”，而由兩個(gè)或更多個(gè)多肽組成、或包含一個(gè)多于100個(gè)氨基酸殘基的多肽的分子可稱為“蛋白質(zhì)”。多肽也可包含非氨基酸組分，例如糖基、金屬離子或羧酸酯。非氨基酸組分可由在其中表達(dá)多肽的細(xì)胞添加，并可隨細(xì)胞類型而改變。本文中以其氨基酸主鏈結(jié)構(gòu)或編碼其氨基酸主鏈結(jié)構(gòu)的核酸的方式來限定多肽。添加物例如糖基通常不進(jìn)行詳細(xì)說明，但可存在。
[0042]術(shù)語“抗體”表示包含至少兩條輕多肽鏈和兩條重多肽鏈的蛋白。每條重多肽鏈和輕多肽鏈包含含有用于與抗原相互作用的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的可變區(qū)(一般為多肽鏈的氨基端部分)。每條重多肽鏈和輕多肽鏈還包含恒定區(qū)(一般為多肽鏈的羧基端部分)，所述恒定區(qū)可介導(dǎo)抗體與宿主組織或因子(包括免疫系統(tǒng)的各種細(xì)胞、一些吞噬細(xì)胞和經(jīng)典補(bǔ)體系統(tǒng)的第一組分(Clq))的結(jié)合。通常，輕多肽鏈和重多肽鏈?zhǔn)歉髯曰旧嫌煽勺儏^(qū)(即'或％)和完整恒定區(qū)(即在輕多肽鏈的情況下為Q，或在重多肽鏈的情況下為Ch1、Ch2、Ch3、和任選的(^4)組成的完整鏈。可以將根據(jù)本發(fā)明的抗體的可變區(qū)移植至其它同利型的恒定區(qū)。例如，可以將編碼1-同種型的重鏈可變區(qū)的多核苷酸移植至編碼另一種重鏈類型(或亞類)的恒定區(qū)的多核苷酸。[0043]抗體可以以多種形式存在，包括，例如，F(xiàn)v、Fab和F(ab)2以及單鏈(例如Huston, J.S.,等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA85 (1988) 5879-5883 ；Bird, R.E.,等人，Science242 (1988) 423-426 ;和，一般而言，Hood,等人,Immunology, Benjamin N.Y.,第 2版，The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc.(1984), ^PHunkapiller, T.和Hood，L.，Nature323 (1986) 15-16)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體選自單克隆抗體、分離的重鏈或輕鏈、或僅由恒定區(qū)及其片段組成的重鏈或輕鏈。
[0044]術(shù)語“恒定的”表示，特定值維持在具有至多10%的相對變化的水平。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述回收步驟中的溶液的電導(dǎo)率維持恒定，具有至多± 10%的變化。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述回收步驟中的溶液的電導(dǎo)率維持恒定，具有至多±5%的變化。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述回收步驟中的溶液的電導(dǎo)率維持恒定，具有至多±2%的變化。
[0045]術(shù)語“結(jié)合和洗脫模式”表示實(shí)施層析純化方法的方式。本文中將含有待純化的目標(biāo)多肽的溶液施加于固定相，特別是固相，由此目標(biāo)多肽與固定相相互作用并被保留在其上。非目標(biāo)物質(zhì)分別隨流通液或上清被除去。然后在第二步驟中，通過施加洗脫溶液從固定相回收目標(biāo)多肽。
[0046]術(shù)語“包涵體”表示聚集的目標(biāo)多肽的致密的細(xì)胞內(nèi)團(tuán)，它構(gòu)成總細(xì)胞蛋白質(zhì)的重要部分，包括原核細(xì)胞的全部細(xì)胞組分。
[0047]術(shù)語“變性的”表示這樣的多肽形式:其中這些具有非天然的二級、三級和/或四級結(jié)構(gòu)。處于此非天然形式的多肽可為可溶性的，但伴隨地處于無生物活性的構(gòu)象?；蛘叨嚯目蔀椴豢扇苄缘?，并處于無生物活性的構(gòu)象，具有例如錯(cuò)配的或未形成的二硫鍵。此不可溶多肽可以但不一定包含于包涵體內(nèi)。
[0048]術(shù)語“重折疊的 ”表示從變性形式得到的多肽。通常，重折疊的目標(biāo)是，生產(chǎn)與沒有重折疊步驟生產(chǎn)的蛋白質(zhì)相比具有更高活性水平的蛋白質(zhì)。折疊的蛋白質(zhì)分子在處于具有最低自由能的構(gòu)象時(shí)是最穩(wěn)定的。大部分水溶性蛋白質(zhì)以這樣的方式折疊:大部分疏水性氨基酸位于分子內(nèi)部，遠(yuǎn)離水。將蛋白質(zhì)維持在一起的弱鍵可以被多種導(dǎo)致多肽解折疊(即變性)的處理破壞。折疊的蛋白質(zhì)是氨基酸本身和它們的環(huán)境之間的多種類型的相互作用(包括離子鍵、范德華相互作用、氫鍵、二硫鍵和共價(jià)鍵)的產(chǎn)物。
[0049]本文中使用的術(shù)語“變性的”或“變性化的”表示這樣的多肽:其中存在于它的天然或重折疊狀態(tài)的分子中的離子鍵和共價(jià)鍵以及范德華相互作用被破壞。多肽的變性可以如下完成:例如通過用8M脲、還原劑例如巰基乙醇、熱、pH、溫度和其它化學(xué)試劑處理。例如SM脲等試劑會(huì)破壞氫鍵和疏水鍵，并且如果也加入了巰基乙醇，在半胱氨酸之間形成的二硫橋(S-S)被還原為兩個(gè)-S-H基團(tuán)。在其天然或重折疊狀態(tài)下含有二硫鍵的多肽的重折疊也可涉及存在于蛋白質(zhì)的半胱氨酸殘基上的-S-H基團(tuán)的氧化，以重新形成二硫鍵。
[0050]術(shù)語“離液劑”或“變性劑”可以互換使用，表示扭曲多肽的三維結(jié)構(gòu)的化合物。該過程也稱為變性。離液劑會(huì)扭曲/破壞通過諸如氫鍵或范德華力等非共價(jià)力形成的相互作用。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述離液劑選自:丁醇、乙醇、1-和2-丙醇、鹽酸胍、氯化鎂、十二烷基/月桂基硫酸納、服和硫服。
[0051]術(shù)語“處于天然形式”表示這樣的多肽形式:其中它具有二級、三級和/或四級結(jié)構(gòu)，呈所述結(jié)構(gòu)時(shí)，多肽具有它的生物活性。
[0052]術(shù)語“離子交換層析材料”表示固定的高分子量基質(zhì)，其承載共價(jià)結(jié)合的帶電荷取代基。就總體電荷中性而言，非共價(jià)結(jié)合的抗衡離子通過離子相互作用與帶電荷的取代基結(jié)合?！半x子交換層析材料”具有用它的非共價(jià)結(jié)合的抗衡離子交換周圍溶液的帶類似電荷的結(jié)合配偶體或離子的能力。取決于它的可交換的抗衡離子的電荷，“離子交換層析材料”被稱作“陽離子交換層析材料”或“陰離子交換層析材料”。取決于帶電荷基團(tuán)(取代基)的性質(zhì)，例如在陽離子交換材料的情況下，“離子交換層析材料”被稱作磺酸或磺丙基樹脂
(S)或羧甲基樹脂(CM)。取決于帶電荷基團(tuán)/取代基的化學(xué)性質(zhì)，“離子交換層析材料”又可以分類為強(qiáng)或弱離子交換材料，這取決于共價(jià)結(jié)合的帶電荷取代基的強(qiáng)度。例如，強(qiáng)陽離子交換材料具有磺酸基(諸如磺丙基)作為帶電荷取代基，弱陽離子交換材料具有羧酸基團(tuán)(諸如羧甲基)作為帶電荷取代基。強(qiáng)陰離子交換材料具有季銨基，弱陰離子交換材料具有二乙基氨基乙基作為帶電荷取代基。
[0053]通常，離子交換層析步驟的位置可在多肽的多步純化次序中變化。
[0054]確定地建立并廣泛使用用于純化多肽的方法。它們被單獨(dú)地或組合地使用。此類方法是:例如，使用具有絡(luò)合的金屬離子(例如使用Ni (II)-和Cu (II)-親和材料)的硫醇配體或微生物衍生的蛋白質(zhì)(例如蛋白A或蛋白G親和層析法)的親和層析法、離子交換層析法(例如陽離子交換(羧甲基樹脂)、陰離子交換(氨基乙基樹脂)和混合模式交換層析法)、親硫吸附(例如使用β -巰基乙醇和其它SH配體)、疏水相互作用或芳族吸附層析法(例如使用苯基瓊脂糖、aza-arenophilic樹脂或間_氨基苯基硼酸)、尺寸排阻層析法和制備電泳方法(例如凝膠電泳、毛細(xì)管電泳)。
[0055]免疫球蛋白的純化方法通常包括多步驟層析部分。在第一個(gè)步驟中，通過親和層析法(例如用蛋白A)從免疫球蛋白級分分離非免疫球蛋白多肽和蛋白質(zhì)。然后可以進(jìn)行離子交換層析法。最后，可以進(jìn)行第三個(gè)層析步驟以從同類的多聚體和片段分離免疫球蛋白單體。有時(shí)聚集體的量高(5%或更多)且不可能在第三個(gè)純化步驟中有效地分離它們，需要進(jìn)一步的純化步驟。
[0056]已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，用包含變性劑的溶液可以從離子交換層析材料回收多肽，所述離子交換層析材料包含已經(jīng)連接有離子配體的交聯(lián)的聚(苯乙烯-二乙烯基苯)基質(zhì)，其中所述溶液的電導(dǎo)率在回收過程中保持恒定。該發(fā)現(xiàn)是非常驚人的，因?yàn)橥ǔＪ褂秒x子強(qiáng)度的增加來從離子交換層析材料回收多肽。同時(shí)，此層析材料具有足夠的結(jié)合能力用于工業(yè)生產(chǎn)規(guī)模分離。
[0057]因此，本文報(bào)道的一個(gè)方面是，一種用于得到或純化多肽的方法，所述方法包括以下步驟:
[0058]-通過施加包含變性劑的溶液，從離子交換層析材料回收多肽，并由此得到或純化多肽，
[0059]其中所述離子交換層析材料包含已經(jīng)連接有離子配體的交聯(lián)的聚(苯乙烯-二乙烯基苯)基質(zhì)。 [0060]由于使用變性劑回收結(jié)合的多肽，施加于離子交換層析材料的包含多肽的溶液不含有變性劑。用包含變性劑(諸如脲或脲衍生物)和恒定電導(dǎo)率的溶液回收被保留在離子交換層析材料上的多肽。
[0061]因而，以結(jié)合和洗脫模式運(yùn)行本文報(bào)道的方法，即首先使多肽與離子交換層析材料結(jié)合，此后，在另一個(gè)步驟中，從離子交換層析材料回收所述多肽。在本文報(bào)道的方法中可以包括間歇洗滌步驟。在這些洗滌步驟中，施加的溶液基本上不含有變性劑。術(shù)語“基本上不含有變性劑”表示，變性劑可以存在于施加的(洗滌)溶液中，但是其濃度低于從離子交換材料回收多肽所需的濃度。
[0062]在本文報(bào)道的方法中，除了用于從離子交換層析材料回收多肽的溶液以外，所有溶液度沒有(即不含)變性劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述包含變性劑的溶液是水溶液。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述包含變性劑的溶液不包含(即沒有)有機(jī)溶劑和/或脂族醇。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述包含變性劑的溶液由水、變性劑、緩沖物質(zhì)和任選的一種或兩種或三種無機(jī)鹽組成。
[0063]術(shù)語“變性劑”或“離液劑”在本申請中可以互換使用，表示使多肽從它的天然形式轉(zhuǎn)化成非天然(即變性)形式的化合物。變性劑通常是離液劑。示例性的變性劑是脲和脲衍生物、胍和胍衍生物、四烷基銨鹽、長鏈磺酸酯和高氯酸鋰。
[0064]脲的加入(更精確地講，脲的濃度的變化)不會(huì)影響溶液的電導(dǎo)率，即在加入脲或改變脲濃度以后，溶液的電導(dǎo)率保持恒定。
[0065]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述變性劑是脲或脲衍生物。
[0066]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述變性劑是脲。在一個(gè)實(shí)施方案中,所述脲具有4mol/l至9mol/l的濃度。
[0067]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述變性劑是硫脲。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述硫脲具有1.5mol/l 至 3mol/l 的濃度。
[0068]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述變性劑是2種或3種變性劑的混合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述變性劑是脲和硫脲的混合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述變性劑是脲和胍鹽的混合物。
[0069]在本文報(bào)道的方面的一個(gè)實(shí)施方案中，用于純化或得到多肽的方法包括以下步驟:
[0070]-將第一溶液施加于離子交換層析材料以產(chǎn)生經(jīng)調(diào)節(jié)的離子交換層析材料，
[0071]-將包含多肽的第二溶液施加于經(jīng)調(diào)節(jié)的離子交換層析材料，
[0072]-任選地，將第三溶液施加于所述離子交換層析材料，
[0073]-用包含變性劑的第四溶液從所述離子交換層析材料回收并從而純化或得到多肽。
[0074]所述第一和第二溶液基本上不含有變性劑。所述第三溶液基本上不含有變性劑。
[0075]可以在真核和原核細(xì)胞(諸如CHO細(xì)胞、HEK細(xì)胞和大腸桿菌)中重組生產(chǎn)多肽。如果在原核細(xì)胞中生產(chǎn)多肽，通常以不溶性包涵體的形式得到多肽。可容易地從原核細(xì)胞和培養(yǎng)基回收包涵體。在可以進(jìn)行純化和/或重折疊操作之前，必須使在包涵體中得到的不可溶形式的多肽溶解。
[0076]因而，本文報(bào)道的第二方面是，一種用于生產(chǎn)多肽的方法，所述方法包括以下步驟:
[0077]-培養(yǎng)原核或真核細(xì)胞，所述細(xì)胞包含編碼所述多肽的核酸，
[0078]-從原核或真核細(xì)胞或/和培養(yǎng)基回收多肽，`
[0079]-任選地，如果以包涵體的形式回收多肽，則溶解和/或重折疊所述多肽，
[0080]-用本文報(bào)道的離子交換層析法純化所述多肽，并由此生產(chǎn)多肽。[0081]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述離子交換層析法包括以下步驟:
[0082]-將第一溶液施加于離子交換層析材料以產(chǎn)生經(jīng)調(diào)節(jié)的離子交換層析材料，
[0083]-將包含多肽的第二溶液施加于經(jīng)調(diào)節(jié)的離子交換層析材料，
[0084]-任選地，將第三溶液(洗滌步驟)施加于所述離子交換層析材料，
[0085]-用包含一種或多種變性劑的第四溶液從所述離子交換層析材料回收并從而生產(chǎn)所述多肽，
[0086]其中第一至第三溶液不含有變性劑。
[0087]下面呈現(xiàn)如上報(bào)道的全部方面的不同實(shí)施方案。
[0088]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一溶液包含第一緩沖物質(zhì)，所述第二溶液包含第二緩沖物質(zhì)，所述第三溶液包含第三緩沖物質(zhì)，所述第四溶液包含第四緩沖物質(zhì)，其中所述第四緩沖物質(zhì)包含一種或多種變性劑。
[0089]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第二緩沖物質(zhì)和所述第三緩沖物質(zhì)和所述第四緩沖物質(zhì)都是不同的緩沖物質(zhì)。
[0090]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一溶液和/或所述第二溶液和/或所述第三溶液不含有變性劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第三溶液基本上不含有變性劑。
[0091]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一溶液的施加進(jìn)行3-20個(gè)柱體積。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一溶液的施加進(jìn)行3-10個(gè)柱體積。
[0092]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第二溶液的施加進(jìn)行1-10個(gè)柱體積。
[0093]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第三溶液的施加進(jìn)行1-10個(gè)柱體積。
[0094]在第一步驟中用緩沖溶液調(diào)節(jié)離子交換層析材料。該溶液不含有(即不包含)變性劑。調(diào)節(jié)性的第一緩沖溶液的緩沖物質(zhì)可以與包含多肽的第二溶液的緩沖物質(zhì)相同或不同。
[0095]此后，將包含多肽的第二溶液施加于經(jīng)調(diào)節(jié)的離子交換層析材料。在該步驟中，多肽被保留在離子交換層析材料上。該溶液不包含變性劑。加載性的(即第二)緩沖溶液的緩沖物質(zhì)可以與第三溶液的緩沖物質(zhì)相同或不同。
[0096]在給離子交換層析材料加載多肽以后，任選地可以將洗滌性的(即第三)溶液施加于加載的離子交換層析材料。該溶液基本上不含有變性劑。
[0097]最后，為了從離子交換層析材料回收多肽，將包含一種或多種變性劑的回收性的(即第四)溶液施加于層析材料。
[0098]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述純化或得到多肽的方法是柱層析法。
[0099]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述回收步驟中的溶液的電導(dǎo)率是恒定的。
[0100]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述回收步驟中的溶液的pH值是恒定的。
[0101]在不同步驟中施加于離子交換層析材料的體積彼此獨(dú)立地是3-20個(gè)柱體積，在一個(gè)實(shí)施方案中，是4-10個(gè)柱體積。
[0102]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述離子交換層析材料由用官能團(tuán)衍生化的聚苯乙烯二乙烯基苯制成。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述陰離子交換層析材料是用季銨化的聚乙烯亞胺官能團(tuán)衍生化的聚苯乙烯二乙烯基苯。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述陽離子交換層析材料是用磺丙基官能團(tuán)衍生化的聚苯乙烯二乙烯基苯。
[0103]在下面用在WO 2012/028526中報(bào)道的四連蛋白-載脂蛋白A-1融合蛋白和在W2012/007495中報(bào)道的抗-TSLP受體抗體舉例說明了本文報(bào)道的方法。
[0104]提供以下實(shí)施例和附圖以幫助理解本發(fā)明，本發(fā)明的真實(shí)范圍在所附權(quán)利要求書中闡述。應(yīng)當(dāng)理解，可以在不脫離本發(fā)明的精神的情況下對所述操作進(jìn)行修改。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0105]圖1.使用氯化鈉電導(dǎo)率梯度在陰離子交換層析柱上純化SEQ ID NO:01的四連蛋白-載脂蛋白A-1融合蛋白的層析圖。
[0106]圖2.使用具有恒定電導(dǎo)率和恒定pH值的脲梯度在陰離子交換層析柱上純化SEQID NO=Ol的四連蛋白-載脂蛋白A-1融合蛋白的層析圖。
[0107]圖3.使用具有恒定電導(dǎo)率和恒定pH值的脲梯度在陰離子交換層析柱上純化SEQID N0:02的四連蛋白-載脂蛋白A-1融合蛋白的層析圖。
[0108]圖4.使用脲洗滌、異丙醇洗滌和鹽酸胍梯度洗脫在陰離子交換層析柱上純化SEQID NO=Ol的四連蛋白-載脂蛋白A-1融合蛋白的層析圖。
[0109]圖5.使用脲洗滌、鹽酸胍洗滌和氯化鈉梯度洗脫在陰離子交換層析柱上純化SEQID NO=Ol的四連蛋白-載脂蛋白A-1融合蛋白的層析圖。
[0110]圖6.使用脲洗滌、鹽酸胍洗滌和氯化鈉梯度洗脫在陰離子交換層析柱上純化SEQID N0:02的四連蛋白-載脂蛋白A-1融合蛋白的層析圖。
[0111]圖7.使用具有恒定電導(dǎo)率和恒定pH值的脲梯度在陽離子交換層析柱上純化SEQID NO=Ol的四連蛋白-載脂 蛋白A-1融合蛋白的層析圖。
[0112]圖8.使用Tris緩沖液洗滌和脲梯度洗脫在陰離子交換層析柱上純化抗-TSLP受體抗體的層析圖。
[0113]實(shí)施例1
[0114]材料和方法:
[0115]除非另有說明，根據(jù)層析材料制造商的手冊進(jìn)行不同的層析法。
[0116]重組DNA技術(shù):
[0117]用標(biāo)準(zhǔn)方法操作DNA,如 Sambrook, J.,等人，Molecular Cloning:A LaboratoryManual ；Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York(1989)所述。根據(jù)制造商的說明書，使用分子生物學(xué)試劑。
[0118]蛋白質(zhì)確定:
[0119]通過使用320nm的參考波長使用基于氨基酸序列計(jì)算的摩爾消光系數(shù)確定在280nm處的光密度(OD)，確定蛋白質(zhì)濃度。
[0120]尺寸排阻-HPLC:
[0121]用Tosoh Haas TSK 3000 SWXL 柱在 AS1-100HPLC 系統(tǒng)(Dionex，Idstein，德國)上進(jìn)行層析法。通過UV 二極管陣列檢測器(Dionex)在280nm監(jiān)測洗脫峰。在將濃縮的樣品溶解到lmg/ml后，用由200mM磷酸二氫鉀和250mM氯化鉀組成的pH7.0的緩沖液洗滌柱，直到達(dá)到穩(wěn)定的基線。在等度條件下用0.5ml/min的流速在室溫下進(jìn)行分析運(yùn)行30min。使用Chromeleon(Dionex, Idstein,德國)人工積分層析圖。
[0122]反相HPLC (RP-HPLC):
[0123]通過RP-HPLC分析純度。使用乙腈/TFA水溶液梯度在Phenomenex C18柱上進(jìn)行測定。監(jiān)測洗脫譜作為在215nm處的UV吸光度。基于洗脫的蛋白質(zhì)的總峰面積，計(jì)算洗脫的物質(zhì)的百分比。
[0124]DNA-閾值-系統(tǒng):
[0125]參見例如Merrick, H.,和 Hawlitschek, G., Biotech Forum Europe9 (1992) 398-403。
[0126]宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)確定:
[0127]用血清白蛋白和抗生蛋白鏈菌素的混合物包被微量滴定板的孔壁。將源自山羊的抗HCP多克隆抗體結(jié)合到微量滴定板的孔壁。在洗滌步驟后，用不同濃度的HCP校準(zhǔn)序列和樣品溶液溫育微量滴定板的不同孔。在溫育后，通過用緩沖溶液洗滌來除去未結(jié)合的樣品材料。為了檢測，用抗體過氧化物酶綴合物溫育孔，以檢測結(jié)合的宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)。通過與ABTS溫育并在405nm檢測，檢測固定的過氧化物酶活性。
[0128]DNA 確定:
[0129]將生物素結(jié)合到微量滴定板。加入抗生蛋白鏈菌素、單鏈DNA和生物素化的單鏈DNA結(jié)合蛋白的反應(yīng)混合物。結(jié)合蛋白能結(jié)合DNA，并被生物素化。以此方式，可能從樣品混合物特異性地除去DNA?？股鞍祖溇亟Y(jié)合微量滴定板上的生物素以及與單鏈DNA結(jié)合蛋白偶聯(lián)的生物素。向此總復(fù)合物加入與脲酶偶聯(lián)的DNA特異性抗體。脲的加入會(huì)導(dǎo)致脲水解，這會(huì)引起PH的局部變化?？梢詫⒋俗兓瘷z測為以改變的表面電勢。表面電勢的變化與結(jié)合的DNA的量成比例。通過蛋白水解酶K消化和用SDS變性，得到單鏈DNA。
[0130]用于分離、溶解和重折疊得自包涵體的多肽的一般方法:
[0131]除了在引用的文獻(xiàn)中進(jìn)行的方法以外，例如可以根據(jù)Rudolph，等人(Rudolph，R.，等人，F(xiàn)olding Proteins,見:Creighton, Τ.E,(編):Protein function:A PracticalApproach, Oxford University Press (1997) 57-99)的方法進(jìn)行包涵體的制備。在-70°C儲(chǔ)存包涵體。同樣可以根據(jù)Rudolph,等人(Rudolph, R.,等人，F(xiàn)olding Proteins,見:Creighton, T.Ε.,(編):Protei`n function:A Practical Approach, Oxford UniversityPress (1997) 57-99)的方法進(jìn)行包涵體的溶解。
[0132]實(shí)施例2(對比實(shí)施例)
[0133]使用氯化鈉電導(dǎo)率梯度在陰離子交換層析柱上純化SEQ ID N0:01的四連蛋白-載脂蛋白A-1融合蛋白
[0134]樹脂:POROS(E)HQ
[0135]載荷:443mg多肽
[0136]柱載荷:30mg/ml
[0137]洗脫方法:0M至IM氯化鈉線性梯度
[0138]結(jié)果:
[0139]從圖1可以看出不可在確定的峰中得到融合蛋白。分析結(jié)果顯示在下表中。
[0140]表.[0141]
【權(quán)利要求】
1.純化多肽的方法，所述方法包括以下步驟: -用恒定電導(dǎo)率的包含變性劑的溶液從離子交換層析材料回收所述多肽，并由此純化所述多肽， 其中所述離子交換層析材料包含已經(jīng)連接有離子配體的交聯(lián)的聚(苯乙烯-二乙烯基苯)基質(zhì)。
2.生產(chǎn)多肽的方法，所述方法包括以下步驟: -培養(yǎng)原核或真核細(xì)胞，所述細(xì)胞包含編碼所述多肽的核酸， -從細(xì)胞或/和培養(yǎng)基回收所述多肽， -用包含以下步驟的離子交換層析法純化所述多肽 -用包含變性劑的溶液從離子交換層析材料回收所述多肽，并由此生產(chǎn)多肽， 其中所述離子交換層析材料包含已經(jīng)連接有離子配體的交聯(lián)的聚(苯乙烯-二乙烯基苯)基質(zhì)。
3.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述變性劑是一種變性劑，并且所述變性劑選自包括脲、胍、脲衍生物和胍衍生物的組。
4.根據(jù)前述權(quán)利 要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述離子交換層析材料是陽離子交換層析材料。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述離子配體是磺丙基配體或羧甲基配體。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述離子交換層析材料是陰離子交換層析材料。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述離子配體是乙烯亞胺配體或季銨化的配體。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟: -通過施加包含變性劑的溶液，從第一離子交換層析材料回收所述多肽， -將所述回收的多肽施加于第二離子交換層析材料，和 -通過施加包含變性劑的溶液，從所述第二離子交換層析材料回收多肽，并由此得到或純化所述多肽。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于， 所述第一離子交換層析材料是陰離子交換層析材料，并且所述第二離子交換層析材料是陽離子交換層析材料，或 所述第一離子交換層析材料是陽離子交換層析材料，并且所述第二離子交換層析材料是陰離子交換層析材料。
10.根據(jù)權(quán)利要求8-9中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，在施加于所述第二離子交換層析材料之前，將所述回收的多肽重折疊。
11.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述純化包括以下步驟: -將第一溶液施加于所述離子交換層析材料， -將包含所述多肽的第二溶液施加于所述離子交換層析材料，和 -用包含變性劑的第四溶液回收并由此生產(chǎn)或純化所述多肽， 其中所述第一溶液包含第一緩沖物質(zhì)，所述第二溶液包含第二緩沖物質(zhì)，并且所述第四溶液包含第四緩沖物質(zhì)，其中所述第四緩沖物質(zhì)包含變性劑。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，在施加所述第二溶液以后和施加所述第四溶液之前，包括以下步驟: -將第三溶液施加于所述離子交換層析材料， 其中所述第三溶液包含第三緩沖物質(zhì)。
13.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述多肽具有選自SEQIDNO =OUSEQ ID NO:02、SEQ ID NO:03和SEQ ID NO:04的氨基酸序列的組的氨基酸序列。
14.脲或脲衍生物在恒定電導(dǎo)率值從離子交換層析材料回收多肽中的用途，所述離子交換層析材料包含交聯(lián)的聚(苯乙烯-二乙烯基苯)基質(zhì)。
【文檔編號(hào)】C07K1/18GK103703015SQ201280036823
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2012年8月17日 優(yōu)先權(quán)日:2011年8月25日
【發(fā)明者】羅伯托·法爾肯施泰因, 瑪麗亞·勞拉·馬格里, 米夏埃拉·梅爾, 克勞斯·施文納, 伯恩哈德·施彭斯貝格爾 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司