豬血中抗菌肽的提取方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種豬血中抗菌肽的提取方法，它包括以下具體步驟：（1）豬血采集；（2）萃取溶液；（3）溶液除酸、濃縮；（4）抗菌肽的分離；（5）抗菌肽的純化與濃縮。本發(fā)明方法實(shí)現(xiàn)了從豬血中提取具有較強(qiáng)抗菌活性的多肽物質(zhì)，為生產(chǎn)抗菌肽提供了一個(gè)新的途徑和方法；采用本發(fā)明方法生產(chǎn)的抗菌肽，屬于天然提取物，具有天然、無毒、無污染、無殘留、無副作用、高效抗菌等特點(diǎn)，是一種新型的綠色抗微生物藥物；采用本發(fā)明方法提取的抗菌肽，具有廣譜抗菌、抗病毒、不產(chǎn)生耐藥性、有免疫調(diào)節(jié)作用等功能。
【專利說明】豬血中抗菌肽的提取方法
[0001]
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明屬于抗菌肽的提取方法，具體涉及一種豬血中抗菌肽的提取方法。
[0003]
【背景技術(shù)】
[0004]目前，由于抗生素的大量濫用，傳統(tǒng)抗生素耐藥性的問題越來越引起人們的關(guān)注，尋求一種無殘留、無耐藥性的新型抗菌藥物已成為當(dāng)務(wù)之急。抗菌肽因?yàn)槠涓咝У囊志Ч蛷V泛而穩(wěn)定的生物活性，逐漸引起人們的興趣和關(guān)注?？咕木哂袕V譜、高效的抗微生物活性，還能促進(jìn)動(dòng)物生長，誘導(dǎo)動(dòng)物的獲得性免疫。而且其獨(dú)特的抗菌機(jī)理不會(huì)使微生物產(chǎn)生耐藥性，在機(jī)體內(nèi)無殘留，具有良好的應(yīng)用開發(fā)前景，抗菌肽的應(yīng)用可能會(huì)帶來一場抗微生物戰(zhàn)略的新革命。
[0005]我國是養(yǎng)豬業(yè)大國，豬血是生豬屠宰加工的廢棄物，如何使該廢棄物產(chǎn)生高值化的利用，具有廢棄物加工利用和公共衛(wèi)生等多方面的重要意義。有關(guān)研究確認(rèn)，豬血中具有較強(qiáng)抗菌活性的多肽，因此開發(fā)研究一種從豬血中提取、純化抗菌肽的成熟方法，可以一舉多得。而目前在國內(nèi)外還未見有從豬血中提取抗菌肽的技術(shù)方法和產(chǎn)品。
[0006]
【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]為了克服現(xiàn)有【技術(shù)領(lǐng)域】存在的上述問題，本發(fā)明的目的在于，提供一種豬血中抗菌肽的提取方法，解決目前國內(nèi)沒有從豬血中提取抗菌肽的技術(shù)方法和產(chǎn)品的問題。
[0008]本發(fā)明提供的豬血中抗菌肽的提取方法，它包括以下具體步驟:
(1)豬血采集:從屠宰場采取新鮮豬血2-3L，使用5%檸檬酸鈉抗凝；
(2)萃取溶液:將新鮮豬血放置37°C溫箱靜置l_2h取上清，按照1:4的比例加入0.84%氯化銨溶液，混勻靜置3min,常溫400r/min,離心10min,棄上清按比例加入氯化銨溶液混勻靜置3min,再次500r/min離心10min ;棄上清,使沉淀與少量冷的生理鹽水，即4°C的生理鹽水短時(shí)間混合，再用200ml冷的10%冰醋酸，即4°C的10%冰醋酸使沉淀懸浮，充分混勻，倒入50ml燒杯，超聲波處理50次，然后溶液使用磁力攪拌器混勻攪動(dòng)于4°C下萃取一夜；次日，將萃取的溶液取出15000r/min離心30min，取上清4°C下保存，沉淀再次混懸于冷的10%醋酸中，充分混勻，混勻攪動(dòng)于4°C下萃取一夜；第三天將萃取的溶液取出15000r/min離心30min,最后將溶液4°C下保存；
(3)溶液除酸、濃縮:合并所保存的溶液，將溶液注入透析袋，扎緊袋口，然后將其放入燒杯，再向燒杯中倒入蒸餾水，蒸餾水液面要超過透析袋，4°C下透析除酸，每12h換水一次，直至透析袋外蒸餾水pH大于6，將透析袋放入瓷盤中，撒上聚乙二醇6000，透析濃縮約3-4h后即可將透析袋取出，將濃縮的溶液取出低溫凍干，轉(zhuǎn)移至青霉素小瓶中，密封-20°C保存；
(4)抗菌肽的分離:將凍干樣品用0.5%甲醇溶解，再上樣于層析柱葡聚糖凝膠SephadexG25,同時(shí)打開柱的下端出口，注意控制流速為lmL/min,5mL/管；用部分收集器收集洗脫液，5mL/管，收集的溶液用紫外分光光度計(jì)測其在280nm處的吸收值，將在280nm處有吸收的溶液分裝于青霉素瓶中，再在低溫凍干機(jī)中凍干，-80°C保存；取各瓶凍干保存的樣品各20mg，分別溶于滅菌雙蒸水中，無菌條件下用微孔濾膜過濾樣品，將藥敏紙片浸泡于過濾后的樣品中，浸泡過夜后，用平皿紙片法初篩，收集具有抗菌活性的組分，置于5°C保存；
(5)抗菌肽的純化與濃縮:使用超濾裝置進(jìn)行超濾，膜包選用截流分子量為20kD。洗脫液選用0.5%甲醇溶液，濾出液既為所要獲得的溶液。
[0009]本發(fā)明提供的豬血中抗菌肽的提取方法，其有益效果在于，本發(fā)明方法實(shí)現(xiàn)了從豬血中提取具有較強(qiáng)抗菌活性的多肽物質(zhì)，為生產(chǎn)抗菌肽提供了一個(gè)新的途徑和方法；采用本發(fā)明方法生產(chǎn)的抗菌肽，屬于天然提取物，具有天然、無毒、無污染、無殘留、無副作用、高效抗菌等特點(diǎn)，是一種新型的綠色抗微生物藥物；采用本發(fā)明方法提取的抗菌肽，具有廣譜抗菌、抗病毒、不產(chǎn)生耐藥性、有免疫調(diào)節(jié)作用等功能；本發(fā)明方法操作方便，所需設(shè)備簡單，分離提取率高；實(shí)施本發(fā)明方法的原料豬血來源豐富，價(jià)格低廉，可以滿足大規(guī)模深化加工的需要，具有很強(qiáng)的開發(fā)應(yīng)用推廣價(jià)值。原料豬血屬于生豬屠宰加工的廢棄物，本發(fā)明方法可使廢棄物得到高值化的利用，因此本發(fā)明具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。
[0010]
【具體實(shí)施方式】
[0011]下面結(jié)合實(shí)施例，對本發(fā)明提供的豬血中抗菌肽的提取方法，進(jìn)行詳細(xì)的說明。實(shí)施例
[0012]參照本實(shí)施例的豬血中抗菌肽的提取方法，它包括以下具體步驟:
(1)豬血采集:從屠宰場采取新鮮豬血2-3L，使用5%檸檬酸鈉抗凝；
(2)萃取溶液:將新鮮豬血放置37°C溫箱靜置l_2h取上清，按照1:4的比例加入0.84%氯化銨溶液，混勻靜置3min,常溫400r/min,離心10min,棄上清按比例加入氯化銨溶液混勻靜置3min,再次500r/min離心10min ;棄上清,使沉淀與少量冷的生理鹽水，即4°C的生理鹽水短時(shí)間混合，再用200ml冷的10%冰醋酸，即4°C的10%冰醋酸使沉淀懸浮，充分混勻，倒入50ml燒杯，超聲波處理50次，然后溶液使用磁力攪拌器混勻攪動(dòng)于4°C下萃取一夜；次日，將萃取的溶液取出15000r/min離心30min，取上清4°C下保存，沉淀再次混懸于冷的10%醋酸中，充分混勻，混勻攪動(dòng)于4°C下萃取一夜；第三天將萃取的溶液取出15000r/min離心30min,最后將溶 液4°C下保存；
(3)溶液除酸、濃縮:合并所保存的溶液，將溶液注入透析袋，扎緊袋口，然后將其放入燒杯，再向燒杯中倒入蒸餾水，蒸餾水液面要超過透析袋，4°C下透析除酸，每12h換水一次，直至透析袋外蒸餾水PH大于6，將透析袋放入瓷盤中，撒上聚乙二醇6000，透析濃縮約3-4h后即可將透析袋取出，將濃縮的溶液取出低溫凍干，轉(zhuǎn)移至青霉素小瓶中，密封-20°C保存；(4)抗菌肽的分離:將凍干樣品用0.5%甲醇溶解，再上樣于層析柱葡聚糖凝膠SephadexG25,同時(shí)打開柱的下端出口，注意控制流速為lmL/min,5mL/管；用部分收集器收集洗脫液，5mL/管，收集的溶液用紫外分光光度計(jì)測其在280nm處的吸收值，將在280nm處有吸收的溶液分裝于青霉素瓶中，再在低溫凍干機(jī)中凍干，-80°C保存；取各瓶凍干保存的樣品各20mg，分別溶于滅菌雙蒸水中，無菌條件下用微孔濾膜過濾樣品，將藥敏紙片浸泡于過濾后的樣品中，浸泡過夜后，用平皿紙片法初篩，收集具有抗菌活性的組分，置于5°C保存；
(5)抗菌肽的純化與濃縮:使用超濾裝置進(jìn)行超濾，膜包選用截流分子量為20kD。洗脫液選用0.5%甲醇溶液，濾出液既為所要獲得的溶液。
[0013]抗菌肽是生物體內(nèi)誘導(dǎo)表達(dá)具有廣譜抗菌活性的小分子多肽。這些多肽是生物體非專一性的免疫應(yīng)答產(chǎn)物，是生物體內(nèi)免疫系統(tǒng)的重要成分。國內(nèi)外關(guān)于豬源抗菌肽的研究，主要針對豬小腸中的抗菌肽，而血中抗菌肽的提取及抗菌活性研究在國內(nèi)外卻很少有報(bào)道?；谪i血液中白細(xì)胞是免疫系統(tǒng)中起主要作用的免疫細(xì)胞，其中性粒細(xì)胞約占白細(xì)胞總量的70%，所以本試驗(yàn)試圖從豬血中性粒細(xì)胞中提取抗菌肽，優(yōu)化提取工藝，提高抗菌肽的回收率和純度。[0014]本發(fā)明方法實(shí)現(xiàn)了從豬血中提取具有較強(qiáng)抗菌活性的多肽物質(zhì)，為生產(chǎn)抗菌肽提供了一個(gè)新的途徑和方法；采用本發(fā)明方法生產(chǎn)的抗菌肽，屬于天然提取物，具有天然、無毒、無污染、無殘留、無副作用、高效抗菌等特點(diǎn)，是一種新型的綠色抗微生物藥物；采用本發(fā)明方法提取的抗菌肽，具有廣譜抗菌、抗病毒、不產(chǎn)生耐藥性、有免疫調(diào)節(jié)作用等功能；本發(fā)明方法操作方便，所需設(shè)備簡單，分離提取率高；實(shí)施本發(fā)明方法的原料豬血來源豐富，價(jià)格低廉，可以滿足大規(guī)模深化加工的需要，具有很強(qiáng)的開發(fā)應(yīng)用推廣價(jià)值。原料豬血屬于生豬屠宰加工的廢棄物，本發(fā)明方法可使廢棄物得到高值化的利用，因此本發(fā)明具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。
【權(quán)利要求】
1.一種豬血中抗菌肽的提取方法，其特征在于:它包括以下具體步驟: (1)豬血采集:從屠宰場采取新鮮豬血2-3L，使用5%檸檬酸鈉抗凝； (2)萃取溶液:將新鮮豬血放置37°C溫箱靜置l_2h取上清，按照1:4的比例加入0.84%氯化銨溶液，混勻靜置3min,常溫400r/min,離心10min,棄上清按比例加入氯化銨溶液混勻靜置3min,再次500r/min離心10min ;棄上清,使沉淀與少量冷的生理鹽水，即4°C的生理鹽水短時(shí)間混合，再用200ml冷的10%冰醋酸，即4°C的10%冰醋酸使沉淀懸浮，充分混勻，倒入50ml燒杯，超聲波處理50次，然后溶液使用磁力攪拌器混勻攪動(dòng)于4°C下萃取一夜；次日，將萃取的溶液取出15000r/min離心30min，取上清4°C下保存，沉淀再次混懸于冷的10%醋酸中，充分混勻，混勻攪動(dòng)于4°C下萃取一夜；第三天將萃取的溶液取出15000r/min離心30min,最后將溶液4°C下保存； (3)除酸、濃縮:合并所保存的溶液，將溶液注入透析袋，扎緊袋口，然后將其放入燒杯，再向燒杯中倒入蒸餾水，蒸餾水液面要超過透析袋，4°C下透析除酸，每12h換水一次，直至透析袋外蒸餾水pH大于6，將透析袋放入瓷盤中，撒上聚乙二醇6000，透析濃縮約3_4h后即可將透析袋取出，將濃縮的溶液取出低溫凍干，轉(zhuǎn)移至青霉素小瓶中，密封-20°C保存； (4)抗菌肽的分離:將凍干樣品用0.5%甲醇溶解，再上樣于層析柱葡聚糖凝膠SephadexG25,同時(shí)打開柱的下端出口，注意控制流速為lmL/min,5mL/管；用部分收集器收集洗脫液，5mL/管，收集的溶液用紫外分光光度計(jì)測其在280nm處的吸收值，將在280nm處有吸收的溶液分裝于青霉素瓶中，再在低溫凍干機(jī)中凍干，-80°C保存；取各瓶凍干保存的樣品各20mg，分別溶于滅菌雙蒸水中，無菌條件下用微孔濾膜過濾樣品，將藥敏紙片浸泡于過濾后的樣品中，浸泡過夜后，用平皿紙片法初篩，收集具有抗菌活性的組分，置于5°C保存； (5)抗菌肽的純化與濃縮:使用超濾裝置進(jìn)行超濾，膜包選用截流分子量為20kD，洗脫液選用0.5%甲醇溶液，濾出液既為`所要獲得的溶液。
【文檔編號(hào)】C07K14/47GK103864912SQ201210550189
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2012年12月18日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月18日
【發(fā)明者】張述智, 夏偉, 朱紹輝, 張 浩, 王曉麗, 徐權(quán)汗, 李之詳, 許團(tuán)輝 申請人:青島中仁藥業(yè)有限公司