一種從人血漿中提取高密度脂蛋白及分離純化載脂蛋白apoA-I的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種從正常人血漿中提取高密度脂蛋白（HDL）及分離純化高純度載脂蛋白apoA-I的方法。它包括以下步驟：1）用中性鹽調(diào)節(jié)血漿到不同密度，采用序列梯度密度超速離心法，排除雜蛋白，獲取高純度HDL組分；2）獲得的高純HDL組分在低溫冷凍狀態(tài)下用一定比例醇醚溶劑進(jìn)行流加法脫脂獲取脫脂后apoHDL沉淀；3）用含1-8M尿素的TBS緩沖液體系復(fù)溶apoHDL沉淀并過濾，濾液先后經(jīng)過分子篩層析和陰離子交換層析，分離純化獲得高純度的apoA-I溶液。本發(fā)明的方法能夠?qū)⒑茈y除掉的白蛋白組分與HDL分離，本方法制備的apoA-I具有非常高的純度和活性，純度可達(dá)98%以上，被倍比稀釋64倍后仍能與抗血清發(fā)生清晰沉淀反應(yīng)，且操作安全方便，提取周期短，適于工業(yè)化生產(chǎn)。
【專利說明】一種從人血漿中提取高密度脂蛋白及分離純化載脂蛋白apoA-1的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種從正常人血漿中提取高密度脂蛋白(HDL)及分離純化高純度載脂蛋白apoA-1的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]流行病學(xué)調(diào)查表明，血漿高密度脂蛋白(HDL)水平與動(dòng)脈粥樣硬化(AS)發(fā)病率呈負(fù)相關(guān)，并具有對(duì)抗AS的作用。
[0003]HDL主要由載脂蛋白和脂質(zhì)組成，是血漿中密度最高但組成極不均一的一類脂蛋白。HDL中的蛋白質(zhì)主要由apoA-1和apoA-1I構(gòu)成，另還含有少量的apoA-1V、C1、CI1、CIII及E，其中apoA-1的含量最多而且又是HDL的主要功能蛋白質(zhì)，因此用apoA_I的含量就可以反映HDL的含量，間接診斷AS的發(fā)病與否。apoA-1還具有抗炎抗內(nèi)毒素的功能，因此是脂類代謝研究的重點(diǎn)之一。由于apoA-1具有肝臟靶向作用的特點(diǎn)，在靶向藥物研究中也有良好的應(yīng)用前景。
[0004]目前，獲得HDL的常用方法為超速離心法、聚合物及鹽離子序列沉淀法等，但這些方法具有一些不可避免的缺點(diǎn):1)處理方法繁瑣，因HDL是血漿中密度最高但組成極不均一的一類脂蛋白，成分和條件復(fù)雜，無法僅靠沉淀法就能將HDL與其他成分完全分開，尤其是在血漿中含量最為豐富的白蛋白，而一旦在提取HDL階段引入白蛋白，很難在后續(xù)色譜純化中將其剔除；2)沉淀法整個(gè)處理過程需要將HDL組分經(jīng)歷多次液相/固相轉(zhuǎn)換過程，處理期間溫度變化頻繁易導(dǎo)致HDL中所含蛋白氧化、變性，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白活性損失，無法后續(xù)利用。雖然超速離心法需要昂貴的儀器設(shè)備，但要獲得高純度、高活性的HDL及其蛋白組分，超速離心法仍然是目前提取的最佳`選擇。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于克服上述不足之處，研究設(shè)計(jì)一種超速離心法獲取高純度HDL的方法，尤其適用于對(duì)HDL及apoA-1的純度要求非常高的原料的獲取。
[0006]本發(fā)明提供了一種從正常人血漿中提取高密度脂蛋白(HDL)及分離純化高純度載脂蛋白apoA-1的方法。
[0007]該方法包括下列步驟:
[0008]I)血漿組分用中性鹽調(diào)節(jié)密度至L05-L 15g/ml，30000-80000rpm超速離心10-30h,收集下層深黃色組分I ;
[0009]2)組分I用中性鹽調(diào)節(jié)密度至1.15-1.35g/ml, 30000-80000rpm超速離心10_30h，
收集上層淺黃色組分II ；
[0010]3)配置密度為1.15-1.35g/ml中性鹽水溶液，組分II和中性鹽水溶液按體積比1:3-5 (V/V)混合，并調(diào)節(jié)混合溶液密度至1.15-1.35g/ml，30000-80000rpm超速離心5_30h，收集上層淺黃色組分III ;[0011]4)重復(fù)步驟3) 1-3次，收集獲取上層淺黃色組分，即為除去雜蛋白的高純度HDL ；
[0012]5)采用改進(jìn)Scanu (1971)法對(duì)HDL進(jìn)行低溫醇醚脫脂，得apoHDL沉淀；
[0013]6)復(fù)溶apoHDL沉淀并過濾；
[0014]7)步驟6)的濾液利用GE AKTA?快速蛋白層析儀purifierlOO系統(tǒng)，先后經(jīng)分子篩層析及陰離子交換層析，純化獲得高純度的apoA-1溶液。
[0015]所述步驟I)中血漿為健康人群捐獻(xiàn)的正常人血漿；
[0016]所述步驟1)、2)、3)中調(diào)節(jié)密度所使用的中性鹽優(yōu)選而不局限于KBr、NaBr、NaCl、KCl，最優(yōu)選NaBr。
[0017]所述步驟1)、2)、3)中超速離心的轉(zhuǎn)速為30000-80000rpm，優(yōu)選而不局限于50000rpmo
[0018]所述步驟1)、2)、3)中超速離心的離心時(shí)間為5_30h，優(yōu)選而不局限于24h。
[0019]所述步驟4)中使用生理鹽水配置的密度為1.15-1.35g/ml，優(yōu)選1.21g/mlNaBr密度液稀釋HDL粗提組分，30000-80000rpm,優(yōu)選而不局限于50000rpm，離心10-24小時(shí)，優(yōu)選而不局限于24h，收集上層淺黃色組分；重復(fù)次數(shù)為1-3次，優(yōu)選而不局限于2次。
[0020]所述步驟5)中脫脂方法為改進(jìn)Scanu (1971)法，使用的無水乙醇/無水乙醚的體積比為1-5:1，優(yōu) 選而不局限于3:2。
[0021]所述步驟6)中復(fù)溶apoHDL的復(fù)溶液為25mM Tris-HCl (三羥甲基氨基甲烷-鹽酸鹽)緩沖液，內(nèi)含尿素濃度為3-8M，優(yōu)選而不局限于6M，復(fù)溶液的pH為7.0-9.0，優(yōu)選而不局限于8.0。
[0022]所述步驟6)復(fù)溶后溶液采用0.2-0.5 μ m濾膜過濾，優(yōu)選而不局限于0.22 μ m。
[0023]所述步驟7)中使用的分子篩層析柱為Superdex G75分子篩層析柱，使用的離子交換柱為DEAE陰離子交換層析柱。
[0024]所述步驟7)中分子篩層析的步驟為:用如上所述的步驟6)的蛋白復(fù)溶液為分子篩層析液，層析液中添加離子強(qiáng)度為50-350mM的NaCl，優(yōu)選而不局限于150mM的NaCl，以降低凝膠的非特異性吸附；洗脫流速為0.5-2ml/min，優(yōu)選而不局限于lml/min ;上樣體積為層析柱柱床體積的1-5%,優(yōu)選而不局限于3% ；
[0025]所述步驟7中DEAE陰離子交換層析的步驟為:已經(jīng)分子篩層析初步純化的apoA-1層析液調(diào)整為ρΗ7.0-9.0，優(yōu)選而不局限于8.0, Tris-HCl (三羥甲基氨基甲烷-鹽酸鹽)緩沖液濃度為10-30mM,優(yōu)選而不局限于25mM (內(nèi)含尿素濃度為3-8M,優(yōu)選而不局限于6M)后上DEAE陰離子交換柱，然后采用0-1M的NaCl線性洗脫，獲得高純度的apoA_I溶液。
[0026]本發(fā)明方法通過調(diào)節(jié)不同的浮選密度搭配，利用序列超速離心法，很好的將血漿中豐度非常高并與HDL物理性質(zhì)相近的白蛋白雜質(zhì)與HDL分開，解決了以往傳統(tǒng)HDL提取方法中仍含有少量白蛋白的難點(diǎn)，尤其適用于對(duì)HDL及apoA-1的純度要求非常高的原料的獲取。本方法制備的apoA-1具有非常高的純度和活性，純度可達(dá)98%以上，被倍比稀釋64倍后仍能與抗血清發(fā)生清晰沉淀反應(yīng)，且操作安全方便，提取周期短，適于工業(yè)化生產(chǎn)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0027]圖1Superdex G75分子篩層析圖譜；[0028]圖2Superdex G75分子篩層析分組分收集后SDS-PAGE圖譜:
[0029]Marker:自上而下 97.4KD、66.2KD、43KD、31KD、20.1KD、14.4KD ；
[0030]條帶1:HDL ;條帶2:G75峰I ;條帶3:G75峰1、峰2交叉組分；條帶4:G75峰3 ；
[0031]圖3DEAE陰離子交換層析圖譜；
[0032]圖4DEAE陰離子交換層析后SDS-PAGE圖譜:
[0033]Marker:自上而下 97.4KD、66.2KD、43KD、31KD、20.1KD、14.4KD ；
[0034]從左至右條帶2為純化后apoA-1 ；
[0035]圖5BCA法測(cè)總蛋白含量擬合直線圖譜:
[0036]X軸:標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度(微克/毫升)'Y軸:標(biāo)準(zhǔn)蛋白A570吸光度值；
[0037]擬合公式:y=0.0Ollx+0.1402 ;線性相關(guān)系數(shù):R2=0.9965。
【具體實(shí)施方式】
[0038]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。`
[0039]以下原料通過市售得到。
[0040]實(shí)施例1:超速離心法提取HDL
[0041]正常人血漿500ml用溴化鈉(分析純)調(diào)密度(Dl)到1.09g/ml,日立離心機(jī)超速離心50000rpm，8°C，24hr ;棄去離心管頂部黃色組分，收集管底深黃色組分I，用溴化鈉調(diào)密度(D2)到1.21g/ml，相同條件下離心24hr，收集離心管上層三分之一的淺黃色組分II約120ml，再用2倍體積的密度為1.21的溴化鈉溶液稀釋混勻，日立離心機(jī)超速離心50000rpm, 8°C，24hr,相同條件下重復(fù)一次,得到頂層淺黃色組分為純HDL約20ml。
[0042]實(shí)施例2:改進(jìn)Scanu法脫脂
[0043]將實(shí)施例1離心獲得的HDL溶液20ml超濾濃縮到較高濃度，低溫(_21°C )條件下逐滴滴加到700ml的-21 °C預(yù)冷的無水乙醇/無水乙醚(V/V)3:2中，-21V條件下攪拌6hr，靜置過夜，_4°C條件下5000rpm離心lOmin，去上清，留沉淀，將沉淀復(fù)溶于無水乙醇/無水乙(V/V) 3:2，重復(fù)以上步驟一次，后將沉淀復(fù)溶于預(yù)冷的50ml無水乙醚中，離心去除上清，將沉淀在通風(fēng)處揮干，_21°C保存即為脫脂后apoHDL。
[0044]實(shí)施例3:apoHDL的分子篩層析純化
[0045]將實(shí)施例2脫脂后apoHDL約500mg復(fù)溶在IOml 25mM Tris-HCl緩沖液(內(nèi)含0.1%EDTA、0.1% NaN3、150mM NaCl、6M 尿素)，pH 8.0，使 apoHDL 終濃度達(dá) 50mg/3ml，0.22 μ m 過濾后上樣:采用GE AKTA?快速蛋白層析儀purifierlOO系統(tǒng),Superdex G75分子篩層析預(yù)裝柱，洗脫流速為lml/min，分吸收峰收集，層析圖譜及電泳圖譜見圖1、2。
[0046]實(shí)施例4:apoA-1的陰離子交換層析精細(xì)純化
[0047]將實(shí)施例3收集分子篩層析所得的峰組分約40ml，用25mM Tris-HCl緩沖液(內(nèi)含0.1% EDTA、0.1% NaN3、、6M尿素)，pH 8.0透析，不斷更換透析液以降低離子強(qiáng)度，然后過DEAE陰離子交換柱:采用25-1000mM NaCl線性洗脫，洗脫體積為10個(gè)柱床體積，收集apoA-1組分，層析圖譜及電泳圖譜見圖3、4。[0048]實(shí)例5:純化apoA-1純度的鑒定
[0049]將實(shí)施例4純化后組分的總蛋白含量用BCA法蛋白濃度定量試劑盒
(ThermoFisher公司pierce? BCA Protein Assay Kit)檢測(cè)；BCA法是世界上常用的蛋白濃
度監(jiān)測(cè)方法之一，參考文獻(xiàn):Smith, P.K.etal.Anal.Biochem.，150，76-85 (1985).[0050]擬合曲線(見圖5)后代入公式y(tǒng)=0.0011x+0.1402測(cè)得純化后組分總蛋白濃度為
0.849*2=1.699mg/ml;
[0051]組分中apoA-1的濃度用市售上海復(fù)星長征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司生產(chǎn)的人載脂蛋白
A/B定量檢測(cè)試劑盒，在全自動(dòng)生化檢測(cè)分析儀(日立AU400)上檢測(cè)，在全自動(dòng)生化檢測(cè)分
析儀上檢測(cè)，檢測(cè)到PA含量為1.67mg/ml;
[0052]apoA-1 純度為(1.67/1.699) *100%=98.3%。
[0053]。
[0054]表1BCA法測(cè)總蛋白含量標(biāo)準(zhǔn)蛋白與待測(cè)蛋白的A5700D值
[0055]
【權(quán)利要求】
1.一種從正常人血漿中提取高密度脂蛋白及分離純化高純度載脂蛋白apoA-1的方法，其特征在于，該方法包括下列步驟: 1)血漿組分用中性鹽調(diào)節(jié)密度至1.05-1.15g/ml, 30000-80000rpm超速離心10_30h，收集下層深黃色組分I ; 2)組分I用中性鹽調(diào)節(jié)密度至1.15-1.35g/ml, 30000-80000rpm超速離心10_30h，收集上層淺黃色組分II ； 3)配置密度為1.15-1.35g/ml中性鹽水溶液，組分II和中性鹽水溶液按體積比1:3-5混合，并調(diào)節(jié)混合溶液密度至1.15-1.35g/ml,30000-80000rpm超速離心5_30h，收集上層淺黃色組分III ; 4)重復(fù)步驟3)1-3次，收集獲取上層淺黃色組分，即為除去雜蛋白的高純度HDL ； 5)采用改進(jìn)Scanul971法對(duì)HDL進(jìn)行低溫醇醚脫脂，得apoHDL沉淀； 6)復(fù)溶apoHDL沉淀并過濾； 7)步驟6)的濾液利用GEAKTA?快速蛋白層析儀purifierlOO系統(tǒng)，先后經(jīng)分子篩層析及陰離子交換層析，純化獲得高純度的apoA-1溶液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟1)、2)或3)中調(diào)節(jié)密度所使用的中性鹽選自KBr、NaBr、NaCl、KCl ;優(yōu)選為NaBr。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟1)、2)或3)中超速離心的轉(zhuǎn)速為 30000-80000rpm，優(yōu)選為 50000rpm。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟1)、2)或3)中超速離心的離心時(shí)間為5-30h，優(yōu)選為24h。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟4)中使用生理鹽水配置的密度為1.15-1.35g/ml，優(yōu)選為1.21g/ml NaBr密度液稀釋HDL粗提組分；離心10-24小時(shí)，優(yōu)選24h，轉(zhuǎn)速30000-80000rpm，優(yōu)選50000rpm，收集上層淺黃色組分；重復(fù)次數(shù)為1-3次，優(yōu)選為2次。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟5)中脫脂方法為改進(jìn)Scanul971法，使用的無水乙醇/無水乙醚的體積比為1-5:1，優(yōu)選3:2。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟6)中復(fù)溶apoHDL的復(fù)溶液為25mM Tris-HCl緩沖液，內(nèi)含尿素濃度為3-8M，優(yōu)選6M，復(fù)溶液的pH為7.0-9.0，優(yōu)選8.0。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟6)復(fù)溶后溶液采用0.2-0.5 μ m濾膜過濾，優(yōu)選0.22 μ mo
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟7)中使用的分子篩層析柱為Superdex G75分子篩層析柱,使用的離子交換柱為DEAE陰離子交換層析柱。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟7)中分子篩層析的步驟為:用如上所述的步驟6)的濾液蛋白復(fù)溶液為分子篩層析液，層析液中添加離子強(qiáng)度為50-350mM 的 NaCl，優(yōu)選 150mM 的 NaCl，；洗脫流速為 0.5-2ml/min,優(yōu)選 lml/min ;上樣體積為層析柱柱床體積的1_5%，優(yōu)選3% ;已經(jīng)分子篩層析初步純化的apoA-1層析液調(diào)整為PH7.0-9.0，優(yōu)選而不局限于8.0, Tris-HCl緩沖液濃度為10_30mM，優(yōu)選25mM，內(nèi)含尿素濃度為3-8M，優(yōu)選6M后，上DEAE陰離子交換柱，然后采用0-1M的NaCl線性洗脫，獲得高純度的apoA-1溶液。
【文檔編號(hào)】C07K14/775GK103833840SQ201210492192
【公開日】2014年6月4日 申請(qǐng)日期:2012年11月27日 優(yōu)先權(quán)日:2012年11月27日
【發(fā)明者】張海濤, 張躍建, 孫衛(wèi)兵 申請(qǐng)人:上海復(fù)星醫(yī)藥（集團(tuán)）股份有限公司, 上海復(fù)星長征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司