專利名稱：一種合成多肽及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明 涉及生物領(lǐng)域，具體涉及一種合成多肽及其制備方法和用途。
背景技術(shù)：
生物酶制劑自從被發(fā)現(xiàn)和利用以來，為人類做出了巨大的貢獻(xiàn)，蛋白酶被世界生物酶界公認(rèn)為是使用最廣、技術(shù)較復(fù)雜的酶種，以堿性蛋白酶為代表的洗滌劑用酶一直占據(jù)酶制劑市場三分之一的份額，隨著蛋白類相關(guān)產(chǎn)品在人類日常生活中的重要性逐漸加強(qiáng)，蛋白酶在其他領(lǐng)域的應(yīng)用被充分認(rèn)識，應(yīng)用領(lǐng)域不斷擴(kuò)大。目前，在世界范圍內(nèi)蛋白分解酶是工業(yè)酶種中應(yīng)用得最多的一種酶，約占酶總量的60%。這類酶可廣泛應(yīng)用于制革、絲綢、醫(yī)藥、食品和生物化學(xué)試劑等領(lǐng)域，在改善人民生活質(zhì)量、降低勞動(dòng)強(qiáng)度、節(jié)約原料和能源、保護(hù)環(huán)境等方面發(fā)揮著重要作用，并產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。在高技術(shù)日新月異的今天，蛋白酶在日用化工、食品、環(huán)保、醫(yī)藥及一些新興產(chǎn)業(yè)中更是具有巨大的市場潛力，發(fā)展前景極其廣闊，大力開蛋白酶的應(yīng)用基礎(chǔ)研究及生產(chǎn)研究勢在必行。但由于自然界蛋白質(zhì)底物的多樣性，造成蛋白酶品種眾多，根據(jù)菌種來源不同可分為細(xì)菌蛋白酶、真菌蛋白酶等；根據(jù)提取來源不同可分為木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、姜蛋白酶等；根據(jù)反應(yīng)條件不同可分為中性、堿性、酸性蛋白酶、低溫蛋白酶等；根據(jù)反應(yīng)性能可分為角蛋白酶、肽酶等，蛋白酶的多樣性造成酶的應(yīng)用不同于淀粉酶類產(chǎn)品，相關(guān)應(yīng)用技術(shù)更加復(fù)雜。國內(nèi)酶制劑行業(yè)經(jīng)過40年的發(fā)展，經(jīng)歷了創(chuàng)建、繁榮的過程，同時(shí)也隨著國際先進(jìn)的酶制劑公司諾維信和杰能科的進(jìn)入而于上世紀(jì)90年代開始走向衰退。酶制劑行業(yè)是高技術(shù)和高壟斷的行業(yè)，國際上最大的酶制劑公司包括諾維信、杰能科兩家公司，目前占有國際市場的60%以上，在我國的占有率達(dá)到70%。導(dǎo)致這種局面的發(fā)生，部分原因是由于我國缺乏權(quán)威的檢驗(yàn)評價(jià)方法。當(dāng)國外產(chǎn)品進(jìn)入國內(nèi)市場時(shí)，國內(nèi)外蛋白酶的分析檢測標(biāo)準(zhǔn)混亂不統(tǒng)一，嚴(yán)重限制了蛋白酶產(chǎn)品的推廣應(yīng)用，產(chǎn)品檢測體系嚴(yán)重滯后導(dǎo)致魚龍混雜，難于評價(jià)產(chǎn)品優(yōu)劣，催化功能相同的酶活力監(jiān)測和表達(dá)方式不同，分類不明確。同時(shí)，我國及行業(yè)對于蛋白酶制劑標(biāo)準(zhǔn)又極不健全，整個(gè)行業(yè)缺乏必要的技術(shù)規(guī)范指導(dǎo)，嚴(yán)重影響產(chǎn)業(yè)提升，評價(jià)體系嚴(yán)重滯后導(dǎo)致魚龍混雜，難于評價(jià)產(chǎn)品優(yōu)劣。隨著食品安全的日趨嚴(yán)格，作為添加劑的蛋白酶制劑產(chǎn)品，目前只有GB/T23527-2009《蛋白酶制劑》一個(gè)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，不足以評價(jià)所有蛋白酶產(chǎn)品。因此，開發(fā)各種蛋白酶的標(biāo)準(zhǔn)底物及檢測方法，為建立健全各蛋白酶制劑的國家標(biāo)準(zhǔn)或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)奠定基礎(chǔ)，既有利于規(guī)范蛋白酶制劑生產(chǎn)企業(yè)的生產(chǎn)管理，也將有利于提高蛋白酶制劑生產(chǎn)企業(yè)的生產(chǎn)技術(shù)水平，推動(dòng)行業(yè)進(jìn)步，為各生產(chǎn)企業(yè)、應(yīng)用企業(yè)服務(wù)。當(dāng)建成統(tǒng)一的國家標(biāo)準(zhǔn)或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)后，有利于各行業(yè)間的交流和蛋白酶制劑產(chǎn)品的市場開發(fā)應(yīng)用。同時(shí)，可有效地規(guī)避競爭，提高競爭門檻，淘汰不符合標(biāo)準(zhǔn)的企業(yè)，提升整個(gè)行業(yè)的信譽(yù)。我國的酶制劑產(chǎn)品活力的測定，大都采用絕對法，在規(guī)定的條件下(反應(yīng)溫度、時(shí)CN 102924568 A書明說2/4頁間、PpH)，以酶對底物水解的消耗速率或產(chǎn)物的生成速率進(jìn)行定量，求得酶活力。因此，底物的質(zhì)量就變的非常重要了。同一名稱的底物因不同產(chǎn)地、不同型號測定出的結(jié)果，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)較大差異。
通常，測定一種酶制劑的產(chǎn)品酶活力的檢測方法，對底物的選擇是經(jīng)過反復(fù)試驗(yàn)后才確定的。當(dāng)前用于飼料的植酸酶、木聚糖酶、芽孢桿菌蛋白酶等酶制劑的酶活力底物均采用S i gma公司產(chǎn)品，雖然產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，但是價(jià)格也是相當(dāng)高。以 N-Succiny1-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA, N-Succinyl-L-alanyl-L_alanyl-L-prolyl-L-phenyl alanine4-nitroanilide等底物為例，250mg的售價(jià)在均在500以上。
為了改善國內(nèi)酶制劑行業(yè)檢測標(biāo)準(zhǔn)混亂的狀況，我們進(jìn)行了大量的技術(shù)方案的設(shè)計(jì)和研究，設(shè)計(jì)一種新型的酶制劑檢測底物，用于快速高效檢測蛋白酶制劑的酶活性。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種全新的蛋白酶檢測底物，旨在提供一種高效快速檢測蛋白酶制劑酶活性的方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種制備多肽的方法，為多肽的全合成提供一種簡單可行，費(fèi)用低廉的方法。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供一種全新的蛋白酶檢測底物，該底物為全合成多肽產(chǎn)品，序列如下N-琥珀酰-L- 丙氨酸-L-丙氨酸-L-脯氨酸-L-苯丙氨酸-對硝基苯胺。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供一種用于合成該專利目標(biāo)多肽的全合成方法采用標(biāo)準(zhǔn)Fmoc方案，選用2-HCl-Trt樹脂進(jìn)行微波固相合成。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，采用目標(biāo)多肽進(jìn)行蛋白酶制劑的檢測，具有高效和快速的優(yōu)點(diǎn)， 進(jìn)一步，將蛋白酶制劑的酶活性標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行統(tǒng)一，便于進(jìn)行蛋白酶制劑的質(zhì)量控制和確定。另外，采用本專利所提及的多肽全合成方法，具有操作簡便，低毒高效，副產(chǎn)物少，純度高，后處理方便等優(yōu)點(diǎn)。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，但應(yīng)理解本發(fā)明的范圍非僅限于這些實(shí)施例的范圍。
實(shí)施例I
以自制微波固相合成反應(yīng)管進(jìn)行H2N-琥珀酰-L-丙氨酸-L-丙氨酸-L-脯氨酸-L-苯丙氨酸-OH的合成
樹脂上載
將取代度約O. 5mmol/g的2_Cl_Trt樹脂5g置固相反應(yīng)管中，以含5% DIPEA 的DCM溶液洗滌樹脂2次。將Fmoc-Phe-OH(5. 142g，5. 7mmol)溶于DCM(30ml)中，加入 DIPEA(2. 615ml，15mmol)，全部溶解后加入樹脂中，室溫?fù)u擺反應(yīng)2h，抽干后用DCM(30ml) 洗滌樹脂3次，加入DCM-MeOH-DIPEA(17 2 I)混合液反應(yīng)30min封閉未反應(yīng)的樹脂， 抽干后用DCM (30ml X 2)、DMF (30ml X 2)交替洗滌3次，最后用無水乙醚洗滌2次后抽干，紅外干燥后得樹脂9. 873g，用UV-Fmoc方法測得上載后的取代度為O. 62mmol/g，上載產(chǎn)率為 98. 4%。4
微波輔助脫除Fmoc保護(hù)基
將樹脂轉(zhuǎn)移至IOOml微波反應(yīng)管中，加入含20 %哌啶的DMF溶液30ml，氮?dú)夤呐荩?微波功率65W，溫度50°C，反應(yīng)時(shí)間3min。之后抽除反應(yīng)液，再加入含20%哌啶的DMF溶液 30ml以相同微波條件再反應(yīng)I次，抽除反應(yīng)液后以DCM(30ml X2)、DMF(30ml X2)交替洗滌 3次。
微波輔助氨基酸縮合反應(yīng)
Fmoc 保護(hù)氨基酸(IOmmol)、HATU (3. 147g, 10mmol)和 HOOBt (I. 391g, 10mmol)共同溶于DMF(30ml)中并加入DCM(5ml)，冰水浴冷卻至5°C，加入DIPEA(I. 743ml, IOmmol) 后混合均勻反應(yīng)lmin，將該反應(yīng)液加至脫除保護(hù)基后的樹脂中，通氮?dú)夤呐莼旌?，微波功?45W，時(shí)間5min，溫度50°C。之后抽干反應(yīng)液，以DCM(30ml X 2)、DMF (30ml X 2)交替洗滌3 次，取少量樹脂以Kaiser方法檢測縮合情況，確認(rèn)結(jié)果為陰性后脫除Fmoc保護(hù)基。
裂解樹脂制備H2N-琥珀酰-L-丙氨酸-L-丙氨酸-L-脯氨酸-L-苯丙氨酸-OH
將完成所有縮合循環(huán)后的樹脂以DCM (30ml X 2)、DMF (30ml X 2)交替洗滌2次后轉(zhuǎn)至IOOml茄形瓶中，以無水乙醚(30ml X 3)洗滌，以帶有PP濾頭的聚四氟乙烯(PTFE)管抽干后置于紅外燈下充分干燥。向樹脂中加入TFA-苯甲硫醚-苯甲醚(90 5 5) (70ml)， 氬氣保護(hù)下攪拌反應(yīng)2h。完畢后過濾，濾液緩慢滴至冰無水乙醚(2L)中，產(chǎn)生沉淀，離心(2500Xg)3min,棄去上清液,沉淀再用無水乙醚攪拌-離心-棄上清重復(fù)操作5次,合并沉淀，置真空干燥箱中于40°C避光干燥6h，得類白色固體(6. 264g，以樹脂計(jì)粗產(chǎn)率為 89. 7% )。
實(shí)施例2
蛋白酶制劑的檢測方法
I 試劑
I. I 緩沖溶液(5OmM)
IM儲(chǔ)存液
121. I克Tris (三羥甲基氨基甲烷)，157. 6克組氨酸鹽酸鹽，各溶解于IOOOml脫鹽水，混合后調(diào)pH至7. 5。
50mM 緩沖液
取50ml儲(chǔ)存液用脫鹽水定容至1000ml。
I. 2底物溶液
稱取O. 020g L-亮氨酸-對硝基苯胺(M = 251. 29g*mole_l)溶解于l_2ml乙醇中，添加40ml50mM pH7. 5的Tris緩沖液，調(diào)節(jié)pH至7. 5，然后用緩沖液定容至50ml。此時(shí)溶液的濃度是I. 6mM。使用前檢查pH值，若有必要使用IMNaOH或IM HCl進(jìn)行調(diào)節(jié)。
儲(chǔ)存于4度，有效期一周。
I. 3 酶液
使用50mMTris緩沖液對酶進(jìn)行稀釋。該方法的有效工作范圍是速度在O.03-0. 090D*min_lo
注意在檢測開始前應(yīng)快速溶解和稀釋酶液，因?yàn)闀r(shí)間長了可能會(huì)導(dǎo)致相當(dāng)一部分活力喪失。
酶的稱量
將裝有底物的試管在水浴鍋中放置10分鐘以保溫，在此時(shí)間內(nèi)溶解和稀釋酶樣。
2 方法
2. I 樣品
在裝有3ml底物的比色杯中加入O. 225ml的酶液，30°C保溫。混勻后，記錄不少于 IOmin的405nm處的消光(每分鐘記錄一個(gè)值)。
消光值改變的首個(gè)分鐘不可以用于評價(jià)。
評價(jià)擴(kuò)展數(shù)據(jù)只能使用線性范圍。
3 評價(jià)
在標(biāo)準(zhǔn)曲線上確定摩爾消光系數(shù)。
權(quán)利要求
1.一種合成多肽產(chǎn)品，具有以下氨基酸序列特征H2N-琥珀酰-L-丙氨酸-L-丙氨酸-L-脯氨酸-L-苯丙氨酸-0H。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的多肽產(chǎn)品，是經(jīng)過以下步驟制備而來 (1)樹脂上載 將取代度約O. 5mmol/g的2_Cl_Trt樹脂5g置固相反應(yīng)管中，以含5 % DIPEA的DCM 溶液洗滌樹脂 2 次。將 Fmoc-Phe-OH(5. 142g, 5. 7mmol)溶于 DCM(30ml)中，加入DIPEA(2. 615ml，15mmol)，全部溶解后加入樹脂中，室溫?fù)u擺反應(yīng)2h，抽干后用DCM(30ml)洗滌樹脂3次，加入DCM-MeOH-DIPEA(17 2 I)混合液反應(yīng)30min封閉未反應(yīng)的樹脂，抽干后用DCM (30ml X 2)、DMF (30ml X 2)交替洗滌3次，最后用無水乙醚洗滌2次后抽干，紅外干燥后得樹脂9. 873g，用UV-Fmoc方法測得上載后的取代度為O. 62mmol/g,上載產(chǎn)率為.98. 4%。
(2)微波輔助脫除Fmoc保護(hù)基 將樹脂轉(zhuǎn)移至IOOml微波反應(yīng)管中，加入含20%哌啶的DMF溶液30ml，氮?dú)夤呐?，微波功?5W，溫度50°C，反應(yīng)時(shí)間3min。之后抽除反應(yīng)液，再加入含20%哌啶的DMF溶液30ml以相同微波條件再反應(yīng)I次，抽除反應(yīng)液后以DCM (30ml X 2) ,DMF (30ml X 2)交替洗滌3次。
(3)微波輔助氨基酸縮合反應(yīng)Fmoc 保護(hù)氛基酸(IOmmol) > HATU (3. 147g, 10mmol)和 HOOBt (I. 391g, 10mmol)共同溶于DMF(30ml)中并加入DCM(5ml)，冰水浴冷卻至5°C，加入DIPEA(I. 743ml, IOmmol)后混合均勻反應(yīng)lmin，將該反應(yīng)液加至脫除保護(hù)基后的樹脂中，通氮?dú)夤呐莼旌?，微波功?5W，時(shí)間5min，溫度50°C。之后抽干反應(yīng)液，以DCM(30ml X2)、DMF(30ml X2)交替洗滌3次，取少量樹脂以Kaiser方法檢測縮合情況，確認(rèn)結(jié)果為陰性后脫除Fmoc保護(hù)基。
(4)裂解樹脂制備H2N-琥珀酰-L-丙氨酸-L-丙氨酸-L-脯氨酸-L-苯丙氨酸-OH將完成所有縮合循環(huán)后的樹脂以DCM (30ml X 2) ,DMF (30ml X 2)交替洗滌2次后轉(zhuǎn)至IOOml茄形瓶中，以無水乙醚(30mlX3)洗滌，以帶有PP濾頭的聚四氟乙烯(PTFE)管抽干后置于紅外燈下充分干燥。向樹脂中加入TFA-苯甲硫醚-苯甲醚(90 5 5) (70ml)，氬氣保護(hù)下攪拌反應(yīng)2h。完畢后過濾，濾液緩慢滴至冰無水乙醚(2L)中，產(chǎn)生沉淀，離心(2500Xg)3min，棄去上清液，沉淀再用無水乙醚攪拌-離心-棄上清重復(fù)操作5次，合并沉淀，置真空干燥箱中于40°C避光干燥6h，得類白色固體(6. 264g，以樹脂計(jì)粗產(chǎn)率為89. 7% )。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種合成多肽及其制備方法和用途，該合成多肽產(chǎn)品具有以下氨基酸序列特征H2N-琥珀酰-L-丙氨酸-L-丙氨酸-L-脯氨酸-L-苯丙氨酸-OH，使用該多肽產(chǎn)品連接對硝基苯胺形成的終產(chǎn)品可以用于蛋白酶制劑酶活性的快速檢測。
文檔編號C07K5/103GK102924568SQ20121046960
公開日2013年2月13日 申請日期2012年11月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月20日
發(fā)明者王盛楠, 劉逸寒, 柏桐 申請人:天津銘恒科技發(fā)展有限公司