一種生枝霉素的工業(yè)高效液相色譜精制方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于天然產(chǎn)物提取領(lǐng)域，從枯草芽孢桿菌的發(fā)酵液中，酸沉后得到抗菌粗提物，通過HPLC優(yōu)化條件得到合適的流動相和柱分離條件，進(jìn)一步放大到工業(yè)制備級液相色譜分離系統(tǒng)，精制得到高純度的生枝霉素。本發(fā)明的優(yōu)點是，粗提物使用工業(yè)制備級液相色譜分離制備所需物質(zhì)，可達(dá)到較好的分離提純效果，所需溶劑成本低，操作簡單，周期短，效率高，純度可達(dá)99.5%以上。
【專利說明】一種生枝霉素的工業(yè)高效液相色譜精制方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于天然產(chǎn)物提取領(lǐng)域，具體涉及一種生枝霉素的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]枯草芽孢桿菌代謝產(chǎn)物中的活性物質(zhì)主要是抗菌肽和活性蛋白類物質(zhì)，其分離純化方法很多。呂樹娟等人采用陰離子交換柱DEAE-S印harose FF、疏水柱SOURCE 15 PHE、分子篩柱Sephacryl S-200HR和反相C18柱對subtil is JA-206粗提液多步分離純化后得到三種抗菌肽。易有金等人采用了硫酸銨沉淀、DEAE-S印harose FF柱層析、FPLCPhenyl FF疏水色譜柱、HPLC C18反相色譜柱的方法，從枯草芽孢桿菌B-001的代謝產(chǎn)物中分離得到一種抗菌蛋白，該純化的抑菌蛋白對青枯病菌有強(qiáng)烈的抑制作用。
[0003]生枝霉素是十六元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，對革蘭氏陽性菌，部分陰性菌及厭氧菌有良好的抗菌作用，對臨床耐紅霉素的金葡球菌僅有極少交叉耐藥性，其小鼠體內(nèi)活性優(yōu)于臨床上常用的紅霉素和乙酰螺旋霉素，從枯草芽孢桿菌的發(fā)酵液中，分離出高純度的生枝霉素，至今尚未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種采用工業(yè)制備級液相色譜分離系統(tǒng)制備高純度生枝霉素的方法，該方法包括以下步驟:
a.將枯草芽孢桿菌發(fā)酵液用HCl調(diào)節(jié)pH至2，靜止于4°C環(huán)境下，離心收集沉淀，加甲醇溶解得抗菌粗提物；
b.采用HPLC優(yōu)化生枝霉素的最佳分離洗脫條件，將其等比例放大，應(yīng)用在填充十八烷基反相硅膠填料的動態(tài)軸向壓縮柱上進(jìn)行分離，在線收集生枝霉素對應(yīng)譜帶的餾分；
c.將步驟b中收集的對應(yīng)譜帶洗脫液減壓干燥，即可得到色譜純?yōu)?9%的生枝霉素。
[0005]本發(fā)明的有益效果是直接采用枯草芽孢桿菌發(fā)酵液提取后的抗菌粗提物來制備生枝霉素，不需要大量的前處理過程，簡單、易控制，工藝技術(shù)簡化，適用于大規(guī)模制備。高效液相色譜測定中，總雜質(zhì)峰小于0.5%，純度大于99.5%，完全可用于食品和藥物的開發(fā)。
【具體實施方式】
[0006]實施例1
1.將枯草芽孢桿菌發(fā)酵液用HCl調(diào)節(jié)pH至2，靜止于4°C環(huán)境下12h，5000 rpm離心收集沉淀，加入5^10ml甲醇溶解得抗菌粗提物；
2.將抗菌粗提物溶液注入動態(tài)軸向壓縮柱制備色譜系統(tǒng)，動態(tài)軸向壓縮柱尺寸為Φ 50 X 250mm，十八烷基反相硅膠填料粒徑為10 μ m，上樣量5ml，流動相流速為80ml/min。分離初期，流動相乙腈與水體積比范圍為70/30-85/15，洗脫20min后，流動相乙腈與水的體積比切換為90/10，洗脫至30min，使后端雜質(zhì)沖洗出來，一個分離周期結(jié)束。采用的紫外光度檢測器的檢測波長為230nm ，收集保留時間在12~16.5min的餾分，經(jīng)HPLC分析純度≥ 99.5%。
[0007]實施例2
1.將枯草芽孢桿菌發(fā)酵液用HCl調(diào)節(jié)pH至2，靜止于4°C環(huán)境下24h，10000 rpm離心收集沉淀，加入5~10ml甲醇溶解得抗菌粗提物；
2.將抗菌粗提物溶液注入動態(tài)軸向壓縮柱制備色譜系統(tǒng)，動態(tài)軸向壓縮柱尺寸為Φ 50 X 250mm，十八烷基反相硅膠填料粒徑為10 μ m，上樣量8ml，流動相流速為80ml/min。分離初期，流動相乙腈與水體積比范圍為75/25~85/15，洗脫20min后，流動相乙腈與水的體積比切換為90/10，洗脫至30min，使后端雜質(zhì)沖洗出來，一個分離周期結(jié)束。采用的紫外光度檢測器的檢測波長為230nm，收集保留時間在l(Tl6min的餾分，經(jīng)HPLC分析純度≥99.5%。
[0008]實施例3
1.將枯草芽孢桿菌發(fā)酵液用HCl調(diào)節(jié)pH至2，靜止于4°C環(huán)境下24h，10000 rpm離心收集沉淀，加入5~10ml甲醇溶解得抗菌粗提物；
2.將抗菌粗提物溶液注入動態(tài)軸向壓縮柱制備色譜系統(tǒng)，動態(tài)軸向壓縮柱尺寸為Φ 50 X 250mm，十八烷基反相硅膠填料粒徑為10 μ m，上樣量10ml，流動相流速為80ml/min。分離初期，流動相甲醇與水體積比范圍為30/70-70/30，洗脫20min后，流動相乙腈與水的體積比切換為90/10，洗脫至30min，使后端雜質(zhì)沖洗出來，一個分離周期結(jié)束。采用的紫外光度檢測器的檢測波長為230nm，收集保留時間在12.5~20min的餾分，經(jīng)HPLC分析純度≥ 99.5%。
【權(quán)利要求】
1.一種生枝霉素的制備方法，其特征在于包括以下步驟: (1)將枯草芽孢桿菌發(fā)酵液用HCl調(diào)節(jié)pH至2，靜止于4°C環(huán)境下12~24h后，離心收集沉淀，加甲醇溶解得抗菌粗提物； (2)將抗菌粗提物通過進(jìn)樣泵或者進(jìn)樣閥注入動態(tài)軸向壓縮制備色譜系統(tǒng)； (3)采用乙腈和水做流動相，梯度洗脫，將色譜峰對應(yīng)的流出液進(jìn)行減壓干燥，即可得到高純度的生枝霉素。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是:所述步驟(2)中，在制備色譜系統(tǒng)中，采用動態(tài)軸向壓縮柱，規(guī)格為Φ50Χ250πιπmΦ150Χ250πιπι，且所填充固定相為十八烷基反相硅膠填料，粒徑為10 μ m~45 μ m。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是:所述步驟(3)中，梯度洗脫時，流動相乙腈與水的體積比(V/V)范圍 為7:3~9:1。
【文檔編號】C07H17/08GK103788158SQ201210426740
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2012年10月31日 優(yōu)先權(quán)日:2012年10月31日
【發(fā)明者】王亞輝, 李楠, 初新 申請人:江蘇漢邦科技有限公司