專(zhuān)利名稱(chēng)：表位肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)免疫學(xué)領(lǐng)域，特別涉及一種B細(xì)胞表位肽及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
糖尿病(diabetes mellitus, DM)定義:由多種病因引起的以慢性高血糖為特征的代謝紊亂，伴有因胰島素分泌和/或作用缺陷引起的糖、脂肪和蛋白質(zhì)代謝異常。該病在臨床上的主要病征為“三多一少”，即多飲、多食、多尿、體重減輕。2型糖尿病:以胰島素抵抗為主，伴胰島素分泌不足，至以胰島素分泌不足為主伴胰島素抵抗(WH01999標(biāo)準(zhǔn))。2型糖尿病的致死率的預(yù)測(cè)一直是一個(gè)難題。第47屆歐洲糖尿病研究學(xué)會(huì)年會(huì)(EASD2011)上報(bào)告的荷蘭一項(xiàng)針對(duì)2型糖尿病患者初級(jí)保健的前瞻性觀(guān)察研究表明，循環(huán)過(guò)氧化物氧化還原酶4(peroxiredoxin-4,Prx4)水平的增加與2型糖尿病患者的心血管和全因死亡率獨(dú)立相關(guān)。但是，目前臨床上還不存在一種基于Prx4的糖尿病檢測(cè)試劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種B細(xì)胞表位肽及其蛋白載體，其能過(guò)氧化物氧化還原酶4單克隆抗體的特異性抗原。實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案為:表位肽， 所述表位肽為含有的氨基酸序列為WETEERPRTREE的人工合成肽，即如SEQ ID NO: I所示。含有上述氨基酸序列的表位肽具體為:WETEERPRTREEE。優(yōu)選的，所述表位肽與BSA、0VA、肌紅蛋白、KLH和破傷風(fēng)類(lèi)毒素任一種蛋白載體連接，得含有所述表位肽的蛋白載體。本發(fā)明的目的之二在于提供一種雜交瘤細(xì)胞，其能特異性的分泌過(guò)氧化物還原酶4單克隆抗體。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為:所述所述表位肽制備的雜交瘤細(xì)胞。雜交瘤細(xì)胞的制備是通過(guò)所述B細(xì)胞表位肽段與BSA或KLH交聯(lián)后免疫Balb/c小鼠，取免疫后的小鼠小鼠脾細(xì)胞懸液并制備SP2/0細(xì)胞懸液(脾臟B淋巴細(xì)胞)，并與骨髓瘤細(xì)胞和融合，將融合細(xì)胞選擇性培養(yǎng)，通過(guò)ELISA篩選后得到的雜交瘤細(xì)胞。將篩選出的陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行克隆化培養(yǎng)，同時(shí)在克隆化培養(yǎng)的雜交瘤細(xì)胞中篩選出陽(yáng)性化的雜交瘤細(xì)胞送于并送中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢大學(xué)保藏中心)保藏，保藏號(hào)為CCTCC C2012148，其可穩(wěn)定分泌所述單克隆抗體。本發(fā)明的目的之三在于提供表位肽單克隆抗體及其應(yīng)用，該單克隆抗體可作為檢測(cè)過(guò)氧化物還原酶4的特異性診斷試劑，其應(yīng)用為類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的診斷及2型糖尿病的預(yù)測(cè)提供了新方法。實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案為:所述表位肽的特異性單克隆抗體。所述特異性單克隆抗體由生物保藏編號(hào)為CCTCC C2012148的雜交瘤細(xì)胞分泌。
所述的特異性單克隆抗體在制備診斷二型糖尿病或類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎診斷試劑中的應(yīng)用。所述的表位肽在制備診斷二型糖尿病診斷試劑中的應(yīng)用。有益效果I)抗Prx4單克隆抗體的制備:通過(guò)生物信息學(xué)分析，綜合考慮蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)、抗原性、親疏水性、可及性及柔韌性，預(yù)測(cè)HBV LHBs中preSl區(qū)段中的潛在B細(xì)胞表位，發(fā)現(xiàn)新的B細(xì)胞表位區(qū)域83aa_lIIaa (肽2)，人工合成上述兩種B細(xì)胞表位多肽，與BSA交聯(lián)后通過(guò)新型免疫程免疫Balb/c小鼠，通過(guò)雜交瘤技術(shù)經(jīng)多次細(xì)胞融合，利用間接ELISA法和克隆化篩選出能穩(wěn)定分泌抗Prx4單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株并檢測(cè)其細(xì)胞培養(yǎng)上清的效價(jià)。之后對(duì)雜交瘤細(xì)胞核型分析，明確染色體數(shù)目，證實(shí)雜交瘤確實(shí)是小鼠脾細(xì)胞和SP2/0融合而成，再進(jìn)行抗體亞類(lèi)鑒定和抗體的特異性實(shí)驗(yàn)，證實(shí)得到的抗體是特異性針對(duì)Prx4 的 ο2) Prx4重組蛋白的制備:從GENBANK中獲得人Prx4編碼序列，通過(guò)密碼子偏性改造，同義置換為大腸桿菌偏愛(ài)的密碼子獲得編碼序列，進(jìn)行Prx4全長(zhǎng)基因的合成制備；將Prx4基因與載體連接·,獲得Prx4重組質(zhì)粒；將Prx4重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌,誘導(dǎo)表達(dá)獲得Prx4重組蛋白；鑒定重組蛋白的可溶性后純化重組蛋白并進(jìn)行純度、濃度和活性鑒定，得到了高純度的Prx4重組蛋白，可以用于篩選抗Prx4雜交瘤細(xì)胞。3)制備抗Prx4特異性兔多克隆抗體:用從血清中分離純化得到的Prx4免疫新西蘭大白兔，經(jīng)過(guò)多次免疫，待兔血清中的抗Prx4抗體達(dá)到較高效價(jià)后放血，經(jīng)過(guò)抗原親和層析純化后得到了高效價(jià)、高親和力的特異性的多克隆抗體。更多有益效果，詳見(jiàn)具體實(shí)施方式
。本發(fā)明中雜交瘤細(xì)胞株雜交瘤細(xì)胞株P(guān)rx-4送中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢大學(xué)保藏中心)保藏，保藏編號(hào)為CCTCC C2012148，地址位于中國(guó)武漢武漢大學(xué)，保藏的培養(yǎng)物名稱(chēng)為小鼠雜交瘤細(xì)胞。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1多克隆抗體的制備一重組蛋白I編碼Prx4基因成熟肽cDNA的克隆和驗(yàn)證利用Trizol Reagent提取糖尿病患者血細(xì)胞的總R N A,并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。設(shè)計(jì)引物 Prx4F:5，_gctagcatgagcaacactgtccc a~3'和 Prx4R:5' -gaattcgaagtattctttgctgcc a~3'，以 cDNA 為模板進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，以獲得編碼該基因成熟肽的基因片段。PCR反應(yīng)程序:94°C變性4min，I個(gè)循環(huán)；94°C變性50s，55°C退火50秒，72°C延伸I分鐘，35個(gè)循環(huán)；72°C延伸10分鐘，I個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物在1.2%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，經(jīng)過(guò)凝膠成像系統(tǒng)觀(guān)察照相后切下特異目的條帶，用D N A凝膠回收試劑盒純化目的片段，連入P M D18-T載體，轉(zhuǎn)化ToplOF’感受態(tài)細(xì)胞，然后通過(guò)PCR篩選陽(yáng)性克隆并進(jìn)行測(cè)
序驗(yàn)證。2重組表達(dá)載體構(gòu)建
構(gòu)建重組表達(dá)載體:將構(gòu)建好的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌T0P10F’感受態(tài)細(xì)胞，涂布含有氨芐青霉素(lOOyg/mL)的L B平板，過(guò)夜培養(yǎng)，以基因特異性引物Prx4與載體引物 Reverse T7Promoter (5' -tagttattgctcagcggtg g-3')對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行篩選。挑選陽(yáng)性克隆，進(jìn)行測(cè)序。3重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主菌將經(jīng)過(guò)測(cè)序鑒定正確的陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)入含有氨芐青霉素(100 μ g/m L)的L B液體培養(yǎng)基中，200轉(zhuǎn)/分鐘，37°C培養(yǎng)過(guò)夜。利用EZ Spin Colunm Plasmid Min1-Pr印skit提取質(zhì)粒，取IOng質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌BL21(DE3)plys S感受態(tài)細(xì)胞。將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物接入IOmL的L B培養(yǎng)基中(含100 μ g/m I氨芐青霉素，34 μ g/m I氯霉素)，200轉(zhuǎn)/分鐘，37°C培養(yǎng)過(guò)夜。4重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)取0.5m L過(guò)夜培養(yǎng)的菌液接入5m L新鮮的L B培養(yǎng)基中(含100 μ g/m L氨芐青霉素，34 μ g/m L氯霉素)，200轉(zhuǎn)/分鐘，37°C培養(yǎng)2_3小時(shí)，待其OD45tl達(dá)到0.5-0.8小時(shí)，加入終濃度為0.lmmol/L的I P T G繼續(xù)培養(yǎng)6小時(shí)，每隔I小時(shí)取樣一次，每次取500 μ L。將收集到的培養(yǎng)液分別于4°C，12000轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心2分鐘，棄上清，然后將菌泥保存于-20°C，備用。5表達(dá)產(chǎn)物的初步分析在每個(gè)樣品中加500 μ L裂解液處理，在液氮與42°C水浴中反復(fù)凍融，離心后通過(guò)SDS-PAGE分析上清與 沉淀中的蛋白，同時(shí)對(duì)IPTG誘導(dǎo)不同時(shí)間目的蛋白的表達(dá)量進(jìn)行分析。6分離純化稱(chēng)量回收菌體的濕重，按每克菌體IOm L的比例加入Buffer (50mmol/L磷酸鈉，6mol/L鹽酸胍,300mmol/L氯化鈉)，將菌體與Buffer混勻,超聲波破碎至液體變清；然后，4°C, 12000轉(zhuǎn)/分鐘離心30分鐘，收集上清。利用固相金屬親和層析和Co-NTA技術(shù)，對(duì)超聲波破碎后的重組蛋白進(jìn)行分離純化，具體操作按照BD Talon TM Metal Afinity Resins操作手冊(cè)進(jìn)行。7 結(jié)果質(zhì)譜鑒定的結(jié)果證明宿主菌中被誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白就是重組的人Prx4蛋白，將菌體的培養(yǎng)體系擴(kuò)大到了 300mL，選取4小時(shí)為最佳的誘導(dǎo)時(shí)間，對(duì)擴(kuò)大培養(yǎng)的菌體進(jìn)行誘導(dǎo)。誘導(dǎo)結(jié)束后對(duì)菌體進(jìn)行離心回收。純化后目的蛋白純度達(dá)到95%以上。二多克隆抗體的制備以所得純化Prx4重組蛋白為抗原，采用背部皮下及四肢多點(diǎn)注射免疫新西蘭大白兔。免疫程序:基礎(chǔ)免疫前耳緣靜脈取血5mL分離血清作為陰性對(duì)照。每只用抗原500 μ g與等體積完全弗氏佐劑充分乳化后進(jìn)行注射，首次免疫后3天用等量抗原配以完全弗氏佐劑加強(qiáng)免疫，第28天用等量抗原配以不完全弗氏佐劑第3次免疫。第3次免疫后7天，耳緣靜脈取血5ml分離血清，用間接ELISA檢測(cè)抗血清的效價(jià)。效價(jià)達(dá)1: 64000時(shí)頸動(dòng)脈插管收集全血，4°C放置過(guò)夜，4000rpm離心收集血清，-70°C保存。效價(jià)達(dá)不到要求可再加強(qiáng)免疫I次。二特異性親和純化抗體
將待純化的血清用上樣緩沖液(0.1M磷酸鈉，0.1M檸檬酸三鈉，pH7.0)適當(dāng)稀釋后加入到ProteinA柱中，用洗脫緩沖液(0.1M磷酸鈉，0.1M檸檬酸鈉，pH3.0)洗脫柱子，收集單峰。收集的純化產(chǎn)物再經(jīng)抗原抗體特異性親和純化，得到純化的抗Prx4多克隆抗體。所述的抗原抗體特異性親和純化方法:Prx4抗原用buffer A (0.lmol/L碳酸氫鈉,0.5mol/L 氯化鈉，ρΗ8.0),按照 0.5:1 (buffer:sample)處理，將填料 NHS-activatedSepharose4FAST Flow裝柱，室溫下將PRX4重組蛋白偶聯(lián)在柱上，經(jīng)過(guò)純化過(guò)量的抗原決定簇及大量清洗柱體后，備用。反復(fù)上樣，保證特異性的抗Prx4抗體充分與柱結(jié)合,用100mol/L甘氨酸，pH2.5洗脫,特異性抗體蛋白直接被洗脫收集入lmol/L Tris,pH9.0，-20°C保存?zhèn)溆?。本?shí)施例1制備的多克隆抗體，應(yīng)用于和實(shí)施例2制備的單克隆抗體配對(duì)。實(shí)施例2單克隆抗體的制備一 B細(xì)胞表位肽段的預(yù)測(cè)所述的化學(xué)合成的B細(xì)胞表位肽段的序列來(lái)自生物信息學(xué)分析結(jié)果，綜合分析過(guò)氧化物還原酶4蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)、抗原性、親疏水性、可及性及柔韌性，對(duì)各區(qū)段進(jìn)行分析評(píng)分，選取得分高的區(qū)域作為B細(xì)胞表位區(qū)域。具體的,利用Chou & Fasman預(yù)測(cè)β轉(zhuǎn)角、Emini法預(yù)測(cè)抗原表面可及性、Karplus&Schulz法預(yù)測(cè)蛋白柔韌性、KoIaskar&Tongaonkar蛋白質(zhì)抗原性分析、Parker法蛋白質(zhì)疏水分析和Bepipred線(xiàn)性抗原表位預(yù)測(cè)等技術(shù)參數(shù)，獲得人過(guò)氧化物還原酶4蛋白中潛在的B細(xì)胞表位肽段。所述的篩選B細(xì)胞表位肽段，其中化學(xué)合成的表位肽段2段分別為:肽段1:N—WETEERPRTREE— C(后制得的單克隆抗體簡(jiǎn)稱(chēng)為單抗I)，肽段2:N—WETEERPRTREEE-C (后制得的單克隆抗體簡(jiǎn)稱(chēng)為單抗2)。在所述肽段I和肽段2化學(xué)合成中，在其N(xiāo)端引入半胱氨酸，以提高其與BSA的交聯(lián)能力，接著與BSA交聯(lián)。交聯(lián)率(>60% )，得過(guò)氧化物還原酶4的B細(xì)胞表位肽段抗原。另外，肽段I和肽段2也可選擇同KLH、0VA、肌紅蛋白、破傷風(fēng)類(lèi)毒素任一種蛋白載體連接進(jìn)行交聯(lián)。二單克隆抗體的制備與鑒定I過(guò)氧化物還原酶4的B細(xì)胞表位肽段衍生物免疫Balb/c小鼠將上述合成的肽段I和肽段2制備的過(guò)氧化物還原酶4的B細(xì)胞表位肽段抗原從_80°C冰箱取出，分別作抗原，溶解后過(guò)濾。選取6周齡、體重約20g的雌性Balb/c小鼠免疫。抗原乳化選用雙注射器互推法。首次免疫時(shí)，將肽段I和肽段2制備的過(guò)氧化物還原酶4的B細(xì)胞表位肽段抗原分別與等體積的弗氏完全佐劑乳化混合，分別得抗原混合物I和抗原混合物2，分別用于不同的小鼠:按100 μ g的量皮內(nèi)多點(diǎn)加腹腔注射,第14和第28天分別進(jìn)行第二次第三次免疫，佐劑改用不完全弗氏佐劑，抗原量、注射體積和途徑不變，第3次免疫后間接ELISA法測(cè)定效價(jià)。融合前3天進(jìn)行加強(qiáng)免疫，每只小鼠腹腔注射不加佐劑的100 yg抗原，3天后細(xì)胞融
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2被免疫Balb/c小鼠血清效價(jià)測(cè)定第3次免疫后10天從小鼠尾靜脈取血檢測(cè)血清抗體效價(jià)。將新購(gòu)酶標(biāo)板用雙蒸水浸泡過(guò)夜，晾干后備用；用包被液(0.05mol/L碳酸鈉緩沖液:0.16g Na2CO3,0.293g NaHCO3,0.02g NaN3，加去離子水溶解定容IOOml)將所得Prx4重組蛋白抗原稀釋為最佳工作濃度5 μ g/ml，每孔加100 μ I抗原稀釋液，37°C溫育I小時(shí)后，以膠帶封口，于4°C過(guò)夜，倒盡板孔中液體，吸干孔內(nèi)殘余反應(yīng)液，加滿(mǎn)洗滌液過(guò)一次，再注滿(mǎn)洗滌液緩緩晃動(dòng)2min，傾去，反復(fù)五次，最后將反應(yīng)板倒置在吸水紙上，使孔中洗滌液流盡。自然干燥后以膠帶封口，此為Prx4重組蛋白抗原包被的酶標(biāo)板，加封閉液300μ 1，37°C孵育1.5小時(shí)，洗滌5次；采血及稀釋血清:捏住鼠尾，體積分?jǐn)?shù)為75 %的酒精消毒后用剪刀在尾靜脈剪一缺口，取血20 μ L, 2000rpm離心30min,取上清I μ I加入999 μ I抗體稀釋液混勻，并進(jìn)行體積倍比稀釋?zhuān)瑥?: 100至1: 3200，將稀釋的被檢血清每孔加入100μ 1，同時(shí)取小鼠免疫前血清I: 100稀釋做陰性對(duì)照，抗體稀釋液做空白對(duì)照。37°C孵育1-1.5小時(shí)，洗滌5次；將辣根過(guò)氧化物酶羊抗小鼠IgG稀釋到1: 10000，每孔加100μ 1，37°C孵育1.5小時(shí)，洗滌5次；加鄰苯二胺溶液100 μ L/孔，室溫暗處15分鐘，每孔加終止液100 μ L觀(guān)察結(jié)果，OPD氧化后的產(chǎn)物呈橙紅色，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀記錄450nm讀數(shù)，以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔OD值大于陰性對(duì)照OD值的2.1倍，即為陽(yáng)性。血清效價(jià)達(dá)到1: 3200即可用于細(xì)胞融合。其中，由肽段I和肽段2制備的過(guò)氧化物還原酶4的B細(xì)胞表位肽段抗原(下面分別簡(jiǎn)稱(chēng)為B細(xì)胞表位肽段抗原1、B細(xì)胞表位肽段抗原2)的血清的效價(jià)均在1: 3200以上。3小鼠脾細(xì)胞懸液和SP2/0細(xì)胞懸液的制備分別取經(jīng)B細(xì)胞表位肽段抗原1、B細(xì)胞表位肽段抗原2經(jīng)取免疫好的Balb/c小鼠，摘除小鼠眼球放血處死，眼 血離心后收集血清作ELISA的陽(yáng)性對(duì)照，無(wú)菌操作取出脾臟，放入盛有IOml不完全培養(yǎng)基的玻璃皿中，洗滌，小心剝?nèi)ブ車(chē)慕Y(jié)締組織和脂肪組織，換一玻璃皿，將脾臟撈出，置于200目不銹鋼網(wǎng)中，用注射器的內(nèi)芯研磨，不時(shí)用不完全培養(yǎng)基沖洗，使脾細(xì)胞穿過(guò)網(wǎng)孔進(jìn)入溶液中，將脾細(xì)胞移至IOml玻璃離心管中，800rpm水平離心lOmin，去上清。同法用不完全培養(yǎng)基IOml洗滌細(xì)胞I次，離心收集沉淀的細(xì)胞，將細(xì)胞用IOml不完全培養(yǎng)基重懸混勻，細(xì)胞計(jì)數(shù)約為I X IO8個(gè)細(xì)胞。將SP2/0細(xì)胞從液氮中取出，迅速放入37°C水浴中，不斷搖晃，直至細(xì)胞溶液完全溶解，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到IOml離心管中，800rpm水平離心lOmin，棄上清，IOml完全培養(yǎng)液重懸沉淀，把細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到50ml培養(yǎng)瓶中，置37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)良好后用含8-AG的選擇培養(yǎng)基篩選細(xì)胞一周；融合前2天，將I瓶細(xì)胞傳至4瓶，則融合當(dāng)天細(xì)胞正處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，活力正好，細(xì)胞大小均勻，圓而透亮，融合當(dāng)天，用彎頭滴管將SP2/0細(xì)胞從管壁上輕輕吹下，收集于離心管中，離心，棄上清，沉淀用不完全培養(yǎng)基洗滌后，IOml不完全培養(yǎng)基重懸，細(xì)胞計(jì)數(shù)，約為6 X 107。4滋養(yǎng)細(xì)胞的制備取一只未免疫的Balb/c小鼠,摘眼球放血處死,75 %乙醇浸泡消毒5min,剪開(kāi)小鼠皮膚，用鑷子提起腹膜，用剪刀剪一小口，彎頭滴管吸取預(yù)冷的不完全培養(yǎng)基沖洗腹腔，將洗液吸至50ml離心管中。同法用不完全培養(yǎng)基沖洗腹腔3次，收集洗液，室溫下IOOOrpm水平離心lOmin，去上清，IOml不完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。5骨髓瘤細(xì)胞和脾臟B淋巴細(xì)胞融合融合前將PEG1500置于37 °C培養(yǎng)箱中預(yù)溫，吸取I X IO7個(gè)骨髓瘤細(xì)胞懸液和I X IO8個(gè)脾臟B淋巴細(xì)胞懸液(細(xì)胞數(shù)1: 10)至一個(gè)50ml離心管中，補(bǔ)加30ml不完全培養(yǎng)基，充分混勻，IOOOrpm離心lOmin，棄上清，輕彈管底，使細(xì)胞團(tuán)松散成糊狀，將離心管37°C水浴，用滴管吸取0.8ml預(yù)溫的50 % PEG1500溶液，在離管底約2cm處沿管壁慢慢加入細(xì)胞中，邊加邊轉(zhuǎn)動(dòng)離心管，在Imin左右加完，然后靜置90s，逐滴加入37°C預(yù)溫的不完全培養(yǎng)基30ml終止融合，3min之內(nèi)加完，速度先慢后快，動(dòng)作輕柔，將離心管在37°C培養(yǎng)箱中靜置5min，取出離心管，IOOOrpm離心5min，棄去上清，加入IOml HAT培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，輕輕吹打，混勻，將融合細(xì)胞接種至已鋪有滋養(yǎng)細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，按100 μ I/孔，每塊培養(yǎng)板留6孔接種SP2/0細(xì)胞，作為HAT選擇的陰性對(duì)照，置37°C ,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。6融合細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)及雜交瘤細(xì)胞的篩選融合后第5天即可在倒置顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，并補(bǔ)加HAT培養(yǎng)基100 μ 1，第14天換HT培養(yǎng)基培養(yǎng)。融合后10-14天，待細(xì)胞長(zhǎng)到滿(mǎn)培養(yǎng)孔的1/2孔底時(shí)，采用間接ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)上清，篩選陽(yáng)性克隆；以實(shí)施例1制備的純化后Prx4重組蛋白包被酶標(biāo)板(0.5 μ g/孔)，4°C過(guò)夜，洗滌緩沖液洗滌5次，每次5分鐘，拍干液體，每孔加入封閉液300μ 1，37°C孵育2h，加入100 μ I細(xì)胞培養(yǎng)上清，陽(yáng)性對(duì)照選小鼠的免疫血清，陰性對(duì)照選SP2/0培上清，空白對(duì)照用洗滌液，37°C孵育2h ;洗滌酶標(biāo)板:每孔加入100μ I ; I: 10000體積稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IG抗體，37°C孵育2h ;洗滌，拍干液體，加新鮮配制的鄰苯二胺溶液100 μ I/孔，室溫暗處反應(yīng)10-15分鐘，加終止液每孔100 μ I終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀檢測(cè)450nm吸光度值。結(jié)果為B細(xì)胞表位肽段抗原I和B細(xì)胞表位肽段抗原2，免疫BALB/C小鼠，融合成功后，經(jīng)克隆化和ELISA篩選后，分別得到分泌過(guò)氧化物還原酶4的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株(由表位肽I制備的簡(jiǎn)稱(chēng)雜交瘤細(xì)胞1，由表位肽2制備的簡(jiǎn)稱(chēng)雜交瘤細(xì)胞2)，它們細(xì)胞培養(yǎng)上清效價(jià)達(dá)到1: 6400。雜交瘤細(xì)胞I和雜交瘤細(xì)胞2經(jīng)數(shù)次凍存，體外傳代培養(yǎng)3個(gè)月以上仍能穩(wěn)定分泌抗體。7陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞的克隆化篩選出陽(yáng)性克隆后，立即采用有限稀釋法將陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行克隆化培養(yǎng)，制備飼養(yǎng)細(xì)胞，用IOml不完全培養(yǎng)基重懸，收集陽(yáng)性克隆細(xì)胞并計(jì)數(shù)，用不完全培養(yǎng)基將陽(yáng)性克隆細(xì)胞稀釋到100個(gè)/20ml，取一塊預(yù)先已加有滋養(yǎng)細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，加入200 μ I細(xì)胞懸液，將剩下的陽(yáng)性克隆細(xì)胞轉(zhuǎn)移到24孔板中擴(kuò)大培養(yǎng)，收集細(xì)胞液氮凍存，同時(shí)將培養(yǎng)板在37°C，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，第3天后顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，10天后用ELISA法(方法參照現(xiàn)代免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)沈關(guān)心周汝麟主編)，并將強(qiáng)的陽(yáng)性克隆再次克隆化，直至細(xì)胞陽(yáng)性率達(dá)100%，即可定株。其中，從所述雜交瘤細(xì)胞I篩選并在此克隆后定株的雜交瘤細(xì)胞株培養(yǎng)上清的效價(jià)后再將定株的雜交瘤細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，送往中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢大學(xué))保藏，所得保藏編號(hào)為CCTCC C2012148，其可穩(wěn)定分泌所述單克隆抗體。8小鼠腹水制備、抗體純化及效價(jià)測(cè)定選用健康雌性Balb/c小鼠2組，每組10只，腹腔注射0.5ml滅菌石蠟油/鼠，1-2周后每只小鼠腹腔注射I X IO6個(gè)雜交瘤細(xì)胞I或雜交瘤細(xì)胞2，同時(shí)注射0.25ml等量混合的液體石蠟與不完全弗氏佐劑的混合物。小鼠明顯產(chǎn)生腹水后拉頸處死，用吸管從腹腔取出腹水，4 離心15min,分離收集中段的澄清腹水液。選用HiTrap rProtein A HP柱接入AKTA Explorer純化抗體，經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)純度大于97%。純化的抗體用間接ELISA法檢測(cè)效價(jià)，雜交瘤細(xì)胞I組和雜交瘤細(xì)胞2組效價(jià)在達(dá)1: 10000以上，初步說(shuō)明獲得的單克隆抗體對(duì)Prx4有較高結(jié)合能力，分裝冷凍保存。
應(yīng)用商品化的Prx4蛋白作為抗原標(biāo)準(zhǔn)品，通過(guò)免疫印跡方法鑒定所制備單抗的有效性，結(jié)果顯示抗Prx4單抗結(jié)合Prx4蛋白處可見(jiàn)清洗條帶。本實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)步驟詳見(jiàn)《現(xiàn)代免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》(沈關(guān)心周汝麟主編)。9所述單克隆抗體的親和力測(cè)定為檢驗(yàn)抗過(guò)氧化物還原酶4的單克隆抗體(單抗I和單抗2)對(duì)過(guò)氧化物還原酶4的抗原的結(jié)合能力，運(yùn)用基于抗原/抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合原理的單抗親和力常數(shù)(Kd)檢測(cè)方法對(duì)所獲單抗進(jìn)行親和力測(cè)定。將實(shí)施例1制備的純化好的過(guò)氧化物還原酶4的重組抗原溶解在0.05mol/l的碳酸緩沖液(pH9.5)中，調(diào)整過(guò)氧化物還原酶4的終濃度為I μ g/ml,于ELISA板孔中每孔加100 μ 1，膠帶封閉條板4°C過(guò)夜。次日拍干孔中液體，以含1% BSA的PBS溶液對(duì)各孔封閉2h，洗板并干燥后4°C保存?zhèn)溆?。根?jù)測(cè)定原理及方法建立抗原抗體反應(yīng)系統(tǒng)，分別將單抗I和單抗2初始反應(yīng)濃度稀釋至40ng/ml,過(guò)氧化物還原酶4的抗原初始濃度稀釋至360mg/ml?？乖瓭舛缺侗认♂尠?0、15、7.5、3.75、1.875,0.938,0.469、
0.235 (單位為10_12mOl/l)進(jìn)行，計(jì)算單抗I和單抗2親和力常數(shù)。結(jié)果顯示其具有高親和力，單抗 I 和單抗 2 分別為 Kd = 5.3Xl(T8mol/L、Kd = 5.8 X l(T8mol/L。人Prx4的氨基酸序列為:MEALPLLAATTPDHGRHRRLLLLPLLLFLLPAGAVQGWETEERPRTREEECHFYAGGQVYPGEASRVSVADHSLHLSKAKISKPAPYWEGTAVIDGEFKELKLTDYRGKYLVFFFYPLDFTFVCPTEIIAFGDRLEEFRSINTEVVACSVDSQFTHLAWINTPRRQGGLGPIRIPLLSDLTHQISKDYGVYLEDSGHTLRGLFIIDDKGILRQITLNDLPVGRSVDETLRLVQAFQYTDKHGEVCPAGWKPGSETIIPDPAGKLKYFDKLN ；其中，氨基酸的中文、英文縮寫(xiě)，英文簡(jiǎn)寫(xiě)分別為:丙氨酸，Ala, A ;亮氨酸，Leu, L ;精氨酸，Arg, R ;賴(lài)氨酸，Lys, K ;天冬酰胺，Asn, N ；甲硫氨酸，Met, M ;天冬氨酸，Asp, D ;笨丙氨酸，Phe, F ;半胱氨酸，Cys, C ;脯氨酸，Pro, P ；谷氨酰胺，Gin, Q ;絲胺酸，Ser, S ;谷氨酸，Glu, E ;蘇氨酸，Thr, T ;甘氨酸，Gly, G ;色氨酸，Trp, W ;組氨酸，His, H ;酪氨酸，Tyr, Y ;異亮氨酸，He, I ;頡氨酸，Val, V。通過(guò)實(shí)施2可以得出:氨基酸序列“WETEERPRTREE”，位于人Prx4序列的38-49位，含有單位氨基酸序列WETEERPRTREE，如“N—WETEERPRTREEE—C”或“N—VQGWETEERPRTREE—C”，在包含“WETEERPRTREE”肽單位時(shí)，只要其設(shè)計(jì)符合B細(xì)胞表位肽設(shè)計(jì)的其它規(guī)則參見(jiàn)《梁謹(jǐn).B細(xì)胞構(gòu)想表位預(yù)測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用》，可以制備出具有特異性抗體的單克隆抗體，含有單位肽單位后，其它差別僅會(huì)在效價(jià)上存在差異。另外，肽段I和肽段2分別制備的單克隆抗體，具有特異性，其可用于作為檢測(cè)Prx4抗原含量的檢測(cè)試劑。實(shí)施例3用于檢測(cè)Prx4抗原的膠體金試紙的制備I納米金試紙的制備方法(I)硝酸纖維素膜和結(jié)合墊的預(yù)處理將濃度等于lmg/mL的實(shí)施例2制備所得的單抗體I (保藏編號(hào)為CCTCC C2012148的雜交瘤細(xì)胞分泌)用XYZ-3000三維噴點(diǎn)儀噴點(diǎn)于硝酸纖維素膜上形成檢測(cè)線(xiàn)，將濃度等于1.5mg/mL的實(shí)施例1制備的多克隆抗體用XYZ-3000三維噴點(diǎn)儀噴點(diǎn)于硝酸纖維素膜上形成質(zhì)控線(xiàn)，噴涂了抗體的硝酸纖維素膜在37°C封閉、洗滌并干燥lh，得復(fù)合硝酸纖維素膜；將玻璃纖維素膜浸于納米金標(biāo)記濃度大于或等于6 μ g/mL的所述單體I中，在37°C干燥4小室后得復(fù)合結(jié)合墊。(2)納米金免疫層析試紙的組裝分別將樣品墊、復(fù)合結(jié)合墊、復(fù)合硝酸纖維素膜和吸收墊依次粘在所述底板上，得用于檢測(cè)Prx4抗原的納米金試紙，所述復(fù)合硝酸纖維素膜上所述質(zhì)控線(xiàn)靠近吸收墊端，所述檢測(cè)線(xiàn)靠近結(jié)合墊端。用LN-5000切割機(jī)切割成0.4cm寬的試紙條，將其裝入塑料盒中，密封包裝，內(nèi)置干燥劑，4°C保存。

用上述同樣的方法制備含有單抗體2的納米金免疫層析試紙，除單抗2的濃度為2mg/mL,其余參數(shù)和制備工藝不變。3納米金試紙的原理和結(jié)果判定(I)納米金試紙的原理和測(cè)試方法將抗體(所述單抗)包被于檢測(cè)線(xiàn)，多克隆抗體包被于質(zhì)控線(xiàn)；玻璃纖維素膜浸于抗體中，得結(jié)合墊。使用時(shí)，將檢測(cè)試紙的樣品墊端放入待檢標(biāo)本中，標(biāo)本被樣品墊吸收并通過(guò)毛細(xì)作用向檢測(cè)試紙的吸收墊端層析，當(dāng)上移到結(jié)合墊時(shí)，如果標(biāo)本溶液中含有Prx4抗原，其可與納米金標(biāo)記的抗體發(fā)生特異性結(jié)合，形成抗原-抗體復(fù)合物，該復(fù)合物繼續(xù)上移，當(dāng)?shù)竭_(dá)檢測(cè)墊上的檢測(cè)線(xiàn)時(shí)，Prx4抗原的另一結(jié)合位點(diǎn)可與單抗發(fā)生特異性結(jié)合，形成“抗體-抗原-抗體”雙抗體夾心結(jié)構(gòu)，從而使納米金聚集在檢測(cè)線(xiàn)上，使檢測(cè)線(xiàn)顯紅色，多余的未與Prx4抗原結(jié)合的抗體則繼續(xù)上移，到達(dá)質(zhì)控線(xiàn)時(shí)，與多克隆抗體結(jié)合，形成抗原-抗體復(fù)合物，從而使納米金聚集在質(zhì)控線(xiàn)上，使質(zhì)控線(xiàn)顯紅色，因此，當(dāng)檢測(cè)試紙上的檢測(cè)線(xiàn)與質(zhì)控線(xiàn)均顯紅色時(shí)，判為陽(yáng)性結(jié)果；反之，如果標(biāo)本溶液中不含有Prx4抗原，則在檢測(cè)線(xiàn)處，不能形成“抗體-抗原-抗體”雙抗體夾心結(jié)構(gòu)，檢測(cè)線(xiàn)不顯紅色，而納米金標(biāo)記的抗Prx4的單克隆抗體上移到質(zhì)控線(xiàn)處，可形成抗原-抗體復(fù)合物，使質(zhì)控線(xiàn)顯紅色，因此，當(dāng)檢測(cè)試紙上的檢測(cè)線(xiàn)不顯紅色而質(zhì)控線(xiàn)顯紅色時(shí)，判為陰性結(jié)果；當(dāng)檢測(cè)試紙的質(zhì)控線(xiàn)不顯紅色時(shí)，不管檢測(cè)線(xiàn)是否顯紅色，結(jié)果都判為操作失誤或檢測(cè)試紙失效，需重新檢測(cè)。使用200位類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病人的血清和100位健康人的血清借助實(shí)施例3制備的2中膠體金試紙進(jìn)行檢測(cè)，其中，200位類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病人均為陽(yáng)性，即檢測(cè)試紙的檢測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn)均顯示紅色。其中，100位健康人血清標(biāo)本均為陰性，即檢測(cè)試紙上的檢測(cè)線(xiàn)不顯紅色而質(zhì)控線(xiàn)顯紅色時(shí)。從實(shí)施例3可以證實(shí)，所述單抗I和單抗2均可用于檢測(cè)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，為檢測(cè)類(lèi)方式關(guān)節(jié)炎的診斷試劑。表位肽I和表位肽2為類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的特異性抗原。實(shí)施例4所述單克隆抗體在制備預(yù)測(cè)二型糖尿病診斷試劑中的應(yīng)用一 ELISA實(shí)驗(yàn)原理本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心酶標(biāo)免疫分析法測(cè)定標(biāo)本中Prx4水平。用實(shí)施例2制備的單抗I (保藏編號(hào)為CCTCC C2012148的雜交瘤細(xì)胞分泌)作檢測(cè)溶液A，包被微孔板(單抗I包被的體積稀釋比依次為1: 500、1: IOOOU: 2000,1: 4000及1: 8000)，制成固相抗體，往包被有固相抗體的微孔中依次待測(cè)血漿、實(shí)施例1制備的多克隆抗體(檢測(cè)溶液B)(包被的體積稀釋比依次為I: 500,1: IOOOU: 2000、1:4000及I: 8000)及HRP標(biāo)記的親和素，經(jīng)過(guò)徹底洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過(guò)氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的Prx4呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(OD值)，計(jì)算樣品濃度。其中，單抗I優(yōu)選的稀釋體積為I: 2000，多克隆抗體的優(yōu)選的稀釋體積為1: 2000。同時(shí)，用實(shí)施例2制備的單抗2 (檢測(cè)溶液A)包被微孔板(單抗2包被的體積稀釋比依次為1: 10、1: 25、1: 50,1: 100及1: 200)，制成固相抗體，往包被有固相抗體的微孔中依次待測(cè)血漿、實(shí)施例1制備的多克隆抗體(檢測(cè)溶液B)(包被的體積稀釋比依次為1: 10、1: 25、1: 50,1: 100及1: 200)及HRP標(biāo)記的親和素，經(jīng)過(guò)徹底洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過(guò)氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的Prx4呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(0D值)，計(jì)算樣品含量。耳、操作步驟各試劑在使用前平衡至室溫。1.加樣:分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔。除空白孔外，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)溶液或待測(cè)樣品lOOul，注意不要有氣泡，輕輕混勻，酶標(biāo)板加上蓋，37°C反應(yīng)120分鐘。2.棄去液體，甩干，不用洗滌。3.每孔加檢測(cè)溶液A工作液100ul，37°C，60分鐘。洗板3次，350ul/每孔，甩干。4.每孔加檢測(cè)溶液B工作液lOOul，37°C，60分鐘，洗板5次，甩干。5.依序每孔加底物溶液90ul，37°C避光顯色30分鐘(此時(shí)肉眼可見(jiàn)標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色，后3-4孔梯度不明顯)。 6.依序每孔加終止溶液50ul，終止反應(yīng)(此時(shí)蘭色立轉(zhuǎn)黃色)。用酶聯(lián)儀在450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的光密度(0D值)。注意:每次實(shí)驗(yàn)留一孔作為空白調(diào)零孔，該孔不加任何試劑，只是最后加底物溶液及2NH2S04。測(cè)量時(shí)先用此孔調(diào)OD值至零。為防止樣品蒸發(fā)，試驗(yàn)時(shí)將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)。三糖尿病人的檢測(cè)取1000例二型糖尿病患者血清及200例正常人血清，用上述Elisa試劑盒對(duì)病人進(jìn)行檢測(cè)。取上述1200例人血清OD值的上限值和下限值以從小到大的順序設(shè)定OD值區(qū)間，OD值的上限值和下限值設(shè)定為1，其中，當(dāng)OD值位于O 34%區(qū)間內(nèi)(不包含34% )，命名為區(qū)間1，判定為正常人；當(dāng)OD值位于34% -100%區(qū)間(包含34% )，命名為區(qū)間2，判定為二型糖尿病患者。用上述方法判定的結(jié)果為:200例正常人血清位于區(qū)間I內(nèi)，996例二型糖尿病患者位于區(qū)間2內(nèi)。且二型糖尿病患者的嚴(yán)重程度，隨Prx4含量的增高而增高，且和性氧簇(ROS)和活性氮簇(RNS)的含量呈正相關(guān)。
權(quán)利要求
1.表位肽，其特征在于:所述表位肽為含有的氨基酸序列為WETEERPRTREE的人工合成肽，即如SEQ ID NO: I所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表位肽，其特征在于:所述表位肽的氨基酸序列具體為:WETEERPRTREEE，即如 SEQ ID NO: 2 所示。
3.含有權(quán)利要求1或2所述表位肽的蛋白載體，其特征在于:所述表位肽與BSA、OVA、肌紅蛋白、KLH和破傷風(fēng)類(lèi)毒素任一種蛋白載體連接，得含有所述表位肽的蛋白載體。
4.權(quán)利要求1或2所述表位肽制備的雜交瘤細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的雜交瘤細(xì)胞，其特征在于，所述雜交瘤細(xì)胞的生物保藏編號(hào)為 CCTCC C2012148。
6.權(quán)利要求1或2所述表位肽的特異性單克隆抗體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的特異性單克隆抗體，其特征在于，所述特異性單克隆抗體由生物保藏編號(hào)為CCTCC C2012148的雜交瘤細(xì)胞分泌。
8.權(quán)利要求6所述的特異性單克隆抗體在制備診斷二型糖尿病或類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎診斷試劑中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求1 或2所述的表位肽在制備診斷二型糖尿病診斷試劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)領(lǐng)域，特別涉及表位肽及其運(yùn)用，所述表位肽為含有的氨基酸序列為WETEERPRTREE的人工合成肽，運(yùn)用該肽制備的特異性單克隆抗體效價(jià)高，可用于制備檢測(cè)糖尿病的特異性診斷試劑。
文檔編號(hào)C07K7/08GK103232529SQ20121037849
公開(kāi)日2013年8月7日 申請(qǐng)日期2012年10月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月10日
發(fā)明者陳志新, 熊新 申請(qǐng)人:張華