變性蛋白復(fù)性裝置及復(fù)性方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供了變性蛋白復(fù)性裝置及復(fù)性方法。具體地，本發(fā)明的變性蛋白復(fù)性裝置包括：變性蛋白復(fù)性釜；超濾模塊；柱復(fù)性模塊；用于驅(qū)動(dòng)液體流動(dòng)的數(shù)控泵；用于控制液體流向的電磁閥門(mén)；用于檢測(cè)溶液狀態(tài)的在線(xiàn)檢測(cè)器；以及與所述數(shù)控泵、電磁閥門(mén)和在線(xiàn)檢測(cè)器的相連接并用于控制所述數(shù)控泵、電磁閥門(mén)和在線(xiàn)檢測(cè)器的處理器。本發(fā)明的復(fù)性裝置將稀釋復(fù)性、透析復(fù)性、柱復(fù)性等及復(fù)性后操作(包括濃縮、純化等)集成于一體，具有自動(dòng)化操作、省時(shí)省力等優(yōu)點(diǎn)，非常適用于變性蛋白的復(fù)性工藝的開(kāi)發(fā)與改進(jìn)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】變性蛋白復(fù)性裝置及復(fù)性方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明設(shè)計(jì)生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地涉及一種全自動(dòng)變性蛋白復(fù)性裝置，以及該裝置的用途。還涉及所述裝置在對(duì)重組蛋白包涵體進(jìn)行變性和復(fù)性，從而獲取有活性的目的蛋白方面的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]大腸桿菌作為應(yīng)用最為廣泛的外源基因表達(dá)系統(tǒng)，存在的主要瓶頸問(wèn)題是高表達(dá)的外源蛋白主要以無(wú)活性的包涵體形式存在，需要通過(guò)復(fù)性才能獲得生物活性。從包涵體中獲取有活性的目的蛋白，主要經(jīng)過(guò)兩個(gè)步驟:一是加變性劑溶解包涵體；二是除去變性劑使目標(biāo)蛋白復(fù)性。
[0003]本領(lǐng)域希望開(kāi)發(fā)的令人滿(mǎn)意的變性蛋白復(fù)性技術(shù)應(yīng)具有以下特征:變性蛋白復(fù)性后具有活性蛋白的組分收率高，變性蛋白復(fù)性后可以得到濃度較高的蛋白質(zhì)產(chǎn)品，復(fù)性技術(shù)易于實(shí)現(xiàn)，容易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，復(fù)性過(guò)程耗時(shí)少、快速等。
[0004]就目前已開(kāi)發(fā)的變性蛋白復(fù)性方法而言，應(yīng)用最為廣泛的復(fù)性方法是稀釋復(fù)性(50%)、透析復(fù)性(30%)和柱復(fù)性(11%)。為了實(shí)現(xiàn)變性蛋白最佳復(fù)性效率，人們開(kāi)發(fā)出了各種復(fù)性工藝，比如優(yōu)化變性蛋白復(fù)性溶液組分或氧化還原體系環(huán)境、添加相應(yīng)的蛋白質(zhì)復(fù)性分子伴侶等。一般地，這些復(fù)性工藝都建立在稀釋復(fù)性、透析復(fù)性或柱復(fù)性等方法上。然而，迄今為止本領(lǐng)域尚缺乏令人滿(mǎn)意的、高效、自動(dòng)的變性蛋白復(fù)性裝置。由于受制于變性蛋白復(fù)性裝置的限制，各種復(fù)性方法不能組合使用，導(dǎo)致操作連貫性不佳，從而限制了變性蛋白復(fù)性工藝的延伸。
[0005]綜上所述，本領(lǐng)域迫切需要開(kāi)發(fā)高效、自動(dòng)的變性蛋白復(fù)性裝置，從而便捷、高效地實(shí)現(xiàn)變性蛋白的復(fù)性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，從而開(kāi)發(fā)一種操作連貫性強(qiáng)，自動(dòng)化程度較高的新型變性蛋白復(fù)性裝置。
[0007]本發(fā)明的第一方面，提供了一種用于使變性蛋白復(fù)性形成有活性的目的蛋白的裝置，其特征在于，該裝置包括:變性蛋白復(fù)性釜、超濾模塊和柱復(fù)性模塊，以及連接所述變性蛋白復(fù)性釜、超濾模塊、和柱復(fù)性模塊的管道和位于一個(gè)或多個(gè)管道的用于驅(qū)動(dòng)液體流動(dòng)的泵，其中所述的變性蛋白復(fù)性釜可任選地作為稀釋模塊；
[0008]并且，所述裝置還包括用于控制液體流向的電磁閥門(mén)，且所述裝置通過(guò)所述電磁閥門(mén)控制液體流向，從而切換復(fù)性裝置的不同工作模式。
[0009]較佳地，所述裝置中的各復(fù)性模塊可單獨(dú)運(yùn)作、協(xié)同運(yùn)作或共同運(yùn)作，從而構(gòu)成進(jìn)行變性蛋白復(fù)性的不同工作模式，并且所述不同工作模式間的切換是通過(guò)所述閥門(mén)的調(diào)控實(shí)現(xiàn)。
[0010]在另一優(yōu)選例中，所述的復(fù)性裝置的工作模式包括以下工作模式:[0011 ] (a)超濾模塊運(yùn)作，而柱復(fù)性模塊不運(yùn)作；
[0012](b)超濾模塊不運(yùn)作，而柱復(fù)性模塊運(yùn)作；
[0013](c)超濾模塊不運(yùn)作，且柱復(fù)性模塊不運(yùn)作；和
[0014](d)超濾模塊運(yùn)作，且柱復(fù)性模塊運(yùn)作。
[0015]在另一優(yōu)選例中，所述的復(fù)性裝置能夠在變性蛋白復(fù)性釜作為或不作為稀釋模塊運(yùn)作的情況下，在上述(a)、(b)、(C)、(d)四種工作模式之間進(jìn)行切換。
[0016]在另一優(yōu)選例中，所述的電磁閥門(mén)包括:
[0017]用于控制稀釋模塊、超濾模塊和柱復(fù)性模塊組合的五通電磁閥門(mén)V6，其中所述五通電磁閥門(mén)V6連接著數(shù)控泵、復(fù)性釜、五通電磁閥門(mén)V7和六通電磁閥門(mén)V8 ；
[0018]用于控制稀釋模塊、超濾模塊和柱復(fù)性模塊組合的五通電磁閥門(mén)V7，其中所述五通電磁閥門(mén)V7連接著數(shù)控泵、五通電磁閥門(mén)V6和層析柱；和
[0019]用于控制在線(xiàn)檢測(cè)器的切換狀態(tài)的六通電磁閥門(mén)V8，其中所述六通電磁閥門(mén)V8連接著三通電磁閥門(mén)V3、三通電磁閥門(mén)V5和五通電磁閥門(mén)W。
[0020]在另一優(yōu)選例中，所述的五通電磁閥門(mén)V6和V7為一種相鄰兩孔連通、中央孔與剩下兩孔中的一個(gè)連通的五通電磁閥門(mén)；且所述的六通電磁閥門(mén)V8是一種相鄰兩孔之間連通的六通電磁閥門(mén)。
[0021]在另一優(yōu)選例中，所述裝置中的變性蛋白復(fù)性模塊包括(但不限于):
[0022]作為稀釋模塊的變性蛋白復(fù)性釜，其中變性蛋白在所述復(fù)性釜中進(jìn)行復(fù)性反應(yīng)；
[0023]超濾模塊，所述的超濾模塊與復(fù)性釜連通構(gòu)成一液體流通回路，其中所述的超濾模塊用于通過(guò)透析復(fù)性使得變性蛋白復(fù)性并且通過(guò)超濾截留復(fù)性的蛋白，和/或
[0024]柱復(fù)性模塊，所述的柱復(fù)性模塊與復(fù)性釜連通構(gòu)成一液體流通回路，其中所述的柱復(fù)性模塊用于通過(guò)柱復(fù)性使得變性蛋白復(fù)性；且所述各個(gè)模塊可以單獨(dú)或共同用于變性蛋白復(fù)性。
[0025]在另一優(yōu)選例中，變性蛋白復(fù)性釜包括復(fù)性瓶和攪拌裝置，復(fù)性瓶底部設(shè)置3個(gè)進(jìn)出口，其中一個(gè)進(jìn)出口與數(shù)控泵P2相連通，剩下的兩個(gè)與五通電磁閥門(mén)V6相連通。
[0026]在另一優(yōu)選例中，所述超濾模塊具有進(jìn)料口、截留口和滲透口，其中進(jìn)料口與三通電磁閥門(mén)V2相連通，截留口與三通電磁閥門(mén)V3相連通，其滲透口與一廢液排出管道相連通。
[0027]在另一優(yōu)選例中，所述超濾模塊的滲透口處配置流量計(jì)。
[0028]在另一優(yōu)選例中，所述的超濾模塊和/或柱復(fù)性模塊是可以自由拆卸。
[0029]在另一優(yōu)選例中，所述的柱復(fù)性模塊為層析柱；較佳地所述層析柱包括:親和層析柱、尚子交換柱(包括陰尚子和陰尚子交換柱)交換柱、疏水層析柱、和分子篩柱。
[0030]在另一優(yōu)選例中，所述層析柱的進(jìn)料口與五通電磁閥門(mén)V7相連通，層析柱出樣口與三通電磁閥門(mén)V5連通。
[0031]在另一優(yōu)選例中，所述裝置還包括用于檢測(cè)溶液狀態(tài)的在線(xiàn)檢測(cè)器。
[0032]在另一優(yōu)選例中，所述的在線(xiàn)檢測(cè)器包括流量計(jì)、pH、電導(dǎo)率、可見(jiàn)光-紫外檢測(cè)器。
[0033]在另一優(yōu)選例中，所述的在線(xiàn)檢測(cè)器的檢測(cè)部分(或探頭)位于通道內(nèi)，并且所述通道的進(jìn)口和出口與六通電磁閥門(mén)V8的兩路相連通，形成一獨(dú)立回路。[0034]在另一優(yōu)選例中，所述的電磁閥門(mén)還包括:
[0035]用于控制復(fù)性液流入復(fù)性釜的四元梯度電磁閥門(mén)VI，其中所述四元梯度電磁閥門(mén)Vl與復(fù)性液或盛裝復(fù)性液的儲(chǔ)液器(如儲(chǔ)液瓶)和復(fù)性釜相連通；
[0036]用于控制復(fù)性釜中液體流出蛋白超濾膜組件的三通電磁閥門(mén)V2，其中所述三通電磁閥門(mén)V2與超濾模塊和復(fù)性釜連通；
[0037]用于控制從超濾模塊流出的液體的三通電磁閥門(mén)V3，其中所述第三電磁閥門(mén)V3與超濾模塊和六通電磁閥門(mén)V8相連通；
[0038]用于控制溶液流入層析柱的四元梯度電磁閥門(mén)V4，其中所述四元梯度電磁閥門(mén)V4與復(fù)性液或盛裝復(fù)性液的儲(chǔ)液器(如儲(chǔ)液瓶)和五通電磁閥門(mén)V7相連通；
[0039]用于控制從柱復(fù)性模塊流出的液體的三通電磁閥門(mén)V5，其中所述三通電磁閥門(mén)V5與柱復(fù)性模塊和六通電磁閥門(mén)V8相連通。
[0040]在另一優(yōu)選例中，所述的四元梯度電磁閥門(mén)Vl為可以控制四路液體流向和分配比例的四元梯度電磁閥。
[0041]在另一優(yōu)選例中，所述的復(fù)性液包括(但并不限于):洗脫液、洗滌用緩沖液等。
[0042]在另一優(yōu)選例中，所述的三通電磁閥門(mén)V2和V3為耐壓型三通電磁閥，可以控制三路中的任兩路相連通；
[0043]所述的四元梯度電磁閥門(mén)V4為可以控制四路液體流向和分配比例的四元梯度電磁閥;和/或;
[0044]所述的三通電磁閥門(mén)V5為一進(jìn)兩出型三通電磁閥。
[0045]在另一優(yōu)選例中，所述`裝置還具有選自下組的一個(gè)或多個(gè)特征:
[0046]-所述的泵為數(shù)控泵；
[0047]-所述裝置還包括:與所述數(shù)控泵、電磁閥門(mén)和在線(xiàn)檢測(cè)器的相連接并用于控制所述數(shù)控泵、電磁閥門(mén)和在線(xiàn)檢測(cè)器的處理器；
[0048]-所述裝置還包括:與復(fù)性蛋白復(fù)性釜連通的儲(chǔ)液瓶，其中所述儲(chǔ)液瓶用于盛裝復(fù)性液。
[0049]在另一優(yōu)選例中，所述的數(shù)控泵Pl數(shù)控泵P2、和/或數(shù)控泵P3是蠕動(dòng)泵或柱塞栗。
[0050]在另一優(yōu)選例中，所述的處理器包括(但并不限于):單片機(jī)、平板電腦等。
[0051]在另一優(yōu)選例中，所述的數(shù)控泵包括:
[0052]用于驅(qū)動(dòng)復(fù)性液流入復(fù)性釜的第一數(shù)控泵Pl ；
[0053]用于驅(qū)動(dòng)復(fù)性釜中液體流出復(fù)性釜并流向超濾模塊的第二數(shù)控泵P2 ;和
[0054]用于驅(qū)動(dòng)液體流向柱復(fù)性模塊的第三數(shù)控泵P3。
[0055]在另一優(yōu)選例中，在三通電磁閥門(mén)V5和五通電磁閥門(mén)V7通過(guò)一管道直接連通,從而用于洗滌共享管道、數(shù)控泵等。
[0056]在另一優(yōu)選例中，儲(chǔ)液通過(guò)相應(yīng)的管道與四元梯度電磁閥門(mén)Vl或V4進(jìn)料口連通；
[0057]在另一優(yōu)選例中，所述的蛋白收集器和廢液收集器包括各種常規(guī)的容器，例如試管、瓶、杯等。
[0058]在另一優(yōu)選例中，所述的蛋白收集器是自動(dòng)收集器。[0059]在另一優(yōu)選例中，所述的廢液收集器是廢液瓶。
[0060]在另一優(yōu)選例中，用于使變性蛋白復(fù)性，從而形成有活性的目的蛋白。
[0061]本發(fā)明的第二方面，提供了一種使變性蛋白復(fù)性形成有活性的目的蛋白的方法，其特征在于，包括步驟:用本發(fā)明第一方面所述的變性蛋白復(fù)性裝置進(jìn)行蛋白復(fù)性，從而形成或獲得復(fù)性后的有活性的目的蛋白。
[0062]在另一優(yōu)選例中，所述的步驟包括:將待復(fù)性的變性蛋白進(jìn)入復(fù)性釜或?qū)游鲋?；然后啟?dòng)本發(fā)明第一方面所述的復(fù)性裝置進(jìn)行復(fù)性，從而形成或獲得復(fù)性后的有活性的目的蛋白。
[0063]在另一優(yōu)選例中，所述的復(fù)性包括在不同工作模式下進(jìn)行復(fù)性。較佳地，所述裝置中的包括稀釋模塊、超濾模塊和柱復(fù)性模塊在內(nèi)的各復(fù)性模塊單獨(dú)運(yùn)作、協(xié)同運(yùn)作或共同運(yùn)作，從而構(gòu)成進(jìn)行變性蛋白復(fù)性的不同工作模式。
[0064]應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再
累述。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0065]圖1顯示了本發(fā)明一個(gè)實(shí)例中的變性蛋白復(fù)性裝置的結(jié)構(gòu)圖。
[0066]圖2顯示了 本發(fā)明一個(gè)實(shí)例中的透析部分的示意圖。
[0067]圖3A、3B、3C和3D分別顯示了本發(fā)明一個(gè)實(shí)例中的五通電磁閥門(mén)V6的四種工作模式示意圖。
[0068]圖4A、4B和4C分別顯示了本發(fā)明一個(gè)實(shí)例中的五通電磁閥門(mén)V7的三種工作狀態(tài)示意圖。
[0069]圖5A和圖5B分別顯不了本發(fā)明一個(gè)實(shí)例中的六通電磁閥門(mén)V8的兩種工作狀態(tài)
示意圖。
[0070]圖6A顯示了本發(fā)明一個(gè)實(shí)例中SDF/CXCL12的分子篩(Superdex-7510/300)分析，實(shí)線(xiàn)為8mg/ml的SDF/CXCL12的洗脫曲線(xiàn)，虛線(xiàn)為1.2mg/ml的SDF/CXCL12的洗脫曲線(xiàn)，表明復(fù)性后SDF/CXCL12蛋白具有自組裝特性，與天然SDF/CXCL12的特性一致。
[0071]圖6B顯示了本發(fā)明一個(gè)實(shí)例中SDF/CXCL12的圓二色譜分析，復(fù)性后SDF/CXCL12的圓二色譜形狀及特征峰與天然SDF/CXCL12的一致，表明復(fù)性后SDF/CXCL12蛋白具有自組裝特性，與天然SDF/CXCL12的特性一致。
[0072]圖7A顯示了本發(fā)明一個(gè)實(shí)例中的用蒸餾水漂洗復(fù)性釜時(shí)裝置的示意圖。
[0073]圖7B顯示了本發(fā)明一個(gè)實(shí)例中的用蒸餾水漂洗復(fù)性釜時(shí)裝置的示意圖。
[0074]圖7C顯示了本發(fā)明一個(gè)實(shí)例中的用變性液和復(fù)性液漂洗復(fù)性釜時(shí)裝置的示意圖。
[0075]圖7D顯示了本發(fā)明一個(gè)實(shí)例中的用變性液和復(fù)性液漂洗復(fù)性釜時(shí)裝置的示意圖。
[0076]圖7E顯示了本發(fā)明一個(gè)實(shí)例中的變性蛋白加入復(fù)性釜時(shí)裝置的示意圖。
[0077]圖7F顯示了本發(fā)明一個(gè)實(shí)例中的復(fù)性液加入復(fù)性釜時(shí)裝置的示意圖。
[0078]圖7G顯示了本發(fā)明一個(gè)實(shí)例中的用平衡液漂洗超濾膜時(shí)裝置的示意圖。[0079]圖7H顯示了本發(fā)明一個(gè)實(shí)例中的用平衡液透析復(fù)性蛋白時(shí)裝置的示意圖。
[0080]圖71顯示了本發(fā)明一個(gè)實(shí)例中的用平衡液和洗脫液漂洗純化系統(tǒng)時(shí)裝置的示意圖。
[0081]圖7J顯示了本發(fā)明一個(gè)實(shí)例中的用平衡液平衡層析柱時(shí)裝置的示意圖。
[0082]圖7K顯示了本發(fā)明一個(gè)實(shí)例中的從復(fù)性釜對(duì)層析柱上樣時(shí)裝置的示意圖。
[0083]圖7L顯示了本發(fā)明一個(gè)實(shí)例中的將復(fù)性釜和超濾膜組件中殘留樣品推入層析柱時(shí)裝置的示意圖。
[0084]圖7M顯示了本發(fā)明一個(gè)實(shí)例中的洗脫層析柱中的樣品時(shí)裝置的示意圖。
[0085]圖7N顯示了本發(fā)明一個(gè)實(shí)例中的清洗裝置時(shí)的工作狀態(tài)示意圖。
[0086]圖70顯示了本發(fā)明一個(gè)實(shí)例中的清洗裝置時(shí)的工作狀態(tài)示意圖。
[0087]圖7P顯示了本發(fā)明一個(gè)實(shí)例中的清洗裝置時(shí)的工作狀態(tài)示意圖。
[0088]圖7Q顯示了本發(fā)明一個(gè)實(shí)例中的清洗裝置時(shí)的工作狀態(tài)示意圖。
[0089]圖7R顯示了本發(fā)明一個(gè)實(shí)例中的清洗裝置時(shí)的工作狀態(tài)示意圖。
[0090]附圖中的各標(biāo)識(shí)含義如下:
[0091]A1、A2、A3、A4和B1、B2、B3、B4分別表示與某一儲(chǔ)液瓶相連的管道，主要用于將復(fù)性液引入復(fù)性釜或?qū)游鲋．?dāng)然，這些管道也可將待復(fù)性的變性蛋白溶液引入復(fù)性釜或?qū)游鲋?br> [0092]Vl、V2、V3、V4、V5、V6、V7和V8分別表示四元梯度電磁閥門(mén)Vl、三通電磁閥門(mén)V2、三通電磁閥門(mén)V3、四元梯度電磁閥門(mén)V4、三通電磁閥門(mén)V5、五通電磁閥門(mén)V6、五通電磁閥門(mén)V7和六通電磁閥門(mén)V8。
[0093]P1、P2和P3分別表示第一、二和第三數(shù)控泵。
[0094]Out [I]、Out [2]、Out [3]和Out [4]分別表示裝置中溶液排出管道。
[0095]L16、Lr6a、Lr6b、Lr2、L38、L47、L58、L57、L67、L68 等分別表示管道，特別地，L57表示表示不通過(guò)層析柱的管道。
【具體實(shí)施方式】
[0096]本發(fā)明人經(jīng)過(guò)廣泛而深入的研究，研發(fā)出了一種全自動(dòng)變性蛋白復(fù)性裝置。該裝置不僅可適用于稀釋復(fù)性、透析復(fù)性和柱復(fù)性等多種復(fù)性方法，而且可以靈活地在不同工作模式之間進(jìn)行切換。該裝置通過(guò)采納流加多種溶液、控制流速、控制溶液濃度變化速率或模式、組合多種復(fù)性方法等方式，使得該裝置的實(shí)用性大幅提供，可以適用于各種不同變性蛋白的復(fù)性，有助于高效地實(shí)現(xiàn)變性蛋白復(fù)性，并且對(duì)于技術(shù)人員開(kāi)發(fā)新的復(fù)性工藝提供了極大的便利和設(shè)計(jì)空間。
[0097]術(shù)語(yǔ)
[0098]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“復(fù)性”就是通過(guò)合理設(shè)計(jì)的復(fù)性過(guò)程，從而使得無(wú)活性或活性較低的變性蛋白形成有活性的或活性更高的目的蛋白。
[0099]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“本發(fā)明裝置”和“本發(fā)明的變性蛋白復(fù)性裝置”可互換使用。
[0100]復(fù)性裝置
[0101]本發(fā)明裝置包括:變性蛋白復(fù)性爸、超濾模塊和柱復(fù)性模塊，以及連接所述變性蛋白復(fù)性釜、超濾模塊、和柱復(fù)性模塊的管道和位于一個(gè)或多個(gè)管道的用于驅(qū)動(dòng)液體流動(dòng)的泵；并且，所述裝置還包括用于控制液體流向的電磁閥門(mén)，且所述裝置通過(guò)所述電磁閥門(mén)控制液體流向，從而切換復(fù)性裝置的不同工作模式。此外，本發(fā)明裝置宜包括用于檢測(cè)溶液狀態(tài)的在線(xiàn)檢測(cè)器。
[0102]在本發(fā)明中，復(fù)性釜、超濾模塊、柱復(fù)性模塊、管道、泵以及檢測(cè)器等部件，可采用常規(guī)的或市售的部件。
[0103]如圖1所示，在本發(fā)明中裝置中，多個(gè)儲(chǔ)液瓶(未示出)分別通過(guò)A1、A2、A3、A4管道與四元梯度電磁閥門(mén)Vl連通；多個(gè)儲(chǔ)液瓶分別通過(guò)B1、B2、B3管道與四元梯度電磁閥門(mén)V4連通。
[0104]復(fù)性釜包括復(fù)性瓶(Reservoir)和攪拌裝置，其中復(fù)性瓶的體積沒(méi)有特別限制，一般可以為50~5000毫升，較佳地為50~1000毫升。
[0105]在本發(fā)明中，復(fù)性釜可作為稀釋復(fù)性模塊，也可不作為稀釋復(fù)性模塊(即僅作為儲(chǔ)液瓶)。
[0106]復(fù)性瓶的材質(zhì)沒(méi)有特別限制，一般可以用玻璃、塑料或不銹鋼。
[0107]復(fù)性瓶的一端設(shè)有蓋子(如螺紋瓶蓋)，其上設(shè)有3個(gè)孔道。
[0108]攪拌裝置包括磁力攪拌器(未標(biāo)出)和攪拌子，其中攪拌子位于復(fù)性瓶底部。
[0109]五通電磁閥門(mén)V6和五通電磁閥門(mén)V7是一種相鄰兩孔連通、中央孔與剩下兩孔中的一個(gè)連通的五通電磁閥門(mén)。
[0110]四元梯度電磁閥門(mén)Vl與五通電磁閥門(mén)V6之間的管道為L(zhǎng)16。
`[0111]復(fù)性釜上的兩個(gè)孔道分別與五通電磁閥門(mén)V6之間的管道為L(zhǎng)r6a、Lr6b。
[0112]復(fù)性釜上的剩下的一個(gè)孔道與三通電磁閥門(mén)V2之間的管道為L(zhǎng)r2。
[0113]三通電磁閥門(mén)V2與三通電磁閥門(mén)V3之間存在蛋白超濾膜組件。
[0114]三通電磁閥門(mén)V3與六通電磁閥門(mén)V8之間的管道為L(zhǎng)38。
[0115]如圖2所示，本發(fā)明中的透析部分(或模塊)包括三通電磁閥門(mén)V2、三通電磁閥門(mén)V3和蛋白超濾膜組件及流量計(jì)。三通電磁閥門(mén)V2和三通電磁閥門(mén)V3分別是由兩個(gè)三通電磁閥門(mén)(一進(jìn)兩出型)串聯(lián)組成。三通電磁閥門(mén)(一進(jìn)兩出型)有三個(gè)孔1、2和3，其中I號(hào)孔為公共孔。三通電磁閥門(mén)(一進(jìn)兩出型)只能I號(hào)孔與2號(hào)孔連通，或者I號(hào)孔與3號(hào)孔連通。兩個(gè)三通電磁閥門(mén)(一進(jìn)兩出型)通過(guò)公共孔串聯(lián)組成三通電磁閥門(mén)V2或三通電磁閥門(mén)V3，從而可以實(shí)現(xiàn)兩個(gè)三通電磁閥門(mén)(一進(jìn)兩出型)中2號(hào)孔與3號(hào)孔之間的連通。
[0116]流量計(jì)Flow meter檢測(cè)出口 Out [2]溶液的流速。
[0117]蛋白超濾膜組件(ultrafiltration membrane)的截留分子量一般為8~30kDa。
[0118]六通電磁閥門(mén)V8是一種相鄰兩孔之間連通的六通電磁閥門(mén)。
[0119]五通電磁閥門(mén)V6與六通電磁閥門(mén)V8之間的通道為L(zhǎng)68。
[0120]五通電磁閥門(mén)V6與六通電磁閥門(mén)V7之間的管道為L(zhǎng)67。
[0121]在線(xiàn)過(guò)濾器件(online filters)位于管道L67上,用于除去溶液中的懸浮顆粒。
[0122]在線(xiàn)過(guò)濾器件分別由大孔徑濾膜和小孔徑濾膜組成，其中大孔徑濾膜孔徑一般為100~10 μ m,小孔徑濾膜孔徑一般為10~I μ m。
[0123]四元梯度電磁閥門(mén)V4與六通電磁閥門(mén)V7之間的管道為L(zhǎng)47。
[0124]五通電磁閥門(mén)V7與三通電磁閥門(mén)V5之間存在管道L57和層析柱。[0125]三通電磁閥門(mén)V5與六通電磁閥門(mén)V8之間的管道為L(zhǎng)58。
[0126]三通電磁閥門(mén)V5只有一個(gè)三通電磁閥門(mén)(一進(jìn)兩出型)組成。三通電磁閥門(mén)(一進(jìn)兩出型)的公共孔與六通電磁閥門(mén)V8之間通過(guò)管道L58連接。
[0127]數(shù)控泵Pl控制管道L16中溶液流向復(fù)性瓶的流速，流速范圍為O~50ml/min。
[0128]數(shù)控泵P2控制管道Lr2中溶液流向蛋白超濾膜組件的流速，流速范圍為O~200ml/mino
[0129]數(shù)控泵P3控制管道L47中溶液的流速，流速范圍為O~50ml/min。
[0130]五通電磁閥門(mén)V6的四種工作狀態(tài)
[0131]如圖3所示，本發(fā)明中的五通電磁閥門(mén)V6連接著數(shù)控泵P1、復(fù)性釜、五通電磁閥門(mén)V7和六通電磁閥門(mén)V8。五通電磁閥門(mén)V6能夠切換四種工作狀態(tài)，分別對(duì)應(yīng)著圖3中的A、B、C、D。
[0132]如圖3A所示，五通電磁閥門(mén)V6連通數(shù)控泵Pl和復(fù)性釜；同時(shí)五通電磁閥門(mén)V6連通復(fù)性釜和六通電磁閥門(mén)V8。
[0133]如圖3B所示，五通電磁閥門(mén)V6連通數(shù)控泵Pl和五通電磁閥門(mén)V7。
[0134]如圖3C所示，五通電磁閥門(mén)V6連通數(shù)控泵Pl和六通電磁閥門(mén)V8 ;同時(shí)五通電磁閥門(mén)V6連通復(fù)性釜和五通電磁閥門(mén)V7。
[0135]如圖3D所示，五通電磁閥門(mén)V6連通數(shù)控泵Pl和復(fù)性釜；同時(shí)五通電磁閥門(mén)V6連通五通電磁閥門(mén)V7和六通電磁閥門(mén)W。
[0136]五通電磁閥門(mén)V7的三種工作狀態(tài)
[0137]如圖4所示，本發(fā)明中的五通電磁閥門(mén)V7連接著五通電磁閥門(mén)V6、數(shù)控泵P3、管道L57和層析柱。五通電磁閥門(mén)V7能夠切換三種工作狀態(tài)，分別對(duì)應(yīng)著圖4中的A、B、C。
[0138]如圖4A所示，五通電磁閥門(mén)V7連通五通電磁閥門(mén)V6和層析柱，同時(shí)連通數(shù)控泵P3和管道L57。
[0139]如圖4B所示，五通電磁閥門(mén)V7連通五通電磁閥門(mén)V6和管道L57。
[0140]如圖4C所示，五通電磁閥門(mén)V7連通數(shù)控泵P3和層析柱。
[0141]六通電磁閥門(mén)V8的兩種工作狀態(tài)
[0142]如圖5所示，本發(fā)明中的六通電磁閥門(mén)連接著三通電磁閥門(mén)V5、在線(xiàn)檢測(cè)器、五通電磁閥門(mén)V6和出口 0ut[4]。其中，所述的檢測(cè)器包括(但并不限于):pH、電導(dǎo)率和紫外-可見(jiàn)光檢測(cè)器或裝置。六通電磁閥門(mén)V8能夠切換兩種工作狀態(tài)，分別對(duì)應(yīng)著圖5中的A和B。
[0143]如圖5A所示，在線(xiàn)監(jiān)測(cè)器連通管道L68和管道L38，從而使得在線(xiàn)檢測(cè)器位于透析模塊的下游。
[0144]如圖5A所示，在線(xiàn)監(jiān)測(cè)器連通管道L58和出口 Out [4]，從而使得在線(xiàn)檢測(cè)器位于層析柱的下游。
[0145]本發(fā)明變性蛋白復(fù)性裝置，在不同工作狀態(tài)、工作步驟、或工作模式下的操作流程如圖7A~7R所示，其中包括(但并不限于):用蒸餾水漂洗復(fù)性釜；用變性液和復(fù)性液漂洗復(fù)性釜；將變性蛋白加入復(fù)性釜；將復(fù)性液加入復(fù)性釜；用平衡液漂洗超濾膜；用平衡液透析復(fù)性蛋白；用平衡液和洗脫液漂洗純化系統(tǒng)；用平衡液平衡層析柱；從復(fù)性釜對(duì)層析柱上樣；將復(fù)性釜和超濾膜組件中殘留樣品推入層析柱；洗脫層析柱中的樣品；清洗裝置。應(yīng)理解，上述不同工作狀態(tài)、工作步驟、或工作模式可以按各種不同次序，相互組合，從而構(gòu)成不同的工作狀態(tài)或工作模式。
[0146]本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)包括:[0147](a)本發(fā)明裝置適合目前多種常用的復(fù)性方法。
[0148](b)集成多種復(fù)性方法及復(fù)性后續(xù)操作于一體化，可以靈活地在不同的工作模式下進(jìn)行復(fù)性，因此可以廣泛適用于不同種類(lèi)的蛋白復(fù)性。
[0149](C)變性蛋白復(fù)性工藝有顯著改進(jìn)，可節(jié)省大量人力，并且減少差錯(cuò)。
[0150](d)變性蛋白復(fù)性過(guò)程多參數(shù)監(jiān)控可以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。
[0151](e)獨(dú)立操作單元按時(shí)序方式自動(dòng)化完成。
[0152](f)有助于開(kāi)發(fā)針對(duì)不同蛋白復(fù)性的高效方法和條件。
[0153]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠(chǎng)商所建議的條件。除非另外說(shuō)明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。
[0154]實(shí)施例1:重組人SDF/CXCL12蛋白的復(fù)性
[0155]采用圖1所示的裝置進(jìn)行變性蛋白的復(fù)性，復(fù)性工藝如下:
[0156]包涵體溶解液(50mMTrisHCl, 6M GdnHCl, IOmM β -mercaptoethanol, pH8.0)溶解包涵體后，緩慢地將變性蛋白溶液稀釋到復(fù)性液(含有L-精氨酸)中，復(fù)性一段時(shí)間后，通過(guò)透析操作置換緩沖液，除去L-精氨酸，最后在線(xiàn)富集和純化目的蛋白。
[0157]變性蛋白在本裝置上的復(fù)性過(guò)程可以分為:準(zhǔn)備階段、工作階段和收尾階段。各具體操作流程可參見(jiàn)圖7A-7R。
[0158]在準(zhǔn)備階段，五通電磁閥門(mén)V6連通數(shù)控泵Pl和復(fù)性液(如圖3A所示)。超純水通過(guò)數(shù)控泵Pl清洗四元梯度電磁閥門(mén)Vl的Al、A2、A3、A4管道至復(fù)性釜，流速40ml/min，時(shí)間lmin。復(fù)性釜中的超純水通過(guò)數(shù)控泵P2經(jīng)出口 0ut[l]排出。包涵體溶解液和復(fù)性液通過(guò)數(shù)控泵Pl清洗四元梯度電磁閥門(mén)Vl的Al、A2管道至復(fù)性釜，流速40ml/min，時(shí)間lmin。復(fù)性釜中的溶液再次通過(guò)數(shù)控泵P2經(jīng)出口 0ut[l]排出。
[0159]在工作階段，30ml的變性蛋白(蛋白濃度為L(zhǎng) Omg/ml)通過(guò)數(shù)控泵Pl引入復(fù)性釜中，流速2ml/min。然后，300ml的復(fù)性液通過(guò)數(shù)控泵Pl緩慢地引入復(fù)性釜中，流速為
0.23ml/min,時(shí)間約為21小時(shí)。五通電磁閥門(mén)V6連通數(shù)控泵Pl和六通電磁閥門(mén)V8(如圖3C所示)。
[0160]平衡液通過(guò)數(shù)控泵Pl清洗四元梯度電磁閥門(mén)Vl的A3、在線(xiàn)監(jiān)測(cè)器和蛋白超濾膜組件至出口 Out [I]排出，流速10ml/min,時(shí)間5min。五通電磁閥門(mén)V6連通數(shù)控泵Pl和復(fù)性液，同時(shí)復(fù)性釜和六通電磁閥門(mén)V8連通(如圖3A所示)。
[0161]平衡液通過(guò)數(shù)控泵Pl連續(xù)地引入復(fù)性釜中，流速2ml/min。與此同時(shí)，復(fù)性釜中的溶液通過(guò)數(shù)控泵P2連續(xù)地引入蛋白超濾膜組件，流速50ml/min。蛋白過(guò)濾液通過(guò)出口Out[2]排出，設(shè)定流速為2ml/min ;蛋白截留液再通過(guò)在線(xiàn)檢測(cè)器回流至復(fù)性釜中。
[0162]經(jīng)過(guò)12小時(shí)的透析操作，五通電磁閥門(mén)連通數(shù)控泵Pl和五通電磁閥門(mén)V7(如圖3B)，五通電磁閥門(mén)V7連通五通電磁閥門(mén)和管道L67 (如圖4B)，轉(zhuǎn)動(dòng)六通電磁閥門(mén)V8使得在線(xiàn)檢測(cè)器位于層析柱的下游(如圖5B)。
[0163]平衡液和洗脫液通過(guò)數(shù)控泵Pl清洗層析系統(tǒng)，流速20ml/min，時(shí)間lmin。然后，再次轉(zhuǎn)動(dòng)五通電磁閥門(mén)V7使得五通電磁閥門(mén)與層析柱(CM-sepharose FF, 5ml)連通(如圖4A所示)ο
[0164]平衡液通過(guò)數(shù)控泵Pl清洗層析柱5個(gè)柱體積，流速2ml/min。調(diào)節(jié)五通電磁閥門(mén)V6連通數(shù)控泵Pl和復(fù)性釜連通，同時(shí)六通電磁閥門(mén)V8和五通電磁閥門(mén)V7連通(如圖3D)。
[0165]復(fù)性釜中的蛋白通過(guò)數(shù)控泵P2引入層析柱，流速5ml/min。蛋白超濾膜組件等中殘留的蛋白溶液通過(guò)數(shù)控泵Pl引入部分平衡液至復(fù)性釜，然后再通過(guò)數(shù)控泵P2將殘留的蛋白溶液推入層析柱中。調(diào)節(jié)五通電磁閥門(mén)V6連通數(shù)控泵Pl和五通電磁閥門(mén)V7(如圖3B所示)。
[0166]平衡液通過(guò)數(shù)控泵Pl漂洗層析柱5個(gè)柱體積。最后，平衡液和洗脫液通過(guò)四元梯度電磁閥門(mén)Vl以20個(gè)柱體積的O~100%的線(xiàn)性梯度將蛋白質(zhì)從層析柱洗脫出來(lái)。
[0167]在收尾階段，超純水清洗整個(gè)系統(tǒng)。五通電磁閥門(mén)V7連通五通電磁閥門(mén)V6和管道L57(如圖4B所示)。超純水通過(guò)數(shù)控泵Pl經(jīng)Al、A2清洗層析系統(tǒng)，流速20ml/min，時(shí)間Imin。然后五通電磁閥門(mén)V7再次連通五通電磁閥門(mén)V6和層析柱(如圖3B所示)。
[0168]超純水通過(guò)數(shù)控泵經(jīng)Al、A2清洗層析柱。五通電磁閥門(mén)V6連通數(shù)控泵Pl和復(fù)性釜(如圖3A和3D所示)。
[0169]超純水通過(guò)數(shù)控泵Pl經(jīng)A1、A2、A3、A4清洗復(fù)性爸,流速40ml/min,時(shí)間5min。復(fù)性釜中的超純水通過(guò)數(shù)控泵P2經(jīng)出口 Out[I]排出。五通電磁閥門(mén)V6連通數(shù)控泵Pl和六通電磁閥門(mén)V8(如圖3C所示)。
[0170]超純水通過(guò)數(shù) 控泵Pl經(jīng)Al、A2、A3、A4清洗蛋白超濾膜組件至出口 Out [I]排出，流速 40ml/min,時(shí)間 5min。
[0171]結(jié)果:
[0172]本實(shí)施例1中稀釋模塊、透析模塊和柱復(fù)性模塊相結(jié)合實(shí)施。本實(shí)施例中，通過(guò)微電腦處理，通過(guò)程序來(lái)設(shè)置、控制和執(zhí)行操作單元命令(如管道清洗、復(fù)性方法的選擇、管道連接等)，因此，操作按時(shí)序方式自動(dòng)化完成，提高了工作效率。
[0173]如圖表1所示，起始變性蛋白質(zhì)量30mg，蛋白純度約60% ;復(fù)性后蛋白質(zhì)量8.7mg，蛋白純度約96%。因此，重組人SDF/CXCL12蛋白的制備得率約為46%。
[0174]如圖6所示，復(fù)性后SDF/CXCL12蛋白的定性分析。如圖6A所示為SDF/CXCL12的分子篩(Superdex-7510/300)分析，實(shí)線(xiàn)為8mg/ml的SDF/CXCL12的洗脫曲線(xiàn)，虛線(xiàn)為1.2mg/ml的SDF/CXCL12的洗脫曲線(xiàn)。圖6A表明復(fù)性后SDF/CXCL12蛋白具有自組裝特性，與天然SDF/CXCL12的特性一致。如圖6B所示為SDF/CXCL12的圓二色譜分析。復(fù)性后SDF/CXCL12的圓二色譜形狀及特征峰與天然SDF/CXCL12的一致。因此，生物物理方法分析復(fù)性后SDF/CXCL12具有天然SDF/CXCL12的特性。
[0175]表1.重組人SDF/CXCL12蛋白純化表
【權(quán)利要求】
1.一種用于使變性蛋白復(fù)性形成有活性的目的蛋白的裝置，其特征在于，該裝置包括:變性蛋白復(fù)性釜、超濾模塊和柱復(fù)性模塊，以及連接所述變性蛋白復(fù)性釜、超濾模塊、和柱復(fù)性模塊的管道和位于一個(gè)或多個(gè)管道的用于驅(qū)動(dòng)液體流動(dòng)的泵，其中所述的變性蛋白復(fù)性釜可任選地作為稀釋模塊； 并且，所述裝置還包括用于控制液體流向的電磁閥門(mén)，且所述裝置通過(guò)所述電磁閥門(mén)控制液體流向，從而切換復(fù)性裝置的不同工作模式； 較佳地，所述裝置中的各復(fù)性模塊可單獨(dú)運(yùn)作、協(xié)同運(yùn)作或共同運(yùn)作，從而構(gòu)成進(jìn)行變性蛋白復(fù)性的不同工作模式，并且所述不同工作模式間的切換是通過(guò)所述閥門(mén)的調(diào)控實(shí)現(xiàn)。
2.如權(quán)利要求1所述的變性蛋白復(fù)性裝置，其特征在于，所述的復(fù)性裝置的工作模式包括以下工作模式: (a)超濾模塊運(yùn)作，而柱復(fù)性模塊不運(yùn)作； (b)超濾模塊不運(yùn)作，而柱復(fù)性模塊運(yùn)作； (C)超濾模塊不運(yùn)作，且柱復(fù)性模塊不運(yùn)作；和 (d)超濾模塊運(yùn)作，且柱復(fù)性模塊運(yùn)作。
3.如權(quán)利要求1或2所述的變性蛋白復(fù)性裝置，所述的電磁閥門(mén)包括: 用于控制稀釋模塊、超濾模塊和柱復(fù)性模塊組合的五通電磁閥門(mén)V6，其中所述五通電磁閥門(mén)V6連接著數(shù)控泵 、復(fù)性釜、五通電磁閥門(mén)V7和六通電磁閥門(mén)V8 ； 用于控制稀釋模塊、超濾模塊和柱復(fù)性模塊組合的五通電磁閥門(mén)V7，其中所述五通電磁閥門(mén)V7連接著數(shù)控泵、五通電磁閥門(mén)V6和層析柱；和 用于控制在線(xiàn)檢測(cè)器的切換狀態(tài)的六通電磁閥門(mén)V8，其中所述六通電磁閥門(mén)V8連接著三通電磁閥門(mén)V3、三通電磁閥門(mén)V5和五通電磁閥門(mén)W。
4.如權(quán)利要求3所述的變性蛋白復(fù)性裝置，其特征在于，所述的五通電磁閥門(mén)V6和V7為一種相鄰兩孔連通、中央孔與剩下兩孔中的一個(gè)連通的五通電磁閥門(mén)；且所述的六通電磁閥門(mén)V8是一種相鄰兩孔之間連通的六通電磁閥門(mén)。
5.如權(quán)利要求1所述的變性蛋白復(fù)性裝置，其特征在于，所述裝置中的變性蛋白復(fù)性模塊包括: 作為稀釋模塊的變性蛋白復(fù)性釜，其中變性蛋白在所述復(fù)性釜中進(jìn)行復(fù)性反應(yīng)； 超濾模塊，所述的超濾模塊與復(fù)性釜連通構(gòu)成一液體流通回路，其中所述的超濾模塊用于通過(guò)透析復(fù)性使得變性蛋白復(fù)性并且通過(guò)超濾截留復(fù)性的蛋白，和/或 柱復(fù)性模塊，所述的柱復(fù)性模塊與復(fù)性釜連通構(gòu)成一液體流通回路，其中所述的柱復(fù)性模塊用于通過(guò)柱復(fù)性使得變性蛋白復(fù)性；且所述各個(gè)模塊可以單獨(dú)或共同用于變性蛋白復(fù)性。
6.如權(quán)利要求1所述的變性蛋白復(fù)性裝置，其特征在于，所述裝置還包括用于檢測(cè)溶液狀態(tài)的在線(xiàn)檢測(cè)器。
7.如權(quán)利要求1所述的變性蛋白復(fù)性裝置，其特征在于，所述的電磁閥門(mén)還包括: 用于控制復(fù)性液流入復(fù)性釜的四元梯度電磁閥門(mén)VI，其中所述四元梯度電磁閥門(mén)Vl與復(fù)性液或盛裝復(fù)性液的儲(chǔ)液器(如儲(chǔ)液瓶)和復(fù)性釜相連通； 用于控制復(fù)性釜中液體流出蛋白超濾膜組件的三通電磁閥門(mén)V2，其中所述三通電磁閥門(mén)V2與超濾模塊和復(fù)性釜連通； 用于控制從超濾模塊流出的液體的三通電磁閥門(mén)V3，其中所述第三電磁閥門(mén)V3與超濾模塊和六通電磁閥門(mén)V8相連通； 用于控制溶液流入層析柱的四元梯度電磁閥門(mén)V4，其中所述四元梯度電磁閥門(mén)V4與復(fù)性液或盛裝復(fù)性液的儲(chǔ)液器和五通電磁閥門(mén)V7相連通； 用于控制從柱復(fù)性模塊流出的液體的三通電磁閥門(mén)V5，其中所述三通電磁閥門(mén)V5與柱復(fù)性模塊和六通電磁閥門(mén)V8相連通。
8.如權(quán)利要求1~4中任一項(xiàng)所述的變性蛋白復(fù)性裝置，其特征在于，所述裝置還具有選自下組的一個(gè)或多個(gè)特征: -所述的泵為數(shù)控泵； -所述裝置還包括:與所述數(shù)控泵、電磁閥門(mén)和在線(xiàn)檢測(cè)器的相連接并用于控制所述數(shù)控泵、電磁閥門(mén)和在線(xiàn)檢測(cè)器的處理器； -所述裝置還包括:與復(fù)性蛋白復(fù)性釜連通的儲(chǔ)液瓶，其中所述儲(chǔ)液瓶用于盛裝復(fù)性液。
9.如權(quán)利要求1所述的變性蛋白復(fù)性裝置的用途，其特征在于，用于使變性蛋白復(fù)性，從而形成有活性的目的蛋白。
10.一種使變性蛋白復(fù)性形成有活性的目的蛋白的方法，其特征在于，包括步驟:用權(quán)利要求I所述的變性蛋白復(fù)性裝置進(jìn)行蛋白復(fù)性，從而形成或獲得復(fù)性后的有活性的目的蛋白。
【文檔編號(hào)】C07K1/14GK103665097SQ201210328445
【公開(kāi)日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2012年9月6日 優(yōu)先權(quán)日:2012年9月6日
【發(fā)明者】馮延葉, 楊忠, 王小寧 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)